Анализ куриных рекомбинантных конечностей для понимания морфогенеза, паттернов и ранних этапов дифференцировки клеток
Summary
Рекомбинантные конечности являются мощной экспериментальной моделью, позволяющей изучать процесс дифференцировки клеток и генерации паттернов под влиянием эмбриональных сигналов. Этот протокол представляет собой подробный метод генерации рекомбинантных конечностей с куриными конечностями-мезодермальными клетками, адаптируемыми к другим типам клеток, полученных от разных организмов.
Abstract
Клеточная дифференцировка – это тонко настроенный процесс клеточной приверженности, приводящий к образованию различных специализированных типов клеток во время создания развивающихся тканей и органов. Этот процесс активно поддерживается в зрелом возрасте. Дифференцировка клеток – это непрерывный процесс во время развития и гомеостаза органов. Понимание ранних этапов дифференцировки клеток имеет важное значение для знания других сложных процессов, таких как морфогенез. Таким образом, рекомбинантные куриные конечности являются экспериментальной моделью, позволяющей изучать дифференцировку клеток и генерацию паттернов по сигналам эмбрионального паттерна. Эта экспериментальная модель имитирует среду in vivo ; он собирает реагрегированные клетки в эктодермальную оболочку, полученную из раннего бутона конечности. Позже эктодермы переносятся и имплантируются в рецептор эмбриона цыпленка, чтобы обеспечить его развитие. Этот анализ в основном использовался для оценки клеток мезодермальных почек конечностей; однако он может быть применен к другим стволовым клеткам или клеткам-предшественникам других организмов.
Introduction
Конечность позвоночных является грозной моделью для изучения дифференцировки клеток, пролиферации клеток, гибели клеток, формирования паттернов и морфогенеза 1,2. Во время развития конечности возникают в виде выпуклостей из клеток, полученных из боковой пластинки мезодермы1. Почки конечностей состоят из центрального ядра мезодермальных клеток, покрытых эктодермой. Из этой ранней структуры возникает цельная и хорошо сформированная конечность. После возникновения бутона конечности распознаются три оси: (1) проксимо-дистальная ось ([PD] плечо к пальцам), (2) дорсо-вентральная ось ([DV] от тыльной стороны руки до ладони) и (3) передне-задняя ([AP] большой палец к пальцу). Проксимально-дистальная ось зависит от апикального эктодермального гребня (АЭР), специализированной эктодермы, расположенной на дистальном кончике бутона конечности. AER необходим для роста, поддержания выживаемости, пролиферации и недифференцированного состояния клеток, получающих сигналы 2,3. С другой стороны, зона поляризационной активности (ZPA) контролирует переднезаднюю картину4, в то время как дорсальная и эктодерма контролируют дорсовентральный паттерн 7,8. Интеграция трехмерного паттерна подразумевает сложные перекрестные помехи между этими тремя осями5. Несмотря на понимание молекулярного пути во время развития конечностей, открытые вопросы о механизмах, которые контролируют паттерн и правильный рост для формирования целой конечности, остаются без ответа.
Эдгар Цвиллинг разработал систему рекомбинантных конечностей (RL) в 1964 году для изучения взаимодействия между мезенхимальными клетками конечностей и эктодермой в развивающихся конечностях6. Система RL собирает диссоциированную-реагрегированную мезодерму почки конечности в эктодерму эмбриональной конечности, чтобы пересадить ее в дорсальную часть донорского эмбриона цыпленка. Сигналы, обеспечиваемые эктодермой, индуцируют экспрессию генов дифференцировки и генов паттернов пространственно-временным образом, тем самым вызывая формирование конечностной структуры, которая может повторять клеточные программы, возникающие во время развития конечностей 7,8,9.
Модель RL ценна для понимания свойств компонентов конечностей и взаимодействия между мезодермальными и эктодермальными клетками6. RL можно определить как конечноподобную структуру, созданную экспериментально собирающими или рекомбинирующими мезодермальными клетками почек конечностей внутри эктодермального покрова6. Морфогенез RL зависит от характеристик мезодермальных клеток (или других типов), которые будут реагировать на сигналы эктодермального паттерна. Одним из преимуществ этой экспериментальной системы является ее универсальность. Эта характеристика позволяет создавать множественные комбинации путем изменения источника мезодермальных клеток, таких как клетки с разных стадий развития, из разных положений вдоль конечности, или целые (недиссоциированные) или реагрегированные клетки 7,8,9,10. Другим примером является возможность получения эмбриональной эктодермы от видов, отличных от кур, например, черепахи11, перепела или мыши12.
В этом смысле метод RL помогает изучать развитие конечностей и взаимодействия между мезенхимальными и эктодермальными клетками конечностей с эволюционной точки зрения. Этот метод также имеет большой потенциал для анализа способности различных источников клеток-предшественников дифференцироваться в конечностную структуру, используя сигналы, предоставляемые эмбриональной эктодермой 12,13,14. В отличие от культур in vitro, RL позволяет оценивать дифференцировку и морфогенетический потенциал клеточной популяции путем интерпретации эмбриональных сигналов от развивающейся конечности 9,15.
В этом протоколе приведено пошаговое руководство по выполнению успешной РЛ с реагрегированными клетками мезодермальных почек конечностей, что открывает возможность адаптации этого протокола с различными источниками реагрегированных клеток или даже различными источниками эктодермы.
Protocol
Representative Results
Discussion
В целом, протокол RL можно разделить на пять этапов: (1) инкубация эмбриона, (2) получение мезодермальных клеток конечностей для заполнения эктодерм, (3) получение эктодерм, (4) сборка мезодермальных клеток внутри эктодермальных покровов и (5) трансплантация заполненных эктодерм в эмбрионы х?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Эстефанию Гарай-Пачеко за изображения на рисунке 2 и Марию Валерию Чимал-Монтес де Ока за художественные работы. Эта работа была поддержана Генеральным обществом ассоциаций личной академии (DGAPA)-Национальным автономным университетом Мексики [номера грантов IN211117 и IN213314] и Национальным советом по вопросам науки и техники (CONACyT) [грант No 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia], присужденный JC-M. JC M-L был получателем постдокторской стипендии от Национального совета науки и техники (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M. Establishing the pattern of the vertebrate limb. Development. 147 (17), (2020).
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
