Forniamo protocolli scalabili che coprono la progettazione di costrutti, la trasfezione transitoria, l’espressione e la purificazione di varianti proteiche di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule HEK293.
L’huntingtina a lunghezza intera (FL HTT) è una proteina di grandi dimensioni (aa 1-3.144), ubiquitariamente espressa, contenente poliglutammina (polyQ) con una massa di circa 350 kDa. Mentre la funzione cellulare della FL HTT non è completamente compresa, un’espansione mutante del tratto polyQ sopra ~36 ripetizioni è associata alla malattia di Huntington (HD), con la lunghezza del polyQ correlata approssimativamente con l’età di esordio. Per comprendere meglio l’effetto della struttura sulla funzione dell’HTT mutante (mHTT), sono necessarie grandi quantità di proteina. La produzione submilligramma di FL HTT nelle cellule di mammifero è stata ottenuta utilizzando l’espressione stabile della linea cellulare inducibile dalla doxiciclina. Tuttavia, la produzione di proteine da linee cellulari stabili ha limitazioni che possono essere superate con metodi di trasfezione transitoria.
Questo documento presenta un metodo robusto per la produzione di quantità di basso milligrammo di FL HTT e delle sue varianti da plasmidi ottimizzati per codone mediante trasfezione transitoria utilizzando polietilenimina (PEI). Il metodo è scalabile (>10 mg) e produce costantemente 1-2 mg/L di coltura cellulare di FL HTT altamente purificata. Coerentemente con i rapporti precedenti, lo stato della soluzione purificata di FL HTT è risultato altamente dinamico; La proteina ha una propensione a formare dimeri e oligomeri di alto ordine. Una chiave per rallentare la formazione di oligomeri è lavorare rapidamente per isolare le frazioni monomeriche dalle frazioni dimeriche e oligomeriche di alto ordine durante la cromatografia di esclusione dimensionale.
La cromatografia ad esclusione dimensionale con diffusione della luce multiangolo (SEC-MALS) è stata utilizzata per analizzare il dimero e il contenuto oligomerico di ordine superiore dell’HTT purificato. Non è stata osservata alcuna correlazione tra la lunghezza del poliQ HTT FL (Q23, Q48 e Q73) e il contenuto di oligomeri. Il costrutto esone1-cancellato (aa 91-3,144) ha mostrato una propensione all’oligomerizzazione comparabile a FL HTT (aa 1-3,144). I metodi di produzione, purificazione e caratterizzazione mediante indice di rifrazione SEC/MALS (RI), elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE e Blue Native PAGE sono descritti nel presente documento.
La malattia di Huntington (HD) è una rara malattia neurodegenerativa caratterizzata principalmente da movimenti motori instabili e involontari, nonché alterazioni cognitive e psichiatriche, come cambiamenti di personalità e apatia 1,2. La MH è associata ad un’espansione del tratto di ripetizione CAG localizzato nell’esone 1 del gene huntingtina (HTT) a più di 35 ripetizioni, con un numero maggiore di ripetizioni CAG correlate ad un esordio precoce della malattia 3,4. Il prodotto traslazionale di HTT, la proteina huntingtina (HTT), è implicato nella vitalità neuronale e nello sviluppo del cervello 5,6,7,8,9.
HTT è una proteina di impalcatura segnalata per partecipare a una vasta gamma di processi cellulari, trasporto di vescicole, divisione cellulare, ciliogenesi e autofagia10,11. Tuttavia, la patogenesi molecolare della MH non è del tutto chiara, e manca l’identificazione di interattori proteici chiave che mediano l’impatto patologico della mHTT espansa con polyQ. Alcune ricerche suggeriscono un guadagno della funzione tossica da mHTT guidato dalla propensione all’oligomerizzazione della proteina HTT espansa, poiché gli aggregati HTT sono stati identificati nei neuroni e nella glia in pazienti MH e modelli animali della malattia 12,13,14,15,16,17 . Per alimentare lo studio della funzione e della struttura delle varianti FL HTT e mHTT e fornire ai ricercatori standard proteici di alta qualità per lo sviluppo del test, è necessario un apporto robusto e scalabile di proteine ricombinanti omogenee.
A causa delle sue dimensioni (aa 1-3.144, numerazione basata sulla lunghezza del poliQ Q23), dell’instabilità proteolitica e della propensione all’aggregazione, FL HTT si è dimostrato difficile da esprimere e isolare come proteina solubile. In precedenza, la regione dell’esone 1 (aa 2-90) di HTT è stata espressa e purificata su larga scala utilizzando vari tag che possono aumentare la solubilità della proteina in Escherichia coli18,19,20. FL HTT è stato prima espresso e purificato in un sistema di espressione di cellule di insetti utilizzando baculovirus 21,22 e sono state riportate strutture di microscopia elettronica (EM) a bassa risoluzione 30 Å di FL Q23-HTT e Q78-HTT chimicamente reticolato23. Lo studio della struttura HTT è stato ulteriormente avanzato quando la produzione di FL Q17, Q46 e Q128-HTT con modificazioni post-traduzionali native (PTM) è stata raggiunta in cellule umane utilizzando linee cellulari stabili o sistemi di espressione di adenovirus24. Questi studi suggeriscono che, sebbene l’HTT purificato esista principalmente allo stato monomerico, tende anche a formare oligomeri e aggregati di alto ordine.
L’ultracentrifugazione analitica di FL Q128-HTT, con una regione polyQ altamente espansa, ha fornito più frazioni oligomeriche e aggregate rispetto alla proteina con la regione polyQ non espansa24. Utilizzando una linea cellulare stabile, una strategia è stata adattata con successo per stabilizzare FL HTT attraverso la co-espressione con il partner di interazione HAP40. Una struttura crio-EM del complesso FL HTT e HAP40 è stata risolta con una risoluzione media di 4 Å utilizzando il complesso proteico purificato (PDB:6EZ8)25. Questa strategia di co-espressione è stata adattata con successo a un sistema di baculovirus e una serie di varianti HTT di alta qualità con diverse lunghezze di polyQ sono state espresse e purificate da cellule di insetti26. Da allora, altre strutture crio-EM del complesso di HTT con lunghezze variabili di polyQ e HAP40 e strutture ad alta risoluzione sono state risolte e depositate nel Protein Data Base27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O).
Abbiamo ottimizzato un metodo di trasfezione ed espressione in cellule HEK293, utilizzando polietilenimina (PEI), per una rapida espressione transitoria di FL HTT. Come prova di principio, le varianti FL HTT contenenti 23 glutammine (FL Q23-HTT) sono state prima purificate e caratterizzate utilizzando una modifica di un metodo di purificazione descritto in precedenza24. Questo metodo di trasfezione transitoria è conveniente, altamente efficiente e scalabile; può produrre HTT purificato con rese di 1-2 mg/L, paragonabili al metodo della linea cellulare stabile riportato24. Poiché la proteina è prodotta in una linea cellulare umana, l’HTT prodotto ha maggiori probabilità di avere PTM umani nativi quando sottoposto ad analisi proteomica della spettrometria di massa 11,29,30,31. Sono state prodotte quantità di milligrammi delle varianti FL Q48-HTT, FL Q73-HTT ed exon1-deleted (ΔExon1-HTT) di FL HTT, dimostrando che il metodo di espressione transitoria è particolarmente utile nella produzione rapida di varianti alternative di HTT senza dipendere dallo sforzo dispendioso in termini di tempo richiesto per stabilire linee cellulari stabili per la produzione.
Il seguente protocollo esemplifica il metodo standard utilizzato nel laboratorio di questi autori per la coltura cellulare, la trasfezione, la purificazione delle proteine e la caratterizzazione proteica postpurificazione per produrre FL Q23-HTT da una coltura cellulare da 2 L. Il protocollo può essere scalato fino a colture più grandi o adattato per purificare altre varianti HTT. Fino a 10 colture cellulari L di FL HTT e varie mutazioni del sito o del troncamento di omologhi HTT e HTT sono state eseguite con successo in laboratorio utilizzando lo stesso protocollo. FL HTT purificato contiene un’alta percentuale di monomeri insieme a dimeri e oligomeri di ordine superiore. Lo stesso profilo aggregato è osservato tra le varianti prodotte (Q23, Q48, Q73 e Exon1 cancellato). Poiché l’aggregazione può verificarsi quando non viene presa la dovuta attenzione, è stato condotto uno studio di formulazione e stabilità gelo-scongelamento per identificare le migliori condizioni per la gestione delle proteine. Vengono inoltre descritti metodi quali Blue Native PAGE e SEC/MALS-RI per analizzare il contenuto di oligomeri HTT come parte del processo di controllo qualità. A beneficio della comunità di ricerca sulla MH, i plasmidi e le proteine HTT descritti in questo studio sono anche depositati nel MH Community Repository presso il Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI).
Descriviamo qui un metodo di trasfezione, espressione e purificazione transitoria per generare più costrutti proteici FL HTT con purezza e omogeneità adeguate per l’uso come standard per lo sviluppo di saggi immunologici e MS, controlli per l’analisi western blot e per studi struttura-funzione. Questo metodo di espressione transitoria è scalabile e versatile e consente all’utente di generare quantità di basso milligrammo di varianti FL HTT in modo più efficiente rispetto all’utilizzo di linee cellulari stabili o metodi basati su virus descritti in precedenza21,22,23,24. Di routine, 2-5 mg di FL HTT altamente purificato possono essere generati da una produzione di proteine su scala 2 L in meno di una settimana utilizzando il metodo di espressione transitoria una volta costruito il plasmide, con una resa tipica di 1-2,5 mg di FL HTT per litro di coltura cellulare.
Il metodo di espressione transitoria qui descritto supera molti ostacoli nell’espressione stabile delle linee cellulari, come il lungo tempo necessario per stabilire linee cellulari e le difficoltà nello stoccaggio e nel mantenimento di linee cellulari stabili. Il PEI è anche relativamente economico rispetto ad altri reagenti di trasfezione sul mercato, rendendo economicamente sostenibile la trasfezione su larga scala. Ci sono anche limitazioni nel protocollo: l’efficienza della trasfezione dipende in gran parte dalla qualità dei plasmidi, dalla crescita ottimale delle cellule e dal modo in cui il PEI viene conservato e preparato. Gli operatori devono prestare particolare attenzione ed eseguire controlli di qualità in questi passaggi critici per evitare un drastico calo delle rese proteiche. Anche la resina Anti-FLAG utilizzata nel protocollo è relativamente costosa e mostra una ridotta cattura di FL HTT dopo diverse purificazioni e rigenerazioni. Alcuni ricercatori potrebbero trovare più pratico passare a un tag diverso per consentire una rigenerazione più robusta della resina di affinità.
Sono state testate varie linee cellulari e condizioni di espressione per ottimizzare i livelli di espressione di FL HTT. Le cellule HEK293 sono state scelte per l’espressione di FL HTT a causa dell’elevata espressione delle proteine e della facilità di manipolazione in un formato di coltura in sospensione, rendendo il metodo adatto per l’espressione su larga scala in agitatori o bioreattori. Un livello di espressione proteica FL HTT più elevato può essere raggiunto a temperature di coltura più basse come 32 °C piuttosto che utilizzare la temperatura abituale di 37 °C. È possibile che la temperatura più bassa possa rallentare la sintesi proteica e promuovere il corretto ripiegamento di FL HTT40. Tuttavia, questo fenomeno non è specifico per FL HTT o le linee cellulari testate. La ridotta temperatura post-trasfezione è stata ampiamente utilizzata nell’espressione proteica farmaceutica nelle cellule CHO. Sebbene il meccanismo non sia completamente compreso, si pensa che le basse temperature arrestino il ciclo cellulare nella fase G1 e deviino l’energia cellulare verso la produzione di proteine41.
HTT a lunghezza intera purificato da cellule di mammifero co-eluisce con lo chaperone Hsp7024 e le fasi di lavaggio Mg-ATP possono rimuovere la proteina Hsp70. È interessante notare che Hsp70 co-eluito non è osservato in FL HTT purificato da un sistema di espressione cellulare di insetti21,22,23. Ciò può riflettere una differenza nei PTM di FL HTT o nelle risposte delle proteine da shock termico alla sovraespressione di FL HTT nelle cellule di mammifero e di insetti. Una volta che la proteina ricombinante è stata spogliata di Hsp70, sono necessari detergenti non ionici come CHAPS o DDM per stabilizzare la forma monomerica di FL HTT.
Gli stati di oligomerizzazione delle varianti FL HTT sono stati analizzati utilizzando Blue Native PAGE e SEC-MALS. Una piccola frazione di HTT dimerico e oligomerico di ordine superiore era presente quando analizzata da Blue Native PAGE o SEC-MALS. Da notare che gli oligomeri di ordine superiore formati da FL HTT non sembrano essere correlati con la lunghezza del polyQ, e anche il mutante di delezione Exon1 mostra un rapporto oligomero-dimero-monomero simile. Le variazioni effettive nel contenuto di oligomeri tra questi costrutti sono probabilmente dovute a piccole differenze nella produzione e nella gestione di ciascun lotto. In contrasto con gli aggregati e le fibrille formati da HTT Exon140,41, gli oligomeri di ordine superiore di FL HTT sono rimasti solubili e hanno potuto essere analizzati da SEC e Native PAGE.
La FL HTT monomerica purificata è solo relativamente stabile. La conservazione prolungata a 4 °C, brevi incubazioni a temperatura ambiente o concentrazioni > 1 mg/ml convertiranno tutti la FL HTT monomerica in forme dimeriche e oligomeriche di ordine superiore, anche se non vi è alcuna precipitazione visibile osservata in tali condizioni. FL HTT monomerico purificato mantenuto a ≤1 mg/mL è rimasto relativamente stabile a -80 °C nel tampone di stoccaggio (50 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% v/v glicerolo, 0,5% p/v CHAPS e 5 mM DTT) come descritto in precedenza24. Fino a 6 cicli di congelamento-scongelamento di FL HTT preparati e conservati in questo modo non hanno causato precipitazioni visibili della proteina, sebbene un leggero spostamento verso uno stato oligomerico superiore sia stato osservato da SEC-MALS (Figura supplementare S2). I campioni sono stati analizzati anche da SDS PAGE dopo ripetuti cicli di congelamento-disgelo. Non sono stati osservati precipitati visibili; nessun aggregato o prodotto di degradazione aggiuntivo è stato visto da SDS-PAGE (Figura supplementare S3). La stabilità a lungo termine della FL HTT purificata è ancora oggetto di studio. In assenza di dati conclusivi a lungo termine, si consiglia di conservare FL HTT purificato a -80 °C per non più di 6 mesi.
Le varianti della proteina FL HTT ricombinante di alta qualità e i metodi per produrle sono molto richiesti dalla comunità di ricerca sulla MH. Queste proteine sono in uso come test immunologici e standard analitici per la SM, in studi strutturali e per lo sviluppo di nuovi saggi specifici per FL HTT. I metodi di espressione transitoria su larga scala qui descritti hanno costantemente prodotto quantità di milligrammi di varianti FL HTT con purezza del >95%, fornendo strumenti essenziali per gli studi HTT. La produzione di decine di milligrammi di varianti altamente purificate di FL HTT polyQ e di altri mutanti a supporto della ricerca sulla MH è diventata routine.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, The State University of New York a Buffalo, per aver eseguito l’analisi MS di HTT. Questo lavoro è stato uno sforzo collaborativo con la Fondazione CHDI. Ringraziamo in particolare Elizabeth M. Doherty; Ignacio Munoz-Sanjuan; Douglas Macdonald, Fondazione CHDI; e Rory Curtis, Curia, per il loro prezioso contributo durante la preparazione di questo manoscritto. Siamo anche grati a Michele Luche, Mithra Mahmoudi e Stephanie Fox per il loro sostegno a questo sforzo di ricerca.
100 kDa concentrator-Amicon | Millipore | UFC910096 | Protocol Section Number-6.2.4 |
20x blue native PAGE running buffer | Invitrogen | BN2001 | Protocol Section Number-8.1 |
20x TBS | Thermo Fisher | PI28358 | Protocol Section Number-5.1 |
4x blue native PAGE sample buffer | Invitrogen | BN2003 | Protocol Section Number-8.3 |
4x LDS loading buffer | Invitrogen | NP0007 | Protocol Section Number-5.3 |
5 L Erlenmeyer flasks | Corning | 431685 | Protocol Section Number-4.2 |
Agarose gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Protocol Section Number-2.2 |
Anti-clumping agent | Thermo Fisher | 0010057AE | Protocol Section Number-4.8 |
anti-FLAG M2 affinity gel | Sigma | A2220 | Protocol Section Number-6.1.1 |
anti-FLAG M2 | Sigma | F3165 | Protocol Section Number-5.7 |
Anti foam-Excell anti foam | Sigma | 59920C-1B | Protocol Section Number-4.8 |
ATP | Sigma | A6419 | Protocol Section Number-6.1.4.4 |
BEH 450 SEC | Waters | 186006851 | 2.5 µm x 4.6 mm x 150 mm Protocol Section Number-7.3 |
blue native PAGE 5% G-250 sample additive | Invitrogen | BN2004 | Protocol Section Number-8.3 |
carbenicillin | Thermo Fisher | 10177012 | Protocol Section Number-2.5 |
centrifuge – Sorvall Lynx 6000 | Thermo Fisher | 75006590 | Protocol Section Number-6.1.3 |
Cell Counter – ViCELL | BECKMAN COULTER | Protocol Section Number-4.3 | |
CHAPS | Anatrace | C316S | Protocol Section Number-6.1.4.6 |
Competent E. coli cells-TOP10 | Invitrogen | C404010 | Protocol Section Number-2.4 |
digitonin | Sigma | D141 | Protocol Section Number-5.1 |
differential refractive index detector | Wyatt | Protocol Section Number-7.1 | |
DYKDDDDK peptide | Genscript | Peptide synthesis service Protocol Section Number-6.1.4.6 |
|
EDTA | Sigma | EDS | Protocol Section Number-5.1 |
EndoFree Plasmid Giga Kit | Qiagen | 12391 | Protocol Section Number-3.3 |
Endotoxin free water | Cytiva | SH30529.03 | Protocol Section Number-4.1 |
endotoxin quantification kit-CRL Endosafe Nexgen-PTS detection system | Charles River | PTS150K | Protocol Section Number-3.4 |
fixed angle rotor A23-6×100 rotor | Thermo Fisher | 75003006 | Protocol Section Number-6.1.3 |
FPLC software- Unicorn 6.2 | Cytiva | Protocol Section Number-6.1.4 | |
Gene synthesis | Genscript | Gene synthesis service Protocol Section Number-1.2 |
|
Glycerol | Honeywell | 60-048-023 | Protocol Section Number-5.6 |
Growth Medium-Expi293 expression medium | Thermo Fisher | A1435102 | Protocol Section Number-4.2 |
HEK293 cells | Thermo Fisher | R79007 | Protocol Section Number-4 |
high shear homogenizer-Microfluidizer | MicroFluidics | LM10 | Protocol Section Number-6.1.3 |
HPLC – 1260 infinity II Bio-Insert HPLC | Agilent | Protocol Section Number-7.1 | |
Image Studio | LiCor | Image analysis software Protocol Section Number-5.1 |
|
MAB2166 | Sigma | MAB2166 | Protocol Section Number-5.7 |
MAB2168 | EMD | MAB2168 | Protocol Section Number-5.7 |
MAB3E10 | Santa Cruz | SC-47757 | Protocol Section Number-5.7 |
MAB4E10 | Santa Cruz | SC-7757 | Protocol Section Number-5.7 |
MAB5490 | Sigma | MAB5490 | Protocol Section Number-5.7 |
MAB5492 | Sigma | MAB5492 | Protocol Section Number-5.7 |
MAB8A4 | Santa Cruz | SC-47759 | Protocol Section Number-5.7 |
multi-angle light scattering detector | Wyatt | Protocol Section Number-7.1 | |
NativeMark Unstained Protein Standard | Invitrogen | LC0725 | Protocol Section Number-8.4 |
NaCl | Sigma | S9888 | Protocol Section Number-5.6 |
NheI | New England Biolab | R0131S | Hi-Fi version available Protocol Section Number-2.2 |
NuPAGE 3–8% Tris acetate gels | Thermo Fisher | EA0375PK2 | Protocol Section Number-5.4 |
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running buffer | Invitrogen | LA0041 | Protocol Section Number-5.4 |
PEI 25K | Polysciences | 23966-1 | Protocol Section Number-4.1 |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | Protocol Section Number-4.2 |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cytiva | SH30256.02 | Protocol Section Number-4.5 |
plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | Protocol Section Number-2.6 |
PmeI | New England Biolab | R0560S | Protocol Section Number-2.2 |
precast Bis-tris gel- 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris Gel | Invitrogen | BN1003BOX | Protocol Section Number-8.4 |
protease inhibitor cocktail | GoldBio | GB-331-1 | Protocol Section Number-5.1 |
SEC-MALS analysis software – Astra 7 | Wyatt Technology | Protocol Section Number-7.6 | |
secondary antibody -IRdye 800 CW goat anti-mouse IgG | LiCor | 926-32210 | Protocol Section Number-5.9 |
Superose 6 pg XK 16/70 | Cytiva | 90100042 | Protocol Section Number-6.2 |
Tris base | Fisher | BP152 | Protocol Section Number-5.6 |
Tween-20 | Thermo Fisher | AAJ20605AP | Protocol Section Number-6.1.1 |
UV spectrometer – Nanodrop 8000 | Thermo Fisher | ND-8000-GL | Protocol Section Number-2.2 |
XK26/100 | Cytiva | 28988951 | Protocol Section Number-6.1.1 |