Ensayo de extremidades recombinantes de pollo para comprender la morfogénesis, los patrones y los primeros pasos en la diferenciación celular

La extremidad de los vertebrados es un modelo formidable para estudiar la diferenciación celular, la proliferación celular, la muerte celular, la formación de patrones y la morfogénesis ^1,2. Durante el desarrollo, las extremidades emergen como protuberancias de las células derivadas del mesodermo de la placa lateral¹. Las yemas de las extremidades consisten en un núcleo central de células mesodérmicas cubiertas por un ectodermo. De esta estructura temprana, emerge una extremidad completa y bien formada. Después de que surge la yema de la extremidad, se reconocen tres ejes: (1) el eje proximo-distal ([PD] hombro a dedos), (2) el eje dorso-ventral ([DV] desde el dorso de la mano hasta la palma de la mano) y (3) el anterior-posterior ([AP] pulgar a dedo). El eje proximal-distal depende de la cresta ectodérmica apical (AER), ectodermo especializado ubicado en la punta distal de la yema de la extremidad. El REA es necesario para el crecimiento, el mantenimiento de la supervivencia, la proliferación y el estado indiferenciado de las células que reciben señales ^2,3. Por otro lado, la zona de actividad polarizante (ZPA) controla el patrón anteroposterior⁴, mientras que el dorsal y el ectodermo controlan el patrón dorsoventral ^7,8. La integración de patrones tridimensionales implica una diafonía compleja entre estos tres ejes⁵. A pesar de comprender la vía molecular durante el desarrollo de las extremidades, las preguntas abiertas sobre los mecanismos que controlan el patrón y el crecimiento adecuado para formar una extremidad completa permanecen sin respuesta.

Edgar Zwilling desarrolló el sistema de extremidades recombinantes (RL) en 1964 para estudiar las interacciones entre las células mesenquimales de las extremidades y el ectodermo en las extremidades en desarrollo⁶. El sistema RL ensambla el mesodermo de la yema de la extremidad disociada-reagregada en el ectodermo de la extremidad embrionaria para injertarlo en la parte dorsal de un embrión de pollito donante. Las señales proporcionadas por el ectodermo inducen la expresión de genes de diferenciación y genes de patrones de manera espacio-temporal, induciendo así la formación de una estructura similar a una extremidad que puede recapitular los programas celulares que ocurren durante el desarrollo de las extremidades ^7,8,9.

El modelo RL es valioso para comprender las propiedades de los componentes de las extremidades y la interacción entre las células mesodérmicas y ectodérmicas⁶. Un RL se puede definir como una estructura similar a una extremidad creada por el ensamblaje experimental o recombinación de células mesodérmicas de la yema de la extremidad dentro de una cubierta ectodérmica⁶. La morfogénesis de la RL depende de las características de las células mesodérmicas (u otros tipos) que responderán a las señales de patrones ectodérmicos. Una de las ventajas de este sistema experimental es su versatilidad. Esta característica permite la creación de múltiples combinaciones variando la fuente de células mesodérmicas, como células de diferentes etapas de desarrollo, de diferentes posiciones a lo largo de la extremidad, o células enteras (no disociadas) o reagregadas 7,8,9,10. Otro ejemplo es la capacidad de obtener el ectodermo embrionario de especies distintas del pollo, por ejemplo, tortuga¹¹, codorniz o ratón¹².

En este sentido, la técnica RL ayuda a estudiar el desarrollo de las extremidades y las interacciones entre las células mesenquimales y ectodérmicas de las extremidades desde un punto de vista evolutivo. Esta técnica también tiene un gran potencial para analizar la capacidad de diferentes fuentes de células progenitoras para diferenciarse en una estructura similar a una extremidad aprovechando las señales proporcionadas por el ectodermo embrionario 12,13,14. A diferencia de los cultivos in vitro, el RL permite evaluar la diferenciación y el potencial morfogenético de una población celular mediante la interpretación de las señales embrionarias de una extremidad en desarrollo ^9,15.

En este protocolo, se proporciona una guía paso a paso para realizar RL exitosa con células de brotes de extremidades mesodérmicas reagregadas, abriendo así la posibilidad de adaptar este protocolo con diferentes fuentes de células reagregadas o incluso diferentes fuentes de ectodermo.