Kültürlü Drosophila Beyin Eksplantlarında Nöral Kök Hücre Reaktivasyonu
Summary
Kültürlü Drosophila beyin eksplantlarında sessiz nöral kök hücreleri yeniden aktive etmek için bir yöntem oluşturulmuştur. Bu yöntem kullanılarak, nöral kök hücre sessizliğinin, giriş ve çıkışın düzenlenmesinde sistemik sinyallerin rolü doku-intrinsik sinyallerden ayrılabilir.
Abstract
Nöral kök hücreler (NSC’ler) çoğalma, farklılaşma, apoptoza maruz kalma ve hatta sessizliğe girip çıkma yeteneğine sahiptir. Bu süreçlerin çoğu, NSC içsel genetik programları ile NSC dışsal faktörleri, lokal ve sistemik arasındaki karmaşık etkileşim ile kontrol edilir. Genetik model organizmada, Drosophila melanogaster, nöroblastlar (NB’ler) olarak bilinen NSC’ler, embriyonik larva geçişi sırasında sessizlikten proliferasyona geçer. Bu süre zarfında larvalar yumurta kabuklarından çıkar ve diyet besinleri arayarak emeklemeye başlar. Hayvan beslenmesine yanıt olarak, lipit depolama kapasitesine sahip bir endokrin organ olan yağ gövdesi, dolaşımdaki hemolenfin içine sistemik olarak salınan bir sinyal üretir. Yağ gövdesinden türetilmiş sinyale (FBDS) yanıt olarak, Drosophila insülin benzeri peptitler (Dilps) beyin nörosekretuar nöronlarından ve glia’dan üretilir ve salınır, bu da NB’lerde PI3-kinaz büyüme sinyalinin aşağı akış aktivasyonuna ve glial ve trakeal nişlerine yol açar. Bu, NB’lerin sessizlikten çoğalmaya nasıl geçtiğine dair mevcut model olmasına rağmen, FBDS dışsal ipucunun doğası belirsizliğini korumaktadır. NB dışsal sistemik ipuçlarının sessizlikten çıkışı nasıl düzenlediğini daha iyi anlamak için, hayvan beslemeden önce in vitro erken larva beyinlerini kültürlemek için bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemle kültür ortamına eksojen faktörler sağlanabilir ve NB’den sessizlik tahlilinden çıkış yapılabilir. Eksojen insülinin, NB’leri tüm beyin eksplantlarında sessizlikten yeniden aktive etmek için yeterli olduğunu bulduk. Bu yöntem büyük ölçekli ekranlar için çok uygun olduğundan, NB sessizliğini ve çoğalma kararlarını düzenleyen ek dışsal ipuçlarını tanımlamayı amaçlıyoruz. NSC proliferasyon kararlarını düzenleyen genler ve yollar evrimsel olarak korunduğundan, bu tahlilden elde edilen sonuçlar klinikte rejeneratif tedavilerin iyileştirilmesi konusunda fikir verebilir.
Introduction
Kök hücreler, rejeneratif tıpta kullanım potansiyelleri nedeniyle büyük ilgi görmektedir 1,2. Birçok hayvan, özellikle uzun ömürlü olanlar, yetişkin dokularında kök hücreleri korur. Bu yerleşik kök hücreler doku homeostazını korumak için işlev görür ve fiziksel yaralanma veya hastalık 3,4 sonrası onarım için kullanılır. Yetişkin hayvanlardaki kök hücrelerin çoğu, hücre döngüsü durması ve büyüme sinyalinin inaktivasyonu ile karakterize nispeten uykuda olan bir durum olan sessizdir5. Dışsal ipuçlarına yanıt olarak, kök hücreler sessizlikten çıkar, hücre döngüsüne girer ve doku tiplerine özgü yavru soy üretmeye başlar. Örneğin, etkili bir bağışıklık tepkisi oluşturmak için, antijen sunan hücreler, sessiz naif T hücrelerini hücre döngüsüne girmeye ve klonalolarak 6’yı genişletmeye teşvik eder. İskelet kası hasarına yanıt olarak, kas uydusu kök hücreleri hücre döngüsüne girer ve hasarlı miyofibrillerin yerini almak için kızı miyoblastlar üretir 5,7. Sessiz kök hücrelerin dışsal sinyallere cevap verdiği açık olsa da, çoğu durumda, dışsal ipucunun doğası ve ipucu kaynaklı kök hücre aktivasyonunun mekanizması belirsizliğini korumaktadır. Sessiz kök hücrelerin dışsal ipuçlarına nasıl tepki verdiğini ve hücre döngüsüne nasıl girdiğini daha iyi anlamak, klinikte daha iyi kök hücre tedavilerinin geliştirilmesine yardımcı olacak ve bilimsel bilgiyi artıracaktır.
Onlarca yıldır, model organizmalar, gelişim sırasında ve yetişkinlikte kök hücre proliferasyonunu düzenleyen genleri ve hücre sinyal yollarını ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Drosophila’da, nöroblastlar (NB’ler) olarak bilinen nöral kök hücreler (NSC’ler), sonuçta bütünleşen tüm nöronları ve gliaları üretmek için gelişim boyunca bölünür ve beyin fonksiyonu için gerekli nöral devreyi oluşturur 8,9. Diğer kök hücreler gibi, NB’ler de asimetrik olarak bölünerek kendini yeniler ve bazı durumlarda kök hücre havuzunu genişletmek için simetrik olarak bölünür. NB’ler embriyogenez sırasında belirtilir ve çoğu anne besin depolarının azalmasıyla çakışan sonlara doğru sessizliğe girer (Şekil 1). Embriyogenez tamamlandıktan sonra larvalar yumurtadan çıkar ve beslenmeye başlar. Hayvan beslemeye yanıt olarak, NB’ler sessizlikten yeniden aktive olur ve hücre bölünmelerinisürdürür 10,11,12,13,14,15,16. Drosophila CNS nispeten basit olduğundan ve NB’ler belirli zamanlarda sessizliğe girip çıktıklarından, sessizlik, giriş ve çıkış düzenlemelerini araştırmak için Drosophila’yı kullanmak ideal olduğunu kanıtlar.
Şekil 1: CB NB’lerin (merkezi beyin nöroblastları, kırmızı) ve MB NB’lerin (mantar vücut nöroblastları, mavi) gelişimsel zaman içinde göreceli proliferasyonu. Embriyogenezin sonunda, çoğu NB (kırmızı çizgi) proliferasyonu durdurur ve sessizliğe girer. Sessizlik, yumurtadan çıkmış larvalar ilk tam öğünlerini tüketene kadar devam eder. Bu metodoloji için odak noktası zaman noktaları kırmızı dairelerle gösterilir (1, sessizlik ve 2, yeniden etkinleştirme). MB NB’ler (mavi), gelişim boyunca sürekli olarak bölünen merkezi beyin NB’lerinin bir alt kümesidir (beyin yarımküresi başına 4). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Hayvan beslenmesine yanıt olarak, PI3-kinaz ve TOR büyüme sinyal yolları NB’lerde ve glial ve trakeal nişlerinde aktif hale gelir10,11,15,16. Diyet besinleri geri çekildiğinde veya PI3-kinaz seviyeleri azaldığında, NB’ler yeniden aktive edilemez ve glia ve trakea büyümesi de azalır10,11,15,16. Mevcut model, NB reaktivasyonunun, hayvan beslenmesine yanıt olarak sistemik bir sinyal serbest bırakan yağ gövdesi tarafından larva büyümesine bağlandığını öne sürmektedir12,17,18. Belirsiz kalan bu sinyal, muhtemelen beyinde Drosophila insülin benzeri peptidin (Dilps) ekspresyonunu ve salınımını teşvik eder, bu da NB’lerde PI3-kinazın aşağı akış aktivasyonuna ve glial ve trakeal nişlerine yol açar. Sistemik ipucu (lar) ın doğasını daha iyi anlamak için, kültürlü beyin eksplantlarında sessiz NB’leri yeniden etkinleştirmek için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntemle, NB’lerin reaktivasyonu, tüm hayvan sistemik ipuçlarının yokluğunda test edilebilir. Ekzojen faktörler kültür medyasına yeniden sağlanabilir ve NB reaktivasyonu, timidin analoğu EdU’nun dahil edilmesine dayanarak test edilebilir. Bu yöntemi kullanarak, eksojen insülinin beyin eksplantlarında sessiz NB’leri yeniden aktive etmek için yeterli olduğunu belirledik. Gelecekteki çalışmalar, geri eklendiğinde, beyin eksplantlarında NB sessizliğini olumlu veya olumsuz olarak düzenleyen ek faktörleri tanımlamayı amaçlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan kültür beyin eksplantları yöntemi çoğu laboratuvar ortamında gerçekleştirilebilir. Gerekli araçların yanı sıra prosedür ve veri toplama basit ve anlaşılırdır. Bu yöntemle, hücre sinyal kaskadları ve NB reaktivasyonunu ve proliferasyonunu düzenleyen dışsal faktörlerle ilgili olanlar da dahil olmak üzere çeşitli hipotezler test edilebilir. Burada, vahşi tip OregonR hayvanlarını kullanarak, eksojen insülinin, NB’leri diğer hayvana özgü sistemik ipuçlarından bağımsız…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSAMP Bridges to Doctorate programını finansman (CNK) ve NIH / NIGMS’yi (R01-GM120421 ve R35-GM141886) kabul ediyoruz. Şekil 1 için Dr. Conor Sipe’ye minnettarız. Ayrıca tüm Siegrist laboratuvar üyelerine sürekli destekleri ve mentorlukları için teşekkür ederiz. Özellikle Chhavi Sood ve Gary Teeters’e makaleyi dikkatli bir şekilde okudukları ve yorum yaptıkları için teşekkür ederiz.
Materials
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Gilson | P200 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
References
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Daley, G. Q. Stem cells and the evolving notion of cellular identity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376 (2015).
- Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).
- Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).
- Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).
- Chell, J. M., Brand, A. H. Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence. Cell. 143, 1161-1173 (2010).
- Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila. Nature. 471, 508-512 (2011).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Lin, S., et al. Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain. Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).
- Sipe, C. W., Siegrist, S. E. Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila. Elife. 6, 26343 (2017).
- Speder, P., Brand, A. H. Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila. Elife. 7, 30413 (2018).
- Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche. PLoS Biology. 18, 3000721 (2020).
- Colombani, J., et al. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
- Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila. Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270 (2012).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
- Datta, S. Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS. Brain Research. 818, 77-83 (1999).
