Реактивация нервных стволовых клеток в культивируемых эксплантах мозга дрозофилы
Summary
Установлен метод реактивации покоящихся нервных стволовых клеток в культивируемых эксплантах мозга дрозофилы . Используя этот метод, роль системных сигналов может быть отделена от тканевых внутренних сигналов в регуляции покоя, входа и выхода нервных стволовых клеток.
Abstract
Нервные стволовые клетки (НСК) обладают способностью пролиферировать, дифференцироваться, подвергаться апоптозу и даже входить и выходить из покоя. Многие из этих процессов контролируются сложным взаимодействием между внутренними генетическими программами НСК с внешними факторами НБК, локальными и системными. В генетическом модельном организме , Drosophila melanogaster, NSC, известные как нейробласты (NB), переключаются с покоя на пролиферацию во время эмбрионального перехода к личиночному. За это время личинки выходят из своей яичной скорлупы и начинают ползать, ища диетические питательные вещества. В ответ на кормление животных жировое тело, эндокринный орган с емкостью для хранения липидов, вырабатывает сигнал, который системно высвобождается в циркулирующую гемолимфу. В ответ на сигнал, полученный из жирового тела (FBDS), инсулиноподобные пептиды Drosophila (Dilps) производятся и высвобождаются из нейросекреторных нейронов мозга и глии, что приводит к последующей активации сигналов роста PI3-киназы в NB и их глиальной и трахеальной нише. Хотя это текущая модель того, как НБ переключаются с покоя на распространение, природа внешнего сигнала FBDS остается неуловимой. Чтобы лучше понять, как внешние системные сигналы NB регулируют выход из покоя, был разработан метод культивирования раннего личиночного мозга in vitro перед кормлением животных. С помощью этого метода экзогенные факторы могут подаваться в культуральную среду и выходить NB из анализа покоя. Мы обнаружили, что экзогенного инсулина достаточно для реактивации NB из покоя в эксплантах всего мозга. Поскольку этот метод хорошо подходит для крупномасштабных экранов, мы стремимся выявить дополнительные внешние сигналы, которые регулируют NB по сравнению с решениями о распространении. Поскольку гены и пути, которые регулируют решения о пролиферации НСК, эволюционно сохраняются, результаты этого анализа могут дать представление об улучшении регенеративной терапии в клинике.
Introduction
Стволовые клетки представляют большой интерес из-за их потенциала для использования в регенеративной медицине 1,2. Многие животные, особенно долгоживущие, поддерживают стволовые клетки во взрослых тканях. Эти резидентные стволовые клетки функционируют для поддержания тканевого гомеостаза и используются для восстановления после физической травмы или заболевания 3,4. Большинство стволовых клеток у взрослых животных находятся в состоянии покоя, относительно спящем состоянии, характеризующемся остановкой клеточного цикла и инактивацией сигналов роста5. В ответ на внешние сигналы стволовые клетки выходят из покоя, входят в клеточный цикл и начинают генерировать дочернее потомство, специфичное для их типа ткани. Например, чтобы установить эффективный иммунный ответ, антигенпрезентирующие клетки индуцируют покоящиеся наивные Т-клетки входить в клеточный цикл и клонально расширяться6. В ответ на повреждение скелетных мышц мышечные сателлитные стволовые клетки входят в клеточный цикл и генерируют дочерние миобласты для замены поврежденных миофибрилл 5,7. Хотя ясно, что покоящиеся стволовые клетки реагируют на внешние сигналы, во многих случаях природа внешнего сигнала остается неясной, а также механизм активации стволовых клеток, индуцированных сигналом. Получение лучшего понимания того, как покоящиеся стволовые клетки реагируют на внешние сигналы и входят в клеточный цикл, поможет в разработке лучших методов лечения стволовыми клетками в клинике и увеличит научные знания.
На протяжении десятилетий модельные организмы использовались для выявления генов и клеточных сигнальных путей, которые регулируют пролиферацию стволовых клеток во время развития и во взрослой жизни. У дрозофилы нервные стволовые клетки (НСК), известные как нейробласты (НБ), делятся на протяжении всего развития, чтобы генерировать все нейроны и глию, которые в конечном итоге интегрируются, образуя нейронную цепь, необходимую для функции мозга 8,9. Как и другие стволовые клетки, NB делятся асимметрично для самообновления и, в некоторых случаях, симметрично для расширения пула стволовых клеток. NB определяются во время эмбриогенеза, и большинство из них входят в состояние покоя к концу, что совпадает с уменьшением запасов питательных веществ у матери (рисунок 1). После завершения эмбриогенеза личинки вылупляются и начинают питаться. В ответ на кормление животных NB реактивируются из покоя и возобновляют деление клеток 10,11,12,13,14,15,16. Поскольку дрозофила ЦНС относительно проста и поскольку NB входят и выходят из покоя в определенное время, использование дрозофилы для исследования регуляции покоя, входа и выхода оказывается идеальным.
Рисунок 1: Относительная пролиферация CB NB (центральные нейробласты головного мозга, красный) и MB NBs (нейробласты грибного тела, синий) в течение времени развития. В конце эмбриогенеза большинство НБ (красная линия) прекращают пролиферацию и вступают в состояние покоя. Покой продолжается до тех пор, пока свежевылупившиеся личинки не съедят свой первый полноценный прием пищи. Временные точки фокусировки для этой методологии обозначены красными кругами (1, покоя и 2, реактивация). MB NB (синий) представляют собой подмножество центральных NB мозга, которые постоянно делятся на протяжении всего развития (4 на полушарие мозга). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В ответ на кормление животных сигнальные пути роста PI3-киназы и TOR становятся активными в NB и в их глиальной и трахеальной нише 10,11,15,16. Когда диетические питательные вещества выводятся или когда уровни PI3-киназы снижаются, NB не могут реактивироваться, и рост глии и трахеи также снижаетсяна 10,11,15,16. Текущая модель утверждает, что реактивация NB связана с ростом личинок жировым телом, которое высвобождает системный сигнал в ответ на кормление животных 12,17,18. Этот сигнал, который остается неуловимым, вероятно, способствует экспрессии и высвобождению инсулиноподобного пептида Drosophila (Dilps) в мозге, что приводит к последующей активации PI3-киназы в NB и их глиальной и трахеальной нише. Чтобы лучше понять природу системных сигналов, мы разработали метод реактивации покоящихся NB в культивируемых эксплантах мозга. С помощью этого метода реактивация NB может быть проанализирована при отсутствии системных сигналов всего животного. Экзогенные факторы могут поступать в культуральную среду, а реактивация NB анализируется на основе включения аналога тимидина, EdU. Используя этот метод, мы определили, что экзогенного инсулина достаточно для реактивации покоящихся NB в эксплантах мозга. Будущая работа будет направлена на выявление дополнительных факторов, которые при добавлении обратно либо положительно, либо отрицательно регулируют состояние NB в мозговых эксплантах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь способ культивирования эксплантов мозга может быть выполнен в большинстве лабораторных сред. Необходимые инструменты, а также процедура и сбор данных просты и понятны. С помощью этого метода можно проверить различные гипотезы, в том числе связанные с клеточными сигнал…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы приветствуем программу LSAMP Bridges to Doctorate для финансирования (CNK), а также NIH / NIGMS (R01-GM120421 и R35-GM141886). Мы благодарны доктору Конору Сайпу за рисунок 1. Мы также благодарим всех членов лаборатории Siegrist за их постоянную поддержку и наставничество. Мы особенно благодарим Чхави Суда и Гэри Титерса за внимательное прочтение рукописи и за предоставленные комментарии.
Materials
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Gilson | P200 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
References
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Daley, G. Q. Stem cells and the evolving notion of cellular identity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376 (2015).
- Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).
- Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).
- Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).
- Chell, J. M., Brand, A. H. Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence. Cell. 143, 1161-1173 (2010).
- Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila. Nature. 471, 508-512 (2011).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Lin, S., et al. Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain. Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).
- Sipe, C. W., Siegrist, S. E. Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila. Elife. 6, 26343 (2017).
- Speder, P., Brand, A. H. Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila. Elife. 7, 30413 (2018).
- Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche. PLoS Biology. 18, 3000721 (2020).
- Colombani, J., et al. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
- Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila. Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270 (2012).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
- Datta, S. Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS. Brain Research. 818, 77-83 (1999).
