Réactivation des cellules souches neurales dans les explants cérébraux de drosophiles en culture
Summary
Une méthode pour réactiver les cellules souches neurales quiescentes dans les explants cérébraux de drosophiles en culture a été établie. En utilisant cette méthode, le rôle des signaux systémiques peut être découplé des signaux intrinsèques des tissus dans la régulation de la quiescence, de l’entrée et de la sortie des cellules souches neurales.
Abstract
Les cellules souches neurales (CSN) ont la capacité de proliférer, de se différencier, de subir une apoptose et même d’entrer et de sortir de la quiescence. Bon nombre de ces processus sont contrôlés par l’interaction complexe entre les programmes génétiques intrinsèques du NSC et les facteurs extrinsèques du NSC, locaux et systémiques. Dans l’organisme modèle génétique, Drosophila melanogaster, NSC, connus sous le nom de neuroblastes (NB), passent de la quiescence à la prolifération pendant la transition embryonnaire à larvaire. Pendant ce temps, les larves émergent de leurs coquilles d’œufs et commencent à ramper, à la recherche de nutriments alimentaires. En réponse à l’alimentation animale, le corps gras, un organe endocrinien avec une capacité de stockage des lipides, produit un signal, qui est libéré par voie systémique dans l’hémolymphe circulante. En réponse au signal dérivé du corps gras (FBDS), les peptides analogues à l’insuline de la drosophile (Dilps) sont produits et libérés par les neurones neurosécrétoires cérébraux et la glie, conduisant à l’activation en aval de la signalisation de croissance PI3-kinase dans les NB et leur niche gliale et trachéale. Bien qu’il s’agisse du modèle actuel de la façon dont les NB passent de la quiescence à la prolifération, la nature du signal extrinsèque FBDS reste insaisissable. Pour mieux comprendre comment les signaux systémiques extrinsèques du NB régulent la sortie de la quiescence, une méthode a été mise au point pour cultiver les premiers cerveaux larvaires in vitro avant l’alimentation des animaux. Avec cette méthode, des facteurs exogènes peuvent être fournis au milieu de culture et nb sortir de la quiescence testée. Nous avons constaté que l’insuline exogène est suffisante pour réactiver les NB de la quiescence dans les explants du cerveau entier. Parce que cette méthode est bien adaptée aux écrans à grande échelle, nous visons à identifier des indices extrinsèques supplémentaires qui régulent les décisions de quiescence nb par rapport aux décisions de prolifération. Étant donné que les gènes et les voies qui régulent les décisions de prolifération du NSC sont conservés de manière évolutive, les résultats de ce test pourraient fournir un aperçu de l’amélioration des thérapies régénératives en clinique.
Introduction
Les cellules souches sont d’un grand intérêt en raison de leur potentiel d’utilisation en médecine régénérative 1,2. De nombreux animaux, en particulier ceux qui ont une longue durée de vie, maintiennent des cellules souches dans leurs tissus adultes. Ces cellules souches résidentes fonctionnent pour maintenir l’homéostasie tissulaire et sont utilisées pour la réparation après une blessure physique ou une maladie 3,4. La plupart des cellules souches chez les animaux adultes sont quiescentes, un état relativement dormant caractérisé par l’arrêt du cycle cellulaire et l’inactivation de la signalisation de croissance5. En réponse aux signaux extrinsèques, les cellules souches sortent de la quiescence, entrent dans le cycle cellulaire et commencent à générer une progéniture fille spécifique à leur type de tissu. Par exemple, afin de monter une réponse immunitaire efficace, les cellules présentatrices d’antigènes induisent des lymphocytes T naïfs quiescents à entrer dans le cycle cellulaire et à se dilater clonalement6. En réponse aux lésions musculaires squelettiques, les cellules souches satellites musculaires entrent dans le cycle cellulaire et génèrent des myoblastes filles pour remplacer les myofibrilles endommagées 5,7. Bien qu’il soit clair que les cellules souches quiescentes répondent aux signaux extrinsèques, dans de nombreux cas, la nature du signal extrinsèque reste incertaine ainsi que le mécanisme d’activation des cellules souches induite par le signal. Mieux comprendre comment les cellules souches quiescentes réagissent aux signaux extrinsèques et entrent dans le cycle cellulaire aidera au développement de meilleures thérapies à base de cellules souches en clinique et augmentera les connaissances scientifiques.
Depuis des décennies, des organismes modèles sont utilisés pour découvrir les gènes et les voies de signalisation cellulaire qui régulent la prolifération des cellules souches au cours du développement et à l’âge adulte. Chez la drosophile, les cellules souches neurales (CSN), connues sous le nom de neuroblastes (NB), se divisent tout au long du développement pour générer tous les neurones et la glie qui s’intègrent finalement, formant le circuit neuronal nécessaire au fonctionnement du cerveau 8,9. Comme les autres cellules souches, les NB se divisent de manière asymétrique pour s’auto-renouveler et, dans certains cas, symétriquement pour élargir le pool de cellules souches. Les NB sont spécifiés pendant l’embryogenèse et la plupart entrent en quiescence vers la fin, coïncidant avec la diminution des réserves de nutriments maternels (Figure 1). Une fois l’embryogenèse terminée, les larves éclosent et commencent à se nourrir. En réponse à l’alimentation animale, les NB se réactivent de la quiescence et reprennent les divisions cellulaires 10,11,12,13,14,15,16. Parce que le SNC de la drosophile est relativement simple et parce que les NB entrent et sortent de la quiescence à des moments définis, l’utilisation de la drosophile pour étudier la régulation de la quiescence, de l’entrée et de la sortie s’avère idéale.
Figure 1 : Prolifération relative des NB CB (neuroblastes cérébraux centraux, rouges) et des NB MB (neuroblastes du corps champignon, bleu) au cours du développement. À la fin de l’embryogenèse, la plupart des NB (ligne rouge) cessent de proliférer et entrent en quiescence. La quiescence se poursuit jusqu’à ce que les larves fraîchement écloses consomment leur premier repas complet. Les points de focalisation temporels de cette méthodologie sont indiqués en cercles rouges (1, quiescence et 2, réactivation). Les NB MB (bleu) sont un sous-ensemble des NB du cerveau central qui se divisent continuellement tout au long du développement (4 par hémisphère cérébral). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
En réponse à l’alimentation animale, les voies de signalisation de croissance PI3-kinase et TOR deviennent actives dans les NB et dans leur niche gliale et trachéale 10,11,15,16. Lorsque les nutriments alimentaires sont retirés ou lorsque les niveaux de PI3-kinase sont réduits, les NB ne parviennent pas à se réactiver et la croissance de la glie et de la trachée est également réduite 10,11,15,16. Le modèle actuel postule que la réactivation du NB est couplée à la croissance larvaire par le corps gras, qui libère un signal systémique en réponse à l’alimentation animale 12,17,18. Ce signal, qui reste insaisissable, favorise probablement l’expression et la libération du peptide analogue à l’insuline de la drosophile (Dilps) dans le cerveau, ce qui conduit à l’activation en aval de la PI3-kinase dans les NB et leur niche gliale et trachéale. Pour mieux comprendre la nature du ou des signaux systémiques, nous avons mis au point une méthode pour réactiver les NB quiescents dans les explants cérébraux cultivés. Avec cette méthode, la réactivation des NB peut être testée en l’absence d’indices systémiques d’animaux entiers. Les facteurs exogènes peuvent être réapprovisionnés dans le milieu de culture et la réactivation du NB peut être testée en fonction de l’incorporation de l’analogue de la thymidine, l’EdU. En utilisant cette méthode, nous avons déterminé que l’insuline exogène est suffisante pour réactiver les NB quiescents dans les explants cérébraux. Les travaux futurs viseront à identifier d’autres facteurs qui, lorsqu’ils sont rajoutés, régulent positivement ou négativement la quiescence nb dans les explants cérébraux.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici pour cultiver des explants cérébraux peut être réalisée dans la plupart des environnements de laboratoire. Les outils nécessaires, ainsi que la procédure et la collecte de données, sont simples et directs. Avec cette méthode, on peut tester une variété d’hypothèses, y compris celles liées aux cascades de signalisation cellulaire et aux facteurs extrinsèques qui régulent la réactivation et la prolifération du NB. Ici, en utilisant des animaux OregonR de type sauvage, nous avons …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le programme de financement LSAMP Bridges to Doctorate (CNK) ainsi que niH / NIGMS (R01-GM120421 et R35-GM141886). Nous sommes reconnaissants au Dr Conor Sipe pour la figure 1. Nous remercions également tous les membres du laboratoire Siegrist pour leur soutien et leur mentorat continus. Nous remercions tout particulièrement Chhavi Sood et Gary Teeters pour leur lecture attentive du manuscrit et pour leurs commentaires.
Materials
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Gilson | P200 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
References
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Daley, G. Q. Stem cells and the evolving notion of cellular identity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376 (2015).
- Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).
- Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).
- Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).
- Chell, J. M., Brand, A. H. Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence. Cell. 143, 1161-1173 (2010).
- Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila. Nature. 471, 508-512 (2011).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Lin, S., et al. Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain. Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).
- Sipe, C. W., Siegrist, S. E. Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila. Elife. 6, 26343 (2017).
- Speder, P., Brand, A. H. Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila. Elife. 7, 30413 (2018).
- Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche. PLoS Biology. 18, 3000721 (2020).
- Colombani, J., et al. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
- Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila. Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270 (2012).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
- Datta, S. Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS. Brain Research. 818, 77-83 (1999).
