إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في ذبابة الفاكهة المستزرعة في الدماغ
Summary
تم إنشاء طريقة لإعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية الهادئة في خلايا دماغ ذبابة الفاكهة المستزرعة . باستخدام هذه الطريقة ، يمكن فصل دور الإشارات الجهازية عن الإشارات الجوهرية للأنسجة في تنظيم هدوء الخلايا الجذعية العصبية ودخولها وخروجها.
Abstract
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) لديها القدرة على التكاثر والتمايز والخضوع لموت الخلايا المبرمج وحتى الدخول والخروج من السكون. يتم التحكم في العديد من هذه العمليات من خلال التفاعل المعقد بين البرامج الجينية الجوهرية NSC مع العوامل الخارجية NSC ، المحلية والنظامية. في الكائن الحي الوراثي النموذجي ، ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ، NSCs ، والمعروفة باسم الأرومات العصبية (NBs) ، تتحول من السكون إلى الانتشار أثناء الانتقال الجنيني إلى اليرقات. خلال هذا الوقت ، تخرج اليرقات من قشر البيض وتبدأ في الزحف ، بحثا عن العناصر الغذائية الغذائية. استجابة لتغذية الحيوانات ، ينتج الجسم الدهني ، وهو عضو غدد صماء يتمتع بسعة تخزين الدهون ، إشارة يتم إطلاقها بشكل منهجي في الهيموليمف المتداول. استجابة للإشارة المشتقة من الجسم الدهني (FBDS) ، يتم إنتاج الببتيدات الشبيهة بالأنسولين (Dilps) وإطلاقها من الخلايا العصبية الإفرازية العصبية في الدماغ والدبقية ، مما يؤدي إلى تنشيط المصب لإشارات نمو PI3-kinase في NBs ومكانتها الدبقية والقصبة الهوائية. وعلى الرغم من أن هذا هو النموذج الحالي لكيفية تحول الاستراتيجيات وخطط العمل الوطنية من السكون إلى الانتشار، فإن طبيعة الإشارة الخارجية ل FBDS لا تزال بعيدة المنال. لفهم أفضل لكيفية تنظيم الإشارات الجهازية الخارجية NB للخروج من السكون ، تم تطوير طريقة لزراعة أدمغة اليرقات المبكرة في المختبر قبل إطعام الحيوانات. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن توفير العوامل الخارجية لوسائل الإعلام الثقافية وخروج NB من فحص السكون. وجدنا أن الأنسولين الخارجي المنشأ يكفي لإعادة تنشيط NBs من السكون في الدماغ كله explants. نظرا لأن هذه الطريقة مناسبة تماما للشاشات واسعة النطاق ، فإننا نهدف إلى تحديد إشارات خارجية إضافية تنظم هدوء NB مقابل قرارات الانتشار. نظرا لأن الجينات والمسارات التي تنظم قرارات انتشار NSC محفوظة تطوريا ، فإن نتائج هذا الفحص يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتحسين العلاجات التجديدية في العيادة.
Introduction
الخلايا الجذعية ذات أهمية كبيرة بسبب إمكانية استخدامها في الطب التجديدي 1,2. تحتفظ العديد من الحيوانات ، وخاصة تلك التي تعيش طويلا ، بالخلايا الجذعية داخل أنسجتها البالغة. تعمل هذه الخلايا الجذعية المقيمة للحفاظ على توازن الأنسجة وتستخدم للإصلاح بعد الإصابة الجسدية أو المرض 3,4. معظم الخلايا الجذعية في الحيوانات البالغة هادئة ، وهي حالة نائمة نسبيا تتميز باحتجاز دورة الخلية وتعطيل إشارات النمو5. استجابة للإشارات الخارجية ، تخرج الخلايا الجذعية من السكون ، وتدخل دورة الخلية وتبدأ في توليد ذرية ابنة خاصة بنوع أنسجتها. على سبيل المثال ، من أجل تركيب استجابة مناعية فعالة ، تحفز الخلايا التي تقدم المستضدات الخلايا التائية الساذجة الهادئة على الدخول في دورة الخلية وتوسيع6 نسخيا. استجابة لتلف العضلات الهيكلية ، تدخل الخلايا الجذعية الساتلية للعضلات دورة الخلية وتولد الأرومات العضلية الابنة لتحل محل myofibrils التالفة 5,7. في حين أنه من الواضح أن الخلايا الجذعية الهادئة تستجيب للإشارات الخارجية ، في كثير من الحالات ، لا تزال طبيعة الإشارة الخارجية غير واضحة وكذلك آلية تنشيط الخلايا الجذعية التي يسببها الإشارة. إن اكتساب فهم أفضل لكيفية استجابة الخلايا الجذعية الهادئة للإشارات الخارجية ودخولها دورة الخلية سيساعد في تطوير علاجات أفضل بالخلايا الجذعية في العيادة وزيادة المعرفة العلمية.
لعقود حتى الآن ، تم استخدام الكائنات الحية النموذجية للكشف عن الجينات ومسارات إشارات الخلايا التي تنظم تكاثر الخلايا الجذعية أثناء التطور وفي مرحلة البلوغ. في ذبابة الفاكهة ، تنقسم الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) ، والمعروفة باسم الخلايا العصبية (NBs) ، طوال فترة التطور لتوليد جميع الخلايا العصبية والدبقية التي تتكامل في النهاية ، وتشكل الدائرة العصبية اللازمة لوظائف الدماغ 8,9. مثل الخلايا الجذعية الأخرى ، تنقسم NBs بشكل غير متماثل إلى التجديد الذاتي ، وفي بعض الحالات ، بشكل متماثل لتوسيع مجموعة الخلايا الجذعية. يتم تحديد NBs أثناء التكوين الجنيني ومعظمها يدخل في حالة هدوء نحو النهاية ، بالتزامن مع انخفاض مخازن المغذيات لدى الأمهات (الشكل 1). بعد اكتمال التكوين الجنيني ، تفقس اليرقات وتبدأ في التغذية. استجابة لتغذية الحيوانات ، تعيد NBs تنشيط من السكون وتستأنف انقسامات الخلايا10،11،12،13،14،15،16. نظرا لأن ذبابة الفاكهة CNS بسيطة نسبيا ولأن NBs تدخل وتخرج من السكون في أوقات محددة ، فإن استخدام ذبابة الفاكهة للتحقيق في تنظيم السكون والدخول والخروج ، يثبت أنه مثالي.
الشكل 1: الانتشار النسبي ل CB NBs (الأرومات العصبية الدماغية المركزية ، الحمراء) و MB NBs (الأرومات العصبية لجسم الفطر ، الأزرق) بمرور الوقت التنموي. في نهاية التكوين الجنيني ، تتوقف معظم NBs (الخط الأحمر) عن الانتشار وتدخل في حالة من السكون. يستمر الهدوء حتى تستهلك اليرقات الطازجة أول وجبة كاملة لها. يشار إلى نقاط التركيز الزمنية لهذه المنهجية في دوائر حمراء (1 ، هدوء و 2 ، إعادة التنشيط). MB NBs (أزرق) هي مجموعة فرعية من NBs الدماغ المركزية التي تنقسم باستمرار طوال فترة التطور (4 لكل نصف الكرة المخية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
استجابة لتغذية الحيوانات ، تصبح مسارات إشارات نمو PI3-kinase و TOR نشطة في NBs وفي مكانتها الدبقية والقصبة الهوائية10,11,15,16. عندما يتم سحب العناصر الغذائية الغذائية أو عندما يتم تقليل مستويات PI3-kinase ، تفشل NBs في إعادة تنشيط ونمو الدبقية والقصبة الهوائية يتم أيضا تقليل 10،11،15،16. يفترض النموذج الحالي أن إعادة تنشيط NB مقترنة بنمو اليرقات بواسطة الجسم الدهني ، والذي يطلق إشارة نظامية استجابة لتغذية الحيوانات12،17،18. هذه الإشارة ، التي لا تزال بعيدة المنال ، من المحتمل أن تعزز التعبير عن الببتيد الشبيه بالأنسولين (Dilps) وإطلاقه في الدماغ ، مما يؤدي إلى تنشيط PI3-kinase في نهاية المطاف في NBs ومكانتها الدبقية والقصبة الهوائية. لفهم طبيعة الإشارة (الإشارات) النظامية بشكل أفضل ، طورنا طريقة لإعادة تنشيط NBs الهادئة في الدماغ المستزرع. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن فحص إعادة تنشيط NBs في غياب إشارات نظامية حيوانية كاملة. يمكن إعادة تزويد العوامل الخارجية بوسائل الإعلام الثقافية وإعادة تنشيط NB بناء على دمج نظير الثيميدين ، EdU. باستخدام هذه الطريقة ، قررنا أن الأنسولين الخارجي المنشأ يكفي لإعادة تنشيط NBs الهادئة في الدماغ explants. وسيهدف العمل المستقبلي إلى تحديد العوامل الإضافية التي، عند إضافتها مرة أخرى، إما بشكل إيجابي أو سلبي تنظم سكون NB في عمليات زرع الدماغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تنفيذ الطريقة الموصوفة هنا لزراعة الدماغ في معظم بيئات المختبرات. الأدوات المطلوبة ، وكذلك الإجراءات وجمع البيانات ، بسيطة ومباشرة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمرء اختبار مجموعة متنوعة من الفرضيات ، بما في ذلك تلك المتعلقة بشلالات إشارات الخلايا والعوامل الخارجية التي تنظم إعادة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف ببرنامج LSAMP Bridges to Doctorate للتمويل (CNK) وكذلك NIH / NIGMS (R01-GM120421 و R35-GM141886). ونحن ممتنون للدكتور كونور سيب على الشكل 1. كما نشكر جميع أعضاء مختبر Siegrist على دعمهم المستمر وإرشادهم. ونشكر بشكل خاص تشافي سود وغاري تيترز على قراءتهما المتأنية للمخطوطة وعلى تقديمهما تعليقاتهما.
Materials
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Gilson | P200 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
References
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Daley, G. Q. Stem cells and the evolving notion of cellular identity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376 (2015).
- Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).
- Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).
- Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).
- Chell, J. M., Brand, A. H. Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence. Cell. 143, 1161-1173 (2010).
- Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila. Nature. 471, 508-512 (2011).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Lin, S., et al. Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain. Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).
- Sipe, C. W., Siegrist, S. E. Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila. Elife. 6, 26343 (2017).
- Speder, P., Brand, A. H. Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila. Elife. 7, 30413 (2018).
- Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche. PLoS Biology. 18, 3000721 (2020).
- Colombani, J., et al. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
- Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila. Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270 (2012).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
- Datta, S. Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS. Brain Research. 818, 77-83 (1999).
