Kip recombinante ledematen test om morfogenese, patroonvorming en vroege stappen in celdifferentiatie te begrijpen

De gewervelde ledemaat is een formidabel model voor het bestuderen van celdifferentiatie, celproliferatie, celdood, patroonvorming en morfogenese ^1,2. Tijdens de ontwikkeling komen ledematen tevoorschijn als uitstulpingen van de cellen die zijn afgeleid van lateraal plaat mesoderm¹. Ledemaatknoppen bestaan uit een centrale kern van mesodermale cellen bedekt met een ectoderm. Uit deze vroege structuur komt een geheel en goed gevormd ledemaat tevoorschijn. Nadat de ledemaatknop ontstaat, worden drie assen herkend: (1) de proximo-distale as ([PD] schouder tot vingers), (2) de dorso-ventrale as ([DV] van de rug van de hand naar de handpalm) en (3) de voorste-achterste ([AP] duim naar vinger). De proximaal-distale as hangt af van de apicale ectodermale richel (AER), gespecialiseerd ectoderm aan de distale punt van de ledemaatknop. De AER is nodig voor uitgroei, overlevingsonderhoud, proliferatie en de ongedifferentieerde toestand van cellen die signalen ontvangen ^2,3. Aan de andere kant regelt de zone van polariserende activiteit (ZPA) anteroposteriorpatroon⁴, terwijl het dorsale en ectoderm dorsoventrale patronen ^7,8 regelen. Integratie van driedimensionale patronen impliceert complexe overspraak tussen deze drie assen⁵. Ondanks het begrijpen van de moleculaire route tijdens de ontwikkeling van ledematen, blijven open vragen over de mechanismen die patronen en de juiste uitgroei regelen om een hele ledemaat te vormen onbeantwoord.

Edgar Zwilling ontwikkelde het recombinante ledemaat (RL) systeem in 1964 om de interacties tussen mesenchymale cellen van ledematen en het ectoderm bij het ontwikkelen van ledematen te bestuderen⁶. Het RL-systeem assembleert het gedissocieerde-gereaggregateerde mesoderm van de ledemaatknop in het embryonale ledemaat-ectoderm om het te transplanteren in het dorsale deel van een donorkuikenembryo. De signalen van het ectoderm induceren de expressie van differentiatiegenen en patroongenen op een spatio-temporele manier, waardoor de vorming van een ledemaatachtige structuur wordt geïnduceerd die de celprogramma’s kan samenvatten die optreden tijdens de ontwikkeling van ledematen ^7,8,9.

Het RL-model is waardevol voor het begrijpen van de eigenschappen van ledemaatcomponenten en de interactie tussen mesodermale en ectodermale cellen⁶. Een RL kan worden gedefinieerd als een ledemaatachtige structuur die wordt gecreëerd door de experimenteel assemblerende of recombinerende mesodermale cellen van ledemaatknopen in een ectodermale dekking⁶. De morfogenese van de RL hangt af van de kenmerken van de mesodermale cellen (of andere typen) die zullen reageren op de ectodermale patroonsignalen. Een van de voordelen van dit experimentele systeem is de veelzijdigheid. Deze eigenschap maakt het mogelijk om meerdere combinaties te maken door de bron van mesodermale cellen, zoals cellen uit verschillende ontwikkelingsstadia, te variëren vanuit verschillende posities langs de ledemaat, of hele (niet-gesoctroeerde) of gereaggregateerde cellen 7,8,9,10. Een ander voorbeeld is het vermogen om het embryonale ectoderm te verkrijgen van andere soorten dan kip, bijvoorbeeld schildpad¹¹, kwartel of muis¹².

In die zin helpt de RL-techniek bij het bestuderen van de ontwikkeling van ledematen en de interacties tussen mesenchymale en ectodermale cellen van ledematen vanuit een evolutionair oogpunt. Deze techniek heeft ook een groot potentieel voor het analyseren van het vermogen van verschillende bronnen van voorlopercellen om te differentiëren in een ledemaatachtige structuur door gebruik te maken van de signalen van het embryonale ectoderm 12,13,14. In tegenstelling tot in vitro culturen maakt de RL het mogelijk om de differentiatie en het morfogenetische potentieel van een celpopulatie te evalueren door embryonale signalen van een zich ontwikkelende ledemaat^{te interpreteren 9,15}.

In dit protocol wordt een stapsgewijze handleiding gegeven voor het uitvoeren van succesvolle RL met gereaggregateerde mesodermale ledemaatknopcellen, waardoor de mogelijkheid wordt geopend om dit protocol aan te passen met verschillende bronnen van gereaggregateerde cellen of zelfs verschillende ectodermbronnen.