Ensaio de membros recombinantes de frango para entender morfogênese, padronização e primeiros passos na diferenciação celular
Summary
Membros recombinantes são um poderoso modelo experimental que permite estudar o processo de diferenciação celular e a geração de padrões sob a influência de sinais embrionários. Este protocolo apresenta um método detalhado para a geração de membros recombinantes com células mesodérmicas de membros de frango, adaptáveis a outros tipos celulares obtidos de diferentes organismos.
Abstract
A diferenciação celular é o processo afinado de comprometimento celular que leva à formação de diferentes tipos de células especializadas durante o estabelecimento de tecidos e órgãos em desenvolvimento. Esse processo é mantido ativamente na idade adulta. A diferenciação celular é um processo contínuo durante o desenvolvimento e homeostase dos órgãos. Entender os primeiros passos da diferenciação celular é essencial para conhecer outros processos complexos, como a morfogênese. Assim, os membros de frango recombinantes são um modelo experimental que permite o estudo da diferenciação celular e geração de padrões sob sinais de padronização embrionária. Este modelo experimental imita um ambiente in vivo ; ele monta células reaggregadas em uma cobertura ectodérmica obtida a partir de um broto de membro inicial. Posteriormente, os ectodermes são transferidos e implantados em um receptor de embrião de filhotes para permitir seu desenvolvimento. Este ensaio foi usado principalmente para avaliar células mesodérmicas de botões de membros; no entanto, pode ser aplicado a outras células-tronco ou progenitoras de outros organismos.
Introduction
O membro vertebrado é um modelo formidável para estudar diferenciação celular, proliferação celular, morte celular, formação de padrões e morfogênese 1,2. Durante o desenvolvimento, os membros emergem como protuberâncias das células derivadas do mesoderme de placa lateral1. Os botões de membros consistem em um núcleo central de células mesodérmicas cobertas por um ectoderme. A partir desta estrutura inicial, um membro inteiro e bem formado emerge. Após a êxito do membro, três eixos são reconhecidos: (1) o eixo proximo-distal ([PD] ombro a dedos), (2) o eixo dorso-ventral ([DV] da parte de trás da mão para a palma) e (3) o anterior-posterior ([AP] polegar para dedo). O eixo proximal-distal depende da crista ectodérmica apical (AER), ectodermia especializada localizada na ponta distal do broto do membro. O AER é necessário para o crescimento, manutenção de sobrevivência, proliferação e o estado indiferenciado das células que recebem sinais 2,3. Por outro lado, a zona de atividade polarizadora (ZPA) controla a padronização anteroposterior4, enquanto a dorsal e o ectoderme controlam a padronização dorsoventral 7,8. A integração da padronização tridimensional implica um cruzamento complexo entre esses três eixos5. Apesar de entender a via molecular durante o desenvolvimento dos membros, perguntas abertas sobre os mecanismos que controlam a padronização e o crescimento adequado para formar um membro inteiro permanecem sem resposta.
Edgar Zwilling desenvolveu o sistema de membro recombinante (RL) em 1964 para estudar as interações entre as células mesenquimais dos membros e o ectoderme no desenvolvimento dos membros6. O sistema RL monta o mesoderm de broto de membro dissociado-reaggregado no ectoderm do membro embrionário para enxertá-lo na parte dorsal de um embrião de filhote de doador. Os sinais fornecidos pelo ectoderme induzem a expressão de genes de diferenciação e genes padronizadores de forma espátula-temporal, induzindo assim a formação de uma estrutura semelhante a um membro que pode recapitular os programas celulares que ocorrem durante o desenvolvimento dos membros 7,8,9.
O modelo RL é valioso para entender as propriedades dos componentes dos membros e a interação entre células mesodérmicas e ectodérmicas6. Uma RL pode ser definida como uma estrutura semelhante a membros criada pela montagem experimental ou recombinação de células mesodérmicas de botões de membro dentro de uma cobertura ectodérmica6. A morfogênese da RL depende das características das células mesodérmicas (ou outros tipos) que responderão aos sinais de padronização ectodérmica. Uma das vantagens deste sistema experimental é sua versatilidade. Essa característica permite a criação de múltiplas combinações variando a fonte de células mesodérmicas, como células de diferentes estágios de desenvolvimento, de diferentes posições ao longo do membro, ou inteiras (não dissocidas) ou células reaggregadas 7,8,9,10. Outro exemplo é a capacidade de obter o ectoderm embrionário de espécies diferentes do frango, por exemplo, tartaruga11, codorna ou rato12.
Nesse sentido, a técnica de RL ajuda a estudar o desenvolvimento dos membros e as interações entre células mesenquimais e ectodérmicas de membros do ponto de vista evolutivo. Essa técnica também tem grande potencial para analisar a capacidade de diferentes fontes de células progenitoras de se diferenciar em uma estrutura semelhante a membros, aproveitando os sinais fornecidos pelo ectoderme embrionário 12,13,14. Em contraste com as culturas in vitro, a RL permite avaliar a diferenciação e o potencial morfogenético de uma população celular, interpretando sinais embrionários a partir de um membro em desenvolvimento 9,15.
Neste protocolo, é fornecido um guia passo-a-passo para a realização de RL bem-sucedida com células de botões mesodérmicos reaggregados, abrindo assim a possibilidade de adaptar este protocolo com diferentes fontes de células reaggregadas ou mesmo diferentes fontes de ectoderme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em geral, o protocolo RL pode ser dividido em cinco etapas: (1) incubação de embriões, (2) obtenção de células mesodérmicas de membros para preencher os ectodermes, (3) obtenção dos ectodermes, (4) a montagem de células mesodérmicas dentro das capas ectodérmicas e (5) transplantes dos ectoderms preenchidos nos embriões hospedeiros. A maior limitação da técnica RL é o protocolo longo e detalhado, que tem muitos pontos críticos que requerem paciência para executar adequadamente. Para completar com sucess…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Estefania Garay-Pacheco pelas imagens da Figura 2 e de Maria Valeria Chimal-Montes de Oca pela obra de arte. Este trabalho foi apoiado pela Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [números de subvenção IN211117 e IN213314] e Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [concessão número 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] concedida ao JC-M. JC M-L foi o beneficiário de uma bolsa de pós-doutorado do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M. Establishing the pattern of the vertebrate limb. Development. 147 (17), (2020).
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
