גפיים רקומביננטיות של עוף בודקות כדי להבין את מורפוגנזה, דפוסים וצעדים מוקדמים בהתמיינות תאים
Summary
גפיים רקומביננטיות הן מודל ניסיוני רב עוצמה המאפשר לחקור את תהליך התמיינות התאים ויצירת דפוסים בהשפעת אותות עובריים. פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת ליצירת גפיים רקומביננטיות עם תאי עוף גפיים-מזודרמליים, הניתנים להתאמה לסוגי תאים אחרים המתקבלים מאורגניזמים שונים.
Abstract
התמיינות תאים היא תהליך מכוונן היטב של מחויבות תאים המוביל להיווצרותם של סוגי תאים מיוחדים שונים במהלך הקמת רקמות ואיברים מתפתחים. תהליך זה נשמר באופן פעיל בבגרותו. התמיינות תאים היא תהליך מתמשך במהלך ההתפתחות וההומאוסטזיס של איברים. הבנת השלבים המוקדמים של התמיינות תאים חיונית כדי לדעת תהליכים מורכבים אחרים כגון מורפוגנזה. לפיכך, גפי עוף רקומביננטיות הן מודל ניסיוני המאפשר לחקור התמיינות תאים ויצירת תבניות תחת אותות דפוס עובריים. מודל ניסיוני זה מחקה סביבת in vivo ; הוא מרכיב תאים צבורים מחדש לתוך כיסוי אקטודרמלי המתקבל מניצן גפיים מוקדם. מאוחר יותר, אקטודרמים מועברים ומושתלים בקולטן עובר אפרוח כדי לאפשר את התפתחותו. בדיקה זו שימשה בעיקר להערכת תאי ניצן גפיים מזודרמליים; עם זאת, ניתן ליישם אותו על תאי גזע או אב אחרים מאורגניזמים אחרים.
Introduction
איבר בעלי החוליות הוא מודל אימתני לחקר התמיינות תאים, התפשטות תאים, מוות של תאים, היווצרות תבניות ומורפוגנזה 1,2. במהלך ההתפתחות, הגפיים מגיחות כבליטות מהתאים שמקורם במזודרם צלחת צידית1. ניצני הגפיים מורכבים מליבה מרכזית של תאים מזודרמליים המכוסים על ידי אקטודרם. מהמבנה המוקדם הזה מגיח איבר שלם ומעוצב היטב. לאחר הופעת ניצן הגפיים, מזהים שלושה צירים: (1) הציר הפרוקסימו-דיסטלי ([PD] כתף לאצבעות), (2) ציר הגב-גחון ([DV] מגב היד לכף היד), ו-(3) האגודל הקדמי-אחורי ([AP] אגודל לאצבע). הציר הפרוקסימלי-דיסטלי תלוי ברכס האקטודרמלי האפי (AER), אקטודרם מיוחד הממוקם בקצה הדיסטלי של ניצן הגפיים. ה-AER נדרש לצמיחה החוצה, לתחזוקת הישרדות, להתרבות ולמצב הלא מובחן של תאים הקולטים אותות 2,3. מצד שני, אזור הפעילות המקטבת (ZPA) שולט בתבנית האנטרופוסטריורית4, בעוד שהגב והאקטודרם שולטים בתבנית הגבית והאקטודרמית 7,8. אינטגרציה של דפוסים תלת-ממדיים מרמזת על הצלבה מורכבת בין שלושת הצירים הללו5. למרות הבנת המסלול המולקולרי במהלך התפתחות הגפיים, שאלות פתוחות על המנגנונים השולטים בדפוסים ובצמיחה נכונה ליצירת גפה שלמה נותרות ללא מענה.
אדגר צווילינג פיתח את מערכת הגפיים הרקומביננטיות (RL) בשנת 1964 כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תאים מזנכימליים של הגפיים לבין האקטודרם בפיתוח גפיים6. מערכת ה-RL מרכיבה את מזודרם ניצני הגפיים המנותק לתוך האקטודרם העוברי של הגפיים כדי להשתיל אותו בחלק הגבי של עובר האפרוח התורם. האותות המסופקים על ידי האקטודרם משרים ביטוי של גנים של התמיינות וגנים דפוסים באופן מרחבי-טמפורלי, ובכך גורמים להיווצרות מבנה דמוי גפיים שיכול לשחזר את תוכניות התאים המתרחשות במהלך התפתחות הגפיים 7,8,9.
מודל RL הוא בעל ערך להבנת התכונות של רכיבי הגפיים והאינטראקציה בין תאים מזודרמליים ואקטודרמליים6. ניתן להגדיר RL כמבנה דמוי גפיים שנוצר על ידי התאים המזודרמליים של ניצני הגפיים המורכבים או רקומבינציה בתוך כיסוי אקטודרמלי6. המורפוגנזה של ה-RL תלויה במאפיינים של התאים המזודרמליים (או סוגים אחרים) שיגיבו לאותות התבנית האקטודרמלית. אחד היתרונות של מערכת ניסיונית זו הוא הרבגוניות שלה. מאפיין זה מאפשר יצירת שילובים מרובים על ידי שינוי המקור של תאים מזודרמליים, כגון תאים משלבי התפתחות שונים, ממיקומים שונים לאורך הגפה, או תאים שלמים (לא מובחנים) או מצטברים מחדש 7,8,9,10. דוגמה נוספת היא היכולת להשיג את האקטודרם העוברי ממינים שאינם עוף, למשל, צב11, שליו או עכבר12.
במובן זה, טכניקת RL מסייעת לחקור את התפתחות הגפיים ואת האינטראקציות בין תאים מזנכימליים ואקטודרמליים של הגפיים מנקודת מבט אבולוציונית. לטכניקה זו יש גם פוטנציאל גדול לניתוח היכולת של מקורות שונים של תאי אב להתמיין למבנה דמוי גפיים על ידי ניצול האותות המסופקים על ידי האקטודרם העוברי 12,13,14. בניגוד לתרביות במבחנה, ה-RL מאפשר להעריך את ההתמיינות והפוטנציאל המורפוגנטי של אוכלוסיית התאים על ידי פירוש אותות עובריים מאיברמתפתח 9,15.
בפרוטוקול זה, מדריך שלב אחר שלב לביצוע RL מוצלח עם תאי ניצן גפיים מזודרמליים מצטברים מחדש מסופק, ובכך פותח את האפשרות של התאמת פרוטוקול זה עם מקורות שונים של תאים מצטברים מחדש או אפילו מקורות אקטודרם שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
באופן כללי, ניתן לחלק את פרוטוקול RL לחמישה שלבים: (1) דגירה של עוברים, (2) השגת תאים מזודרמליים של הגפיים כדי למלא את האקטודרמים, (3) קבלת האקטודרמים, (4) הרכבת תאים מזודרמליים בתוך הכיסויים האקטודרמליים, ו-(5) השתלת האקטודרמים המלאים בעוברים המארחים. המגבלה העיקרית של טכניקת RL היא הפרוטוקול הארו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאסטפניה גאראי-פצ’קו על התמונות באיור 2 ולמריה ולריה צ’ימאל-מונטס דה אוקה על יצירות האמנות. עבודה זו נתמכה על ידי ה-Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [מספרי מענקים IN211117 ו-IN213314] ו-Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [מענק מספר 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] שהוענק ל-JC-M. JC M-L זכה במלגת פוסט-דוקטורט מטעם Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M. Establishing the pattern of the vertebrate limb. Development. 147 (17), (2020).
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
