Reativação de células-tronco neurais em explantes cerebrais de Drosophila cultivadas
Summary
Um método para reativar células-tronco neurais quiescentes em explantas cerebrais de Drosophila cultivadas foi estabelecido. Usando este método, o papel dos sinais sistêmicos pode ser desacoplado a partir de sinais intrínsecos teciduais na regulação da quiescência de células-tronco neurais, entrada e saída.
Abstract
As células-tronco neurais (NSCs) têm a capacidade de proliferar, diferenciar, sofrer apoptose, e até mesmo entrar e sair da quiescência. Muitos desses processos são controlados pela complexa interação entre programas genéticos intrínsecos do NSC com fatores extrínsecos do NSC, locais e sistêmicos. No organismo modelo genético, Drosophila melanogaster, NSCs, conhecidos como neuroblastos (NBs), mudam de quiescência para proliferação durante a transição embrionária para larval. Durante esse tempo, as larvas emergem de suas cascas de ovos e começam a engatinhar, buscando nutrientes dietéticos. Em resposta à alimentação animal, o corpo gordo, um órgão endócrino com capacidade de armazenamento lipídico, produz um sinal, que é liberado sistematicamente no hemoglifo circulante. Em resposta ao sinal derivado do corpo gordo (FBDS), peptídeos semelhantes à insulina drosophila (Dilps) são produzidos e liberados de neurônios neurosecretores cerebrais e glia, levando à ativação a jusante da sinalização de crescimento PI3-quinase em NBs e seu nicho glial e traqueial. Embora este seja o modelo atual de como os NBs mudam da quiescência para a proliferação, a natureza da sugestão extrínseca da FBDS permanece indescritível. Para entender melhor como as pistas sistêmicas extrínsecas da NB regulam a saída da quiescência, um método foi desenvolvido para cultivar cérebros larvais precoces in vitro antes da alimentação animal. Com este método, fatores exógenos podem ser fornecidos aos meios de comunicação cultural e à saída do NB da quiescência avaliada. Descobrimos que insulina exógena é suficiente para reativar NBs de quiescência em explantas cerebrais inteiras. Como este método é adequado para telas de grande escala, pretendemos identificar pistas extrínsecas adicionais que regulam as decisões de quiescência versus proliferação da NB. Como os genes e caminhos que regulam as decisões de proliferação do NSC são evolutivamente conservados, os resultados deste ensaio poderiam fornecer insights sobre a melhoria das terapias regenerativas na clínica.
Introduction
As células-tronco são de grande interesse devido ao seu potencial de uso na medicina regenerativa 1,2. Muitos animais, especialmente aqueles que são de longa duração, mantêm células-tronco dentro de seus tecidos adultos. Essas células-tronco residentes funcionam para manter a homeostase tecidual e são utilizadas para reparo após lesões físicas ou doença 3,4. A maioria das células-tronco em animais adultos são quiescentes, um estado relativamente adormecido caracterizado pela parada do ciclo celular e pela inativação da sinalização de crescimento5. Em resposta a sinais extrínsecos, as células-tronco saem da quiescência, entram no ciclo celular e começam a gerar progêneria filha específica ao seu tipo de tecido. Por exemplo, a fim de montar uma resposta imune eficaz, as células que apresentam antígenos induzem células T ingênuas quiescentes a entrar no ciclo celular e expandir clonalmente6. Em resposta à lesão muscular esquelética, células-tronco de satélite muscular entram no ciclo celular e geram myoblasts da filha para substituir myofibrils danificados 5,7. Embora esteja claro que as células-tronco quiescentes respondem a sinais extrínsecos, em muitos casos, a natureza da sugestão extrínseca permanece incerta, bem como o mecanismo de ativação de células-tronco induzidas por sinais. Obter uma melhor compreensão de como as células-tronco quiescentes respondem a sinais extrínsecos e entram no ciclo celular ajudará no desenvolvimento de melhores terapias com células-tronco na clínica e aumentarão o conhecimento científico.
Há décadas, organismos modelo têm sido usados para descobrir os genes e caminhos de sinalização celular que regulam a proliferação de células-tronco durante o desenvolvimento e na idade adulta. Em Drosophila, as células-tronco neurais (NSCs), conhecidas como neuroblastos (NBs), se dividem ao longo do desenvolvimento para gerar todos os neurônios e glia que finalmente se integram, formando o circuito neural necessário para a função cerebral 8,9. Como outras células-tronco, os NBs se dividem assimetricamente para se auto-renovar e, em alguns casos, simetricamente para expandir o pool de células-tronco. Os NBs são especificados durante a embriogênese e a maioria entra na quiescência no final, coincidentemente com o declínio dos estoques de nutrientes maternos (Figura 1). Depois que a embriogênese estiver completa, as larvas eclodem e comecem a se alimentar. Em resposta à alimentação animal, os NBs reativam a partir da quiescência e retomam as divisões celulares 10,11,12,13,14,15,16. Porque o CNS de Drosophila é relativamente simples e porque os NBs entram e saem da quiescência em horários definidos, usar drosophila para investigar a regulação da quiescência, entrada e saída, prova o ideal.
Figura 1: Proliferação relativa de NBs CB (neuroblastos cerebrais centrais, vermelho) e MB NBs (neuroblastos do corpo de cogumelos, azul) ao longo do tempo de desenvolvimento. No final da embriogênese, a maioria dos NBs (linha vermelha) cessam a proliferação e entram na quiescência. A quiescência continua até que larvas recém-eclodidas consumam sua primeira refeição completa. Os pontos de foco desta metodologia são denotados em círculos vermelhos (1, quiescência e 2, reativação). MB NBs (azul) são um subconjunto de NBs cerebrais centrais que se dividem continuamente durante o desenvolvimento (4 por hemisfério cerebral). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em resposta à alimentação animal, as vias de sinalização de crescimento PI3-quinase e TOR tornam-se ativas em NBs e em seu nicho glial e traqueal 10,11,15,16. Quando os nutrientes dietéticos são retirados ou quando os níveis de PI3-quinase são reduzidos, os NBs não reativam e o crescimento da glia e traqueia também são reduzidosem 10,11,15,16. O modelo atual afirma que a reativação da NB está acoplada ao crescimento larval pelo corpo de gordura, que libera um sinal sistêmico em resposta à alimentação animal 12,17,18. Este sinal, que permanece indescritível, provavelmente promove a expressão e liberação de peptídeo semelhante à insulina Drosophila (Dilps) no cérebro, o que leva à ativação a jusante de PI3-kinase em NBs e seu nicho glial e traqueal. Para entender melhor a natureza das deixas sistêmicas, desenvolvemos um método para reativar NBs quiescentes em explantas cerebrais cultivadas. Com este método, a reativação de NBs pode ser avaliada na ausência de pistas sistêmicas animais inteiras. Fatores exógenos podem ser reabastecidos aos meios de cultura e à reativação de NB conforme a incorporação do analógico de timmidina, EdU. Usando este método, determinamos que a insulina exógena é suficiente para reativar NBs quiescentes em explantas cerebrais. O trabalho futuro será direcionado para identificar fatores adicionais que, quando adicionados de volta, regulam positiva ou negativamente a quiescência de NB em explantas cerebrais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito aqui para cultivar explanações cerebrais pode ser realizado na maioria dos ambientes de laboratório. As ferramentas necessárias, bem como o procedimento e a coleta de dados, são simples e simples. Com este método, pode-se testar uma variedade de hipóteses, incluindo aquelas relacionadas às cascatas de sinalização celular e fatores extrínsecos que regulam a reativação e proliferação do RN. Aqui, usando animais oregonr de tipo selvagem, descobrimos que a insulina exógena era suficiente pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o programa LSAMP Bridges to Doctorate para financiamento (CNK) e o NIH/NIGMS (R01-GM120421 e R35-GM141886). Somos gratos ao Dr. Conor Sipe pela Figura 1. Agradecemos também a todos os membros do laboratório Siegrist por seu apoio contínuo e mentoria. Agradecemos especialmente a Chhavi Sood e Gary Teeters por sua leitura cuidadosa do manuscrito e por fornecer comentários.
Materials
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Gilson | P200 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
References
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