形態形成、パターニング、および細胞分化の初期段階を理解するためのニワトリ組換え四肢アッセイ

脊椎動物の四肢は、細胞分化、細胞増殖、細胞死、パターン形成、および形態形成を研究するための手ごわいモデルである^1,2。発生中、四肢は側板中胚葉1に由来する細胞から膨らみとして出現^する。四肢芽は、外胚葉で覆われた中胚葉系細胞の中心核からなる。この初期の構造から、丸ごと整った四肢が出現する。四肢の蕾が生じた後、(1)近位 – 遠位軸([PD]肩から指へ)、(2)背腹側軸([DV]手の甲から手のひらまで)、および(3)前後軸([AP]親指から指へ)の3つの軸が認識される。近位 – 遠位軸は、四肢芽の遠位先端に位置する特殊な外胚葉である頂端外胚葉隆起(AER)に依存する。AERは、伸長、生存維持、増殖、およびシグナル^2,3を受け取る細胞の未分化状態に必要である。一方、偏光活性ゾーン(ZPA)は前後パターニング⁴を制御し、背側および外胚葉は背側腹部パターニング^7、8を制御する。3次元パターニングの統合は、これら3つの軸⁵間の複雑なクロストークを意味する。四肢の発達中の分子経路を理解しているにもかかわらず、四肢全体を形成するためのパターニングと適切な伸長を制御するメカニズムに関する未解決の疑問は未解決のままである。

Edgar Zwilling は 1964 年に組換え四肢 (RL) システムを開発し、発達中の四肢における四肢間葉系細胞と外胚葉との相互作用を研究しました⁶.RLシステムは、解離・再凝集した四肢芽中胚葉を胚性四肢外胚葉に組み立て、ドナーの雛胚の背部に移植する。外胚葉によって提供されるシグナルは、時空間的に分化遺伝子およびパターニング遺伝子の発現を誘導し、したがって、四肢発生中に起こる細胞プログラムを反復することができる四肢様構造の形成を誘導する^7,8,9。

RLモデルは、四肢成分の性質および中胚葉系細胞と外胚葉系細胞との間の相互作用を理解するの^{に有用である6}。RLは、外胚葉^カバー6の内部で四肢芽中胚葉細胞を実験的に組み立てまたは再結合することによって作成された四肢様構造として定義することができる。RLの形態形成は、外胚葉系パターニングシグナルに応答する中胚葉系細胞(または他のタイプ)の特性に依存する。この実験システムの利点の1つは、その汎用性である。この特性は、異なる発生段階からの細胞、四肢に沿った異なる位置からの細胞、または全体(解離していない)または再凝集した細胞7、⁸、⁹、¹⁰などの中胚^葉系細胞の供給源を変えることによって、複数の組み合わせの作成を可能にする。別の例は、ニワトリ以外の種、例えばカメ¹¹、ウズラ、またはマウス¹²から胚性外胚葉を得る能力である。

この意味で、RL技術は、四肢の発達と四肢間葉系細胞と外胚葉系細胞との間の相互作用を進化的観点から研究するのに役立ちます。この技術はまた、胚性外胚葉^12、13、14によって提供されるシグナルを利用して四肢様構造に分化する前駆細胞の異なる供給源の能力を分析するための大きな可能性を秘めている。インビトロ培養とは対照的に、RLは、発達中の四肢からの胚性シグナルを解釈することによって、細胞集団の分化および形態形成能を評価することを可能にする^9,15。

このプロトコルでは、再凝集した中胚葉性四肢芽細胞を用いてRLを成功させるためのステップバイステップガイドが提供され、したがって、このプロトコルを異なる再凝集細胞源または異なる外胚葉源と適合させる可能性を開く。