Summary

Ensaio de membros recombinantes de frango para entender morfogênese, padronização e primeiros passos na diferenciação celular

Published: January 12, 2022
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Summary

Membros recombinantes são um poderoso modelo experimental que permite estudar o processo de diferenciação celular e a geração de padrões sob a influência de sinais embrionários. Este protocolo apresenta um método detalhado para a geração de membros recombinantes com células mesodérmicas de membros de frango, adaptáveis a outros tipos celulares obtidos de diferentes organismos.

Abstract

A diferenciação celular é o processo afinado de comprometimento celular que leva à formação de diferentes tipos de células especializadas durante o estabelecimento de tecidos e órgãos em desenvolvimento. Esse processo é mantido ativamente na idade adulta. A diferenciação celular é um processo contínuo durante o desenvolvimento e homeostase dos órgãos. Entender os primeiros passos da diferenciação celular é essencial para conhecer outros processos complexos, como a morfogênese. Assim, os membros de frango recombinantes são um modelo experimental que permite o estudo da diferenciação celular e geração de padrões sob sinais de padronização embrionária. Este modelo experimental imita um ambiente in vivo ; ele monta células reaggregadas em uma cobertura ectodérmica obtida a partir de um broto de membro inicial. Posteriormente, os ectodermes são transferidos e implantados em um receptor de embrião de filhotes para permitir seu desenvolvimento. Este ensaio foi usado principalmente para avaliar células mesodérmicas de botões de membros; no entanto, pode ser aplicado a outras células-tronco ou progenitoras de outros organismos.

Introduction

O membro vertebrado é um modelo formidável para estudar diferenciação celular, proliferação celular, morte celular, formação de padrões e morfogênese 1,2. Durante o desenvolvimento, os membros emergem como protuberâncias das células derivadas do mesoderme de placa lateral1. Os botões de membros consistem em um núcleo central de células mesodérmicas cobertas por um ectoderme. A partir desta estrutura inicial, um membro inteiro e bem formado emerge. Após a êxito do membro, três eixos são reconhecidos: (1) o eixo proximo-distal ([PD] ombro a dedos), (2) o eixo dorso-ventral ([DV] da parte de trás da mão para a palma) e (3) o anterior-posterior ([AP] polegar para dedo). O eixo proximal-distal depende da crista ectodérmica apical (AER), ectodermia especializada localizada na ponta distal do broto do membro. O AER é necessário para o crescimento, manutenção de sobrevivência, proliferação e o estado indiferenciado das células que recebem sinais 2,3. Por outro lado, a zona de atividade polarizadora (ZPA) controla a padronização anteroposterior4, enquanto a dorsal e o ectoderme controlam a padronização dorsoventral 7,8. A integração da padronização tridimensional implica um cruzamento complexo entre esses três eixos5. Apesar de entender a via molecular durante o desenvolvimento dos membros, perguntas abertas sobre os mecanismos que controlam a padronização e o crescimento adequado para formar um membro inteiro permanecem sem resposta.

Edgar Zwilling desenvolveu o sistema de membro recombinante (RL) em 1964 para estudar as interações entre as células mesenquimais dos membros e o ectoderme no desenvolvimento dos membros6. O sistema RL monta o mesoderm de broto de membro dissociado-reaggregado no ectoderm do membro embrionário para enxertá-lo na parte dorsal de um embrião de filhote de doador. Os sinais fornecidos pelo ectoderme induzem a expressão de genes de diferenciação e genes padronizadores de forma espátula-temporal, induzindo assim a formação de uma estrutura semelhante a um membro que pode recapitular os programas celulares que ocorrem durante o desenvolvimento dos membros 7,8,9.

O modelo RL é valioso para entender as propriedades dos componentes dos membros e a interação entre células mesodérmicas e ectodérmicas6. Uma RL pode ser definida como uma estrutura semelhante a membros criada pela montagem experimental ou recombinação de células mesodérmicas de botões de membro dentro de uma cobertura ectodérmica6. A morfogênese da RL depende das características das células mesodérmicas (ou outros tipos) que responderão aos sinais de padronização ectodérmica. Uma das vantagens deste sistema experimental é sua versatilidade. Essa característica permite a criação de múltiplas combinações variando a fonte de células mesodérmicas, como células de diferentes estágios de desenvolvimento, de diferentes posições ao longo do membro, ou inteiras (não dissocidas) ou células reaggregadas 7,8,9,10. Outro exemplo é a capacidade de obter o ectoderm embrionário de espécies diferentes do frango, por exemplo, tartaruga11, codorna ou rato12.

Nesse sentido, a técnica de RL ajuda a estudar o desenvolvimento dos membros e as interações entre células mesenquimais e ectodérmicas de membros do ponto de vista evolutivo. Essa técnica também tem grande potencial para analisar a capacidade de diferentes fontes de células progenitoras de se diferenciar em uma estrutura semelhante a membros, aproveitando os sinais fornecidos pelo ectoderme embrionário 12,13,14. Em contraste com as culturas in vitro, a RL permite avaliar a diferenciação e o potencial morfogenético de uma população celular, interpretando sinais embrionários a partir de um membro em desenvolvimento 9,15.

Neste protocolo, é fornecido um guia passo-a-passo para a realização de RL bem-sucedida com células de botões mesodérmicos reaggregados, abrindo assim a possibilidade de adaptar este protocolo com diferentes fontes de células reaggregadas ou mesmo diferentes fontes de ectoderme.

Protocol

Esta pesquisa foi revisada e aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional para o Cuidado e Uso de Animais laboratoriais do Instituto de Investigaciones Biomédicas da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Cidade do México, México). Um fluxograma esquemático das etapas gerais deste protocolo é mostrado na Figura 1A. 1. Incubação de embriões e determinação da viabilidade Incubar ovos de galinha fertilizados a 38 °C…

Representative Results

Reconhecendo um membro recombinante bem executadoApós o enxerto, os embriões manipulados foram devolvidos à incubadora para permitir que a RL se desenvolvesse. O tempo de incubação correlaciona-se com os requisitos do experimento. No entanto, a RL pode ser facilmente distinguida após 12 horas de implantação. Para determinar se a implantação era adequada, a RL foi observada como uma protuberância que estava firmemente presa à parede mesodérmica do embrião doador (Fig…

Discussion

Em geral, o protocolo RL pode ser dividido em cinco etapas: (1) incubação de embriões, (2) obtenção de células mesodérmicas de membros para preencher os ectodermes, (3) obtenção dos ectodermes, (4) a montagem de células mesodérmicas dentro das capas ectodérmicas e (5) transplantes dos ectoderms preenchidos nos embriões hospedeiros. A maior limitação da técnica RL é o protocolo longo e detalhado, que tem muitos pontos críticos que requerem paciência para executar adequadamente. Para completar com sucess…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Estefania Garay-Pacheco pelas imagens da Figura 2 e de Maria Valeria Chimal-Montes de Oca pela obra de arte. Este trabalho foi apoiado pela Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [números de subvenção IN211117 e IN213314] e Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [concessão número 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] concedida ao JC-M. JC M-L foi o beneficiário de uma bolsa de pós-doutorado do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).

Materials

Alcian Blue 8GX Sigma A5268
Angled slit knife Alcon 2.75mm DB
Blunt forceps Fine Science Tools 11052-10
Collagenase type IV Gibco 1704-019
DMEM-HG Sigma D5796
Egg incubator Incumatic de Mexico Incumatic 1000
Fetal Bovine Serum Gibco 16000069
Fine surgical forceps Fine Science Tools 9115-10
Hanks Balanced Salt Solution Sigma H6648
Microcentrifuge Eppendorf 5417R
Micropipet NA NA
Palladium wire GoodFellow 7440 05-3
Petri dish Nest 705001
Pippette crmglobe PF1016
Stereomicroscope Zeiss Stemi DV4
Tape NA NA
Trypsin porcine Merck 9002 07-7
Tungsten needle GoodFellow E74-15096/01

References

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Cite This Article
Marín-Llera, J. C., Fernández-Calderón, M., Chimal-Monroy, J. Chicken Recombinant Limbs Assay to Understand Morphogenesis, Patterning, and Early Steps in Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (179), e63183, doi:10.3791/63183 (2022).

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