فحص الأطراف المؤتلفة للدجاج لفهم التشكل والتنميط والخطوات المبكرة في تمايز الخلايا
Summary
الأطراف المؤتلفة هي نموذج تجريبي قوي يسمح بدراسة عملية تمايز الخلايا وتوليد الأنماط تحت تأثير الإشارات الجنينية. يقدم هذا البروتوكول طريقة مفصلة لتوليد أطراف مؤتلفة مع خلايا الجلد المتوسط لأطراف الدجاج ، قابلة للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى التي تم الحصول عليها من كائنات حية مختلفة.
Abstract
تمايز الخلايا هو عملية مضبوطة بدقة لالتزام الخلية مما يؤدي إلى تكوين أنواع مختلفة من الخلايا المتخصصة أثناء إنشاء الأنسجة والأعضاء النامية. يتم الحفاظ على هذه العملية بنشاط في مرحلة البلوغ. تمايز الخلايا هو عملية مستمرة أثناء تطوير وتوازن الأعضاء. إن فهم الخطوات المبكرة لتمايز الخلايا أمر ضروري لمعرفة العمليات المعقدة الأخرى مثل التشكل الشكلي. وبالتالي ، فإن أطراف الدجاج المؤتلفة هي نموذج تجريبي يسمح بدراسة تمايز الخلايا وتوليد النمط تحت إشارات النقش الجنينية. هذا النموذج التجريبي يقلد بيئة في الجسم الحي . يقوم بتجميع الخلايا المعاد تجميعها في غطاء الجلد الخارجي الذي تم الحصول عليه من برعم الأطراف المبكر. في وقت لاحق ، يتم نقل الأديم الخارجي وزرعه في مستقبل جنين الفرخ للسماح بتطوره. تم استخدام هذا الفحص بشكل رئيسي لتقييم خلايا برعم الأطراف في الجلد المتوسط. ومع ذلك ، يمكن تطبيقه على الخلايا الجذعية أو السلفية الأخرى من الكائنات الحية الأخرى.
Introduction
الطرف الفقاري هو نموذج هائل لدراسة تمايز الخلايا ، وانتشار الخلايا ، وموت الخلايا ، وتكوين النمط ، والتشكل 1,2. أثناء التطور ، تظهر الأطراف على شكل انتفاخات من الخلايا المشتقة من الأديم المتوسط للصفيحة الجانبية1. تتكون براعم الأطراف من نواة مركزية من خلايا الجلد المتوسط التي تغطيها الأديم الخارجي. من هذا الهيكل المبكر ، يظهر طرف كامل وجيد التشكيل. بعد ظهور برعم الطرف ، يتم التعرف على ثلاثة محاور: (1) المحور القريب البعيد ([PD] من الكتف إلى الأصابع) ، (2) المحور الظهري البطني ([DV] من الجزء الخلفي من اليد إلى راحة اليد) ، و (3) الأمامي الخلفي ([AP] الإبهام إلى الإصبع). يعتمد المحور القريب البعيد على حافة الجلد الخارجي القمي (AER) ، وهو الأديم الخارجي المتخصص الموجود في الطرف البعيد من برعم الأطراف. مطلوب AER للنمو ، والحفاظ على البقاء على قيد الحياة ، والانتشار ، والحالة غير المتمايزة للخلايا التي تتلقى إشارات 2,3. من ناحية أخرى ، تتحكم منطقة نشاط الاستقطاب (ZPA) في التنميط الأمامي الخلفي4 ، بينما تتحكم الأديم الظهري والأديم الخارجي في النقوش الظهرية البطنية 7,8. ينطوي تكامل النقوش ثلاثية الأبعاد على محادثة متقاطعة معقدة بين هذه المحاور الثلاثة5. على الرغم من فهم المسار الجزيئي أثناء تطور الأطراف ، إلا أن الأسئلة المفتوحة حول الآليات التي تتحكم في النمط والنمو السليم لتشكيل طرف كامل لا تزال دون إجابة.
طور إدغار زويلينغ نظام الأطراف المؤتلفة (RL) في عام 1964 لدراسة التفاعلات بين الخلايا الوسيطة للأطراف والأديم الخارجي في الأطراف النامية6. يقوم نظام RL بتجميع الأديم المتوسط لبرعم الأطراف المنفصل والمعاد تجميعه في الأديم الخارجي للطرف الجنيني لتطعيمه في الجزء الظهري من جنين الفرخ المتبرع به. تحفز الإشارات التي يوفرها الأديم الخارجي على التعبير عن جينات التمايز وجينات الأنماط بطريقة مكانية زمانية ، مما يؤدي إلى تكوين بنية تشبه الأطراف يمكنها تلخيص برامج الخلايا التي تحدث أثناء تطور الأطراف 7,8,9.
نموذج RL ذو قيمة لفهم خصائص مكونات الأطراف والتفاعل بين خلايا الجلد المتوسط وخلايا الجلد الخارجي6. يمكن تعريف RL على أنه بنية تشبه الأطراف تم إنشاؤها بواسطة تجميع أو إعادة دمج خلايا الجلد المتوسط في برعم الأطراف تجريبيا داخل غطاء الجلد الخارجي6. يعتمد تكوين RL على خصائص خلايا الجلد المتوسط (أو أنواع أخرى) التي ستستجيب لإشارات نمط الجلد الخارجي. واحدة من مزايا هذا النظام التجريبي هو تنوعه. تسمح هذه الخاصية بإنشاء مجموعات متعددة عن طريق تغيير مصدر خلايا الجلد المتوسط ، مثل الخلايا من مراحل النمو المختلفة ، من مواقع مختلفة على طول الطرف ، أو الخلايا الكاملة (غير المنفصلة) أو المعاد تجميعها7،8،9،10. مثال آخر هو القدرة على الحصول على الأديم الخارجي الجنيني من أنواع أخرى غير الدجاج ، على سبيل المثال ، السلحفاة11 أو السمان أو الفأر12.
وبهذا المعنى ، تساعد تقنية RL في دراسة تطور الأطراف والتفاعلات بين الخلايا الوسيطة وخلايا الجلد الخارجي من وجهة نظر تطورية. تتمتع هذه التقنية أيضا بإمكانات كبيرة لتحليل قدرة المصادر المختلفة للخلايا السلفية على التمايز إلى بنية تشبه الأطراف من خلال الاستفادة من الإشارات التي يوفرها الأديم الخارجي الجنيني 12،13،14. على النقيض من الثقافات المخبرية ، يسمح RL بتقييم التمايز والإمكانات المورفوجينية لمجموعة الخلايا من خلال تفسير الإشارات الجنينية من أحد الأطراف النامية 9,15.
في هذا البروتوكول ، يتم توفير دليل خطوة بخطوة لإجراء RL ناجح مع خلايا برعم الأطراف المتوسطة المعاد تجميعها ، مما يفتح إمكانية تكييف هذا البروتوكول مع مصادر مختلفة للخلايا المعاد تجميعها أو حتى مصادر مختلفة للأديم الخارجي.
Protocol
Representative Results
Discussion
بشكل عام ، يمكن تقسيم بروتوكول RL إلى خمس خطوات: (1) حضانة الأجنة ، (2) الحصول على خلايا الأطراف المتوسطة لملء الأديم الخارجي ، (3) الحصول على الأديم الخارجي ، (4) تجميع خلايا الجلد المتوسط داخل أغطية الجلد الخارجي ، و (5) زرع الأديم الخارجي المملوء في الأجنة المضيفة. القيد الرئيسي لتقنية RL هو البر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر إستيفانيا غاراي باتشيكو على الصور في الشكل 2 وماريا فاليريا شيمال-مونتيس دي أوكا على الأعمال الفنية. وقد دعم هذا العمل المديرية العامة للأكاديمية الشخصية (DGAPA) – الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك [أرقام المنح IN211117 و IN213314] والمجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT) [رقم المنحة 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] الممنوحة ل JC-M. حصل JC M-L على زمالة ما بعد الدكتوراه من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M. Establishing the pattern of the vertebrate limb. Development. 147 (17), (2020).
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
