استخدام علم البصريات الوراثي لعكس المرونة العصبية وتثبيط البحث عن الكوكايين في الفئران
Summary
تحدد الطرق الموضحة هنا إجراء يستخدم لعكس اللدونة التي يسببها الكوكايين بصريا في دائرة ذات صلة سلوكيا في الفئران. يؤدي التحفيز البصري المستمر منخفض التردد لمشابك المهاد اللوزة إلى الاكتئاب على المدى الطويل (LTD). في الجسم الحي ، أدى LTD المستحث بصريا في الفئران ذات الخبرة في الكوكايين إلى التوهين اللاحق للبحث عن المخدرات بدافع جديلة.
Abstract
يوضح هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لاستخدام أدوات علم البصريات الوراثي لعكس اللدونة التي يسببها الكوكايين في دوائر المهاد اللوزة لتقليل سلوكيات البحث عن الكوكايين اللاحقة في الفئران. في بحثنا ، وجدنا أنه عندما تقوم الفئران بإعطاء الكوكايين عن طريق الوريد مقترنا بإشارة سمعية بصرية ، فإن نقاط الاشتباك العصبي التي تشكلت عند مدخلات من النواة الوراثية الإنسية للمهاد (MGN) على الخلايا العصبية الرئيسية في اللوزة الجانبية (LA) تصبح أقوى مع تعلم ارتباط الكوكايين. افترضنا أن عكس اللدونة التي يسببها الكوكايين في هذه المشابك من شأنه أن يقلل من سلوك البحث عن الكوكايين بدافع الإشارة. من أجل تحقيق هذا النوع من التعديل العصبي في الجسم الحي ، أردنا إحداث اكتئاب طويل الأجل متشابك (LTD) ، مما يقلل من قوة نقاط الاشتباك العصبي MGN-LA. تحقيقا لهذه الغاية ، استخدمنا علم البصريات الوراثي ، والذي يسمح بالتعديل العصبي لدوائر الدماغ باستخدام الضوء. تم التعبير عن opsin oChiEF المثير على محطات MGN قبل المشبكية في لوس أنجلوس عن طريق غرس AAV يحتوي على oChiEF في MGN. ثم تم زرع الألياف الضوئية في لوس أنجلوس وتم نبض ضوء الليزر 473 نانومتر بتردد 1 هرتز لمدة 15 دقيقة للحث على اللدونة التي يسببها الكوكايين LTD وعكسها. ينتج عن هذا التلاعب انخفاض طويل الأمد في قدرة الإشارات المرتبطة بالكوكايين على حث إجراءات البحث عن المخدرات.
Introduction
يعد تعاطي المخدرات مشكلة صحية عامة خطيرة للغاية في الولايات المتحدة وفي جميع أنحاء العالم. على الرغم من عقود من البحث المكثف ، هناك عدد قليل جدا من الخيارات العلاجية الفعالة 1,2. نكسة كبيرة للعلاج هي حقيقة أن تعاطي المخدرات المزمن يولد ذكريات ترابطية طويلة الأجل بين الإشارات البيئية والدواء نفسه. تؤدي إعادة التعرض للإشارات المتعلقة بالمخدرات إلى استجابات فسيولوجية وسلوكية تحفز استمرار تعاطي المخدرات والانتكاس3. تتمثل الإستراتيجية العلاجية الجديدة في سن علاجات قائمة على الذاكرة تهدف إلى التلاعب بالدوائر المشاركة في تنظيم ارتباطات إشارات الأدوية. في الآونة الأخيرة ، لوحظ أن نقاط الاشتباك العصبي في اللوزة الجانبية (LA) ، وتحديدا تلك الناشئة عن النواة التناسلية الإنسية (MGN) للمهاد ، يتم تعزيزها عن طريق الإدارة الذاتية المتكررة المرتبطة بالكوكايين ، وأن هذا التقوية يمكن أن يدعم سلوك البحث عن الكوكايين 4,5. لذلك ، تم اقتراح أنه يمكن تخفيف الإعادة التي يسببها جديلة عن طريق عكس اللدونة في نقاط الاشتباك العصبي MGN-LA.
كانت القدرة على استهداف اللدونة المشبكية بدقة لدائرة دماغية معينة تحديا كبيرا لهذا المجال. حققت الأدوات الدوائية التقليدية بعض النجاح في تقليل سلوكيات الانتكاس ، ولكنها محدودة بسبب عدم القدرة على التلاعب بنقاط الاشتباك العصبي الفردية. ومع ذلك ، فإن التطور الأخير في علم البصريات الوراثي في الجسم الحي قد وفر الأدوات اللازمة للتغلب على هذه القيود والتحكم في المسارات العصبية بدقة زمنية ومكانية6،7،8. من خلال التعبير عن الأوبسينات الحساسة للضوء في دائرة دماغية معينة ، يمكن بعد ذلك استخدام ضوء الليزر لتنشيط الدائرة أو تثبيطها. يمكن استخدام التحفيز البصري المعتمد على التردد لمعالجة اللدونة المشبكية للدائرة على وجه التحديد في يتصرف.
توضح هذه المخطوطة الإجراء المتخذ لمعالجة دائرة MGN-LA ذات الصلة سلوكيا باستخدام علم البصريات الوراثي في الجسم الحي . أولا ، تم التعبير عن opsin oChIEF المثير في MGN وتم زرع الألياف الضوئية بشكل ثنائي في لوس أنجلوس. ثم تم تدريب الحيوانات على إعطاء الكوكايين ذاتيا بطريقة تعتمد على الإشارات ، مما يعزز مسار MGN-LA. بعد ذلك ، تم استخدام التحفيز المستمر منخفض التردد مع ضوء ليزر 473 نانومتر لإنتاج LTD خاص بالدائرة. أدى عكس اللدونة الناجمة عن تعاطي الكوكايين إلى انخفاض طويل الأمد في قدرة الإشارات على إطلاق الإجراءات المرتبطة بسلوك البحث عن المخدرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما هو موضح أعلاه ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة المهمة لتحقيق النتائج التجريبية المناسبة. من المحتمل أن يكون البروتوكول فعالا فقط في الحيوانات التي تحصل على الإدارة الذاتية للكوكايين بشكل صحيح ، وحتى الآن ، تم اختباره فقط باستخدام المعلمات الموضحة أعلاه. من الممكن تعديل جرعة الكوكايي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من منح USPHS K01DA031745 (MMT) و R01DA042029 (MMT) و DA035805 (YHH) و F31DA039646 (MTR) و T32031111 (MTR) ووزارة الصحة في ولاية بنسلفانيا.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
- Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
- Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
- Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
- Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
- Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
- Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
- Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
- Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
- Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
- Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
- McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
- Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).
