Summary

Test des membres recombinants du poulet pour comprendre la morphogenèse, la modelation et les premières étapes de la différenciation cellulaire

Published: January 12, 2022
doi:

Summary

Les membres recombinants sont un modèle expérimental puissant qui permet d’étudier le processus de différenciation cellulaire et la génération de motifs sous l’influence de signaux embryonnaires. Ce protocole présente une méthode détaillée pour générer des membres recombinants avec des cellules mésodermiques de membres de poulet, adaptables à d’autres types de cellules obtenues à partir de différents organismes.

Abstract

La différenciation cellulaire est le processus affiné de l’engagement cellulaire conduisant à la formation de différents types de cellules spécialisées lors de l’établissement de tissus et d’organes en développement. Ce processus est activement maintenu à l’âge adulte. La différenciation cellulaire est un processus continu au cours du développement et de l’homéostasie des organes. Comprendre les premières étapes de la différenciation cellulaire est essentiel pour connaître d’autres processus complexes tels que la morphogenèse. Ainsi, les membres de poulet recombinants sont un modèle expérimental qui permet d’étudier la différenciation cellulaire et la génération de motifs sous des signaux de motifs embryonnaires. Ce modèle expérimental imite un environnement in vivo ; il assemble des cellules réagrégées en une couverture ectodermique obtenue à partir d’un bourgeon de membre précoce. Plus tard, les ectodermes sont transférés et implantés dans un récepteur embryonnaire de poussin pour permettre son développement. Ce test a été principalement utilisé pour évaluer les cellules des bourgeons des membres mésodermiques; cependant, il peut être appliqué à d’autres cellules souches ou progénitrices d’autres organismes.

Introduction

Le membre vertébré est un formidable modèle pour étudier la différenciation cellulaire, la prolifération cellulaire, la mort cellulaire, la formation de motifs et la morphogenèse 1,2. Au cours du développement, les membres émergent sous forme de renflements des cellules dérivées du mésoderme à plaque latérale1. Les bourgeons des membres sont constitués d’un noyau central de cellules mésodermiques recouvertes d’un ectoderme. De cette structure précoce, un membre entier et bien formé émerge. Après l’apparition du bourgeon du membre, trois axes sont reconnus: (1) l’axe proximo-distal ([] épaule aux doigts), (2) l’axe dorso-ventral ([DV] de l’arrière de la main à la paume), et (3) l’avant-postérieur ([AP] pouce à doigt). L’axe proximal-distal dépend de la crête ectodermique apicale (AER), ectoderme spécialisé situé à l’extrémité distale du bourgeon du membre. L’AER est nécessaire pour l’excroissance, le maintien de la survie, la prolifération et l’état indifférencié des cellules recevant des signaux 2,3. D’autre part, la zone d’activité polarisante (ZPA) contrôle le motif antéropostérieur4, tandis que le motif dorsal et ectoderme contrôle le motif dorsoventral 7,8. L’intégration de motifs tridimensionnels implique une diaphonie complexe entre ces trois axes5. Malgré la compréhension de la voie moléculaire au cours du développement des membres, les questions ouvertes sur les mécanismes qui contrôlent la structure et l’excroissance appropriée pour former un membre entier restent sans réponse.

Edgar Zwilling a développé le système des membres recombinants (RL) en 1964 pour étudier les interactions entre les cellules mésenchymateuses des membres et l’ectoderme dans les membres en développement6. Le système RL assemble le mésoderme dissocié-réagrégé du bourgeon du membre dans l’ectoderme embryonnaire du membre pour le greffer dans la partie dorsale d’un embryon de poussin donneur. Les signaux fournis par l’ectoderme induisent l’expression de gènes de différenciation et de gènes de modelage de manière spatio-temporelle, induisant ainsi la formation d’une structure semblable à un membre qui peut récapituler les programmes cellulaires qui se produisent pendant le développement du membre 7,8,9.

Le modèle RL est précieux pour comprendre les propriétés des composants des membres et l’interaction entre les cellules mésodermiques et ectodermiques6. Un RL peut être défini comme une structure semblable à un membre créée par l’assemblage ou la recombinaison expérimentale de cellules mésodermiques de bourgeons de membres à l’intérieur d’une couverture ectodermique6. La morphogenèse du RL dépend des caractéristiques des cellules mésodermiques (ou d’autres types) qui répondront aux signaux de modelage ectodermique. L’un des avantages de ce système expérimental est sa polyvalence. Cette caractéristique permet la création de multiples combinaisons en faisant varier la source des cellules mésodermiques, telles que des cellules de différents stades de développement, de différentes positions le long du membre, ou des cellules entières (non dissociées) ou réagrégées 7,8,9,10. Un autre exemple est la capacité d’obtenir l’ectoderme embryonnaire d’espèces autres que le poulet, par exemple, la tortue11, la caille ou la souris12.

En ce sens, la technique RL aide à étudier le développement des membres et les interactions entre les cellules mésenchymateuses et ectodermiques des membres d’un point de vue évolutif. Cette technique a également un grand potentiel pour analyser la capacité de différentes sources de cellules progénitrices à se différencier en une structure semblable à un membre en tirant parti des signaux fournis par l’ectoderme embryonnaire 12,13,14. Contrairement aux cultures in vitro, le RL permet d’évaluer la différenciation et le potentiel morphogénétique d’une population cellulaire en interprétant les signaux embryonnaires d’un membre en développement 9,15.

Dans ce protocole, un guide étape par étape pour effectuer une RL réussie avec des cellules de bourgeons de membres mésodermiques réagrégés est fourni, ouvrant ainsi la possibilité d’adapter ce protocole avec différentes sources de cellules réagrégées ou même différentes sources d’ectodermes.

Protocol

Cette recherche a été examinée et approuvée par le Comité d’examen institutionnel pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico, Mexique). Un organigramme schématique des étapes générales de ce protocole est illustré à la figure 1A. 1. Incubation embryonnaire et détermination de la viabilité Incuber des œu…

Representative Results

Reconnaître un membre recombinant bien performantAprès la greffe, les embryons manipulés ont été renvoyés dans l’incubateur pour permettre au RL de se développer. Le temps d’incubation était en corrélation avec les exigences de l’expérience. Néanmoins, le RL peut être facilement distingué après 12 h d’implantation. Pour déterminer si l’implantation était adéquate, le LR a été observé comme une protubérance solidement fixée à la paroi mésodermique de l’embryon donne…

Discussion

En général, le protocole RL peut être divisé en cinq étapes: (1) l’incubation d’embryons, (2) l’obtention de cellules mésodermiques de membres pour remplir les ectodermes, (3) l’obtention des ectodermes, (4) l’assemblage de cellules mésodermiques à l’intérieur des couvertures ectodermiques, et (5) la transplantation des ectodermes remplis dans les embryons hôtes. La principale limite de la technique RL est le protocole long et détaillé, qui comporte de nombreux points critiques qui nécessitent de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Estefania Garay-Pacheco pour les images de la figure 2 et Maria Valeria Chimal-Montes de Oca pour les illustrations. Ce travail a été soutenu par la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [numéros de subvention IN211117 et IN213314] et le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [numéro de subvention 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] attribué à JC-M. JC M-L a reçu une bourse postdoctorale du Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).

Materials

Alcian Blue 8GX Sigma A5268
Angled slit knife Alcon 2.75mm DB
Blunt forceps Fine Science Tools 11052-10
Collagenase type IV Gibco 1704-019
DMEM-HG Sigma D5796
Egg incubator Incumatic de Mexico Incumatic 1000
Fetal Bovine Serum Gibco 16000069
Fine surgical forceps Fine Science Tools 9115-10
Hanks Balanced Salt Solution Sigma H6648
Microcentrifuge Eppendorf 5417R
Micropipet NA NA
Palladium wire GoodFellow 7440 05-3
Petri dish Nest 705001
Pippette crmglobe PF1016
Stereomicroscope Zeiss Stemi DV4
Tape NA NA
Trypsin porcine Merck 9002 07-7
Tungsten needle GoodFellow E74-15096/01

References

  1. Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
  2. Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
  3. Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
  4. Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
  5. McQueen, C., Towers, M. Establishing the pattern of the vertebrate limb. Development. 147 (17), (2020).
  6. Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
  7. Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
  8. Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
  9. Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
  10. Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
  11. Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, 53-54 (1984).
  12. Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
  13. Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
  14. Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
  15. Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
  16. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  17. Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
  18. Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
  19. MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
  20. Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
  21. Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
  22. Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).

Play Video

Cite This Article
Marín-Llera, J. C., Fernández-Calderón, M., Chimal-Monroy, J. Chicken Recombinant Limbs Assay to Understand Morphogenesis, Patterning, and Early Steps in Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (179), e63183, doi:10.3791/63183 (2022).

View Video