Test degli arti ricombinanti di pollo per comprendere la morfogenesi, i modelli e i primi passi nella differenziazione cellulare

L’arto vertebrato è un modello formidabile per studiare la differenziazione cellulare, la proliferazione cellulare, la morte cellulare, la formazione di pattern e la morfogenesi ^1,2. Durante lo sviluppo, gli arti emergono come rigonfiamenti dalle cellule derivate dal mesoderma¹ della piastra laterale. Le gemme degli arti sono costituite da un nucleo centrale di cellule mesodermiche coperte da un ectoderma. Da questa struttura iniziale, emerge un arto intero e ben formato. Dopo che il bocciolo dell’arto si presenta, vengono riconosciuti tre assi: (1) l’asse prossima-distale ([PD] spalla alle dita), (2) l’asse dorso-ventrale ([DV] dal dorso della mano al palmo) e (3) l’anteriore-posteriore ([AP] pollice a dito). L’asse prossimale-distale dipende dalla cresta ectodermica apicale (AER), ectoderma specializzato situato sulla punta distale della gemma dell’arto. L’AER è necessario per la crescita, il mantenimento della sopravvivenza, la proliferazione e lo stato indifferenziato delle cellule che ricevono segnali ^2,3. D’altra parte, la zona di attività polarizzante (ZPA) controlla il pattern anteroposteriore⁴, mentre il pattern dorsale ed ectoderma controlla il pattern dorsoventrale ^7,8. L’integrazione della modellazione tridimensionale implica una complessa diafonia tra questi tre assi⁵. Nonostante la comprensione del percorso molecolare durante lo sviluppo degli arti, le domande aperte sui meccanismi che controllano il pattern e la corretta crescita per formare un intero arto rimangono senza risposta.

Edgar Zwilling sviluppò il sistema degli arti ricombinanti (RL) nel 1964 per studiare le interazioni tra le cellule mesenchimali degli arti e l’ectoderma nello sviluppo degli arti⁶. Il sistema RL assembla il mesoderma del germoglio dell’arto dissociato-riaggregato nell’ectoderma dell’arto embrionale per innestarlo nella parte dorsale di un embrione di pulcino donatore. I segnali forniti dall’ectoderma inducono l’espressione di geni di differenziazione e geni patterning in modo spazio-temporale, inducendo così la formazione di una struttura simile a un arto in grado di ricapitolare i programmi cellulari che si verificano durante lo sviluppo degli arti ^7,8,9.

Il modello RL è prezioso per comprendere le proprietà dei componenti degli arti e l’interazione tra cellule mesodermiche ed ectodermiche⁶. Una RL può essere definita come una struttura simile a un arto creata dall’assemblaggio sperimentale o dalla ricombinazione di cellule mesodermiche delle gemme degli arti all’interno di una copertura ectodermica⁶. La morfogenesi della RL dipende dalle caratteristiche delle cellule mesodermiche (o di altri tipi) che risponderanno ai segnali di pattern ectodermico. Uno dei vantaggi di questo sistema sperimentale è la sua versatilità. Questa caratteristica permette la creazione di combinazioni multiple variando la fonte di cellule mesodermiche, come cellule di diversi stadi di sviluppo, da diverse posizioni lungo l’arto, o cellule intere (non dissociate) o riaggregate 7,8,9,10. Un altro esempio è la capacità di ottenere l’ectoderma embrionale da specie diverse dal pollo, ad esempio la tartaruga¹¹, la quaglia o il topo¹².

In questo senso, la tecnica RL aiuta a studiare lo sviluppo degli arti e le interazioni tra cellule mesenchimali ed ectodermiche degli arti da un punto di vista evolutivo. Questa tecnica ha anche un grande potenziale per analizzare la capacità di diverse fonti di cellule progenitrici di differenziarsi in una struttura simile a un arto sfruttando i segnali forniti dall’ectoderma embrionale 12,13,14. A differenza delle colture in vitro, la RL consente di valutare la differenziazione e il potenziale morfogenetico di una popolazione cellulare interpretando i segnali embrionali provenienti da un arto in via di sviluppo ^9,15.

In questo protocollo, viene fornita una guida passo-passo per eseguire RL di successo con cellule di gemme di arti mesodermici riaggregati, aprendo così la possibilità di adattare questo protocollo con diverse fonti di cellule riaggregate o anche diverse fonti di ectoderma.