Chicken Recombinant Limbs Assay, um Morphogenese, Musterung und frühe Schritte in der Zelldifferenzierung zu verstehen

Die Wirbeltierextremität ist ein beeindruckendes Modell zur Untersuchung der Zelldifferenzierung, der Zellproliferation, des Zelltods, der Musterbildung und der Morphogenese ^1,2. Während der Entwicklung treten Gliedmaßen als Ausbuchtungen aus den Zellen aus, die aus dem lateralen Plattenmesoderm¹ stammen. Gliedmaßenknospen bestehen aus einem zentralen Kern mesodermaler Zellen, die von einem Ektoderm bedeckt sind. Aus dieser frühen Struktur entsteht ein ganzes und wohlgeformtes Gliedmaß. Nachdem die Gliedmaßenknospe entstanden ist, werden drei Achsen erkannt: (1) die proximo-distale Achse ([PD] Schulter zu den Fingern), (2) die dorso-ventrale Achse ([DV] vom Handrücken bis zur Handfläche) und (3) die vorder-hintere ([AP] Daumen zu Finger). Die proximale-distale Achse hängt vom apikalen ektodermalen Kamm (AER) ab, einem spezialisierten Ektoderm an der distalen Spitze der Gliedmaßenknospe. Die AER wird für das Auswachsen, die Überlebenserhaltung, die Proliferation und den undifferenzierten Zustand der Zellen, die Signale empfangen, benötigt ^2,3. Auf der anderen Seite steuert die Zone der Polarisationsaktivität (ZPA) die anteroposteriore Strukturierung⁴, während das dorsale und das Ektoderm die dorsoventrale Strukturierung^{steuern 7,8}. Die Integration dreidimensionaler Muster impliziert ein komplexes Übersprechen zwischen diesen drei Achsen⁵. Trotz des Verständnisses des molekularen Weges während der Gliedmaßenentwicklung bleiben offene Fragen über die Mechanismen, die die Musterung und das richtige Auswachsen steuern, um eine ganze Extremität zu bilden, unbeantwortet.

Edgar Zwilling entwickelte 1964 das System der rekombinanten Gliedmaßen (RL), um die Wechselwirkungen zwischen mesenchymalen Zellen der Gliedmaßen und dem Ektoderm bei der Entwicklung von Gliedmaßen^{zu untersuchen 6}. Das RL-System setzt das dissoziiert-reaggregierte Gliedmaßenknospen-Mesoderm in das embryonale Gliedmaßen-Ektoderm zusammen, um es in den dorsalen Teil eines Spender-Küken-Embryos zu transplantieren. Die vom Ektoderm bereitgestellten Signale induzieren die Expression von Differenzierungsgenen und Mustergenen auf räumlich-zeitliche Weise und induzieren so die Bildung einer gliedmaßenartigen Struktur, die die Zellprogramme, die während der Gliedmaßenentwicklung auftreten, rekapitulieren kann ^7,8,9.

Das RL-Modell ist wertvoll für das Verständnis der Eigenschaften von Gliedmaßenkomponenten und der Wechselwirkung zwischen mesodermalen und ektodermalen Zellen⁶. Eine RL kann als eine gliedmaßenartige Struktur definiert werden, die durch die experimentelle Zusammenstellung oder Rekombination von Mesodermalzellen der Gliedmaßenknospen innerhalb einer ektodermalen Hülle^{entsteht 6}. Die Morphogenese des RL hängt von den Eigenschaften der mesodermalen Zellen (oder anderer Typen) ab, die auf die ektodermalen Mustersignale reagieren. Einer der Vorteile dieses experimentellen Systems ist seine Vielseitigkeit. Diese Eigenschaft ermöglicht die Bildung von Mehrfachkombinationen durch Variation der Quelle von mesodermalen Zellen, wie Zellen aus verschiedenen Entwicklungsstadien, aus verschiedenen Positionen entlang der Extremität oder ganzen (undissoziierten) oder reaggregierten Zellen 7,8,9,10. Ein weiteres Beispiel ist die Fähigkeit, das embryonale Ektoderm von anderen Arten als Hühnern zu erhalten, zum Beispiel Schildkröte¹¹, Wachtel oder Maus¹².

In diesem Sinne hilft die RL-Technik, die Entwicklung der Gliedmaßen und die Wechselwirkungen zwischen mesenchymalen und ektodermalen Zellen der Gliedmaßen aus evolutionärer Sicht zu untersuchen. Diese Technik hat auch ein großes Potenzial für die Analyse der Fähigkeit verschiedener Quellen von Vorläuferzellen, sich in eine gliedmaßenartige Struktur zu differenzieren, indem die Signale des embryonalen Ektoderms^12,13,14 genutzt werden. Im Gegensatz zu In-vitro-Kulturen erlaubt die RL die Bewertung der Differenzierung und des morphogenetischen Potenzials einer Zellpopulation durch Interpretation embryonaler Signale von einem sich entwickelnden Glied ^9,15.

In diesem Protokoll wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Durchführung einer erfolgreichen RL mit reaggregierten mesodermalen Gliedmaßenknospenzellen bereitgestellt, wodurch die Möglichkeit eröffnet wird, dieses Protokoll mit verschiedenen Quellen von reaggregierten Zellen oder sogar verschiedenen Ektodermquellen anzupassen.