Полуцелевая сверхвысокоэффективная хроматография в сочетании с масс-спектрометрическим анализом фенольных метаболитов в плазме пожилых людей

Саркопения является прогрессирующим скелетным расстройством, связанным с ускоренной потерей мышц у пожилого населения. Такое состояние увеличивает риск падений и приводит к ограниченной деятельности повседневной жизни. Саркопения присутствует примерно у 5-10% лиц старше 65 лет и около 50% лиц в возрасте 80 лет и ^{старше1}. Для лечения саркопении не было одобрено никаких специфических препаратов, поэтому важна профилактика с физической активностью и сбалансированной ^{диетой1,2}. Питательные вмешательства со специально разработанными продуктами, обогащенными молочным белком и незаменимыми аминокислотами, показали положительные результаты в предотвращении саркопении2. В других исследованиях авторы включили в рацион витамины и антиоксиданты, такие как витамин Е и изофлавоны, увеличивая преимущества для увеличения мышечной массы на талии и ^{бедрах3}.

Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) — дерево, произрастающее в мексиканских тропических регионах; он потребляется культурами майя из-за его высокой питательной ^{ценности4}. Это хороший источник белка, клетчатки, минералов и фенольных антиоксидантов, таких как хлорогеновая ^{кислота5}. Поскольку его можно измельчать в порошок и использовать в хлебобулочных изделиях или потреблять в напитках, недавние исследования оценили включение семенной муки Рамона (RSF) в различные продукты для улучшения их питательной ценности. Был разработан напиток со вкусом капучино, дополненный RSF, который был с высоким содержанием пищевых волокон и содержал более 6 г белка на порцию и был высоко принят потребителями; таким образом, он рассматривался в качестве потенциальной альтернативы для удовлетворения особых диетических ^{требований6}. В последующем исследовании RSF также использовался для приготовления кекса и нового напитка, богатого белком, пищевыми волокнами, микроэлементами и фенольными антиоксидантами. Кекс и напиток использовались в диетическом вмешательстве для пожилых людей, которые потребляли оба продукта два раза в день в течение 30 дней. После этого периода улучшился питательный и саркопенический статус участников, а общее фенольное содержание в плазме ^{увеличилось7}. Однако определение общих фенольных соединений в плазме проводили спектрофотометрическим методом, поэтому идентификация фактических фенольных соединений, которые были поглощены, была невозможна; более того, этот метод не является полностью специфичным для фенольных соединений, поэтому может произойти некоторое завышение8.

Идентификация и количественная оценка фенольных соединений, которые всасываются после потребления продуктов, богатых этими антиоксидантами, является сложной задачей, но необходима для демонстрации биологической активности этих фитохимических веществ. Биодоступность большинства фенольных соединений низкая; менее 5% из них можно обнаружить без структурной трансформации в плазме. Фенольные соединения подвергаются нескольким биотрансформациям, таким как метилирование, сульфирование или глюкуронизация, которые осуществляются энтероцитами и гепатоцитами9. Фенольные соединения также биотрансформируются микробиотой в бактериальные катаболиты, которые могут оказывать свое благотворное влияние на организм после всасывания в ^{плазму10}. Например, фенилуксусная кислота является продуктом бактериальной трансформации флавоноидов и олигомерных проантоцианидинов, которые могут ингибировать до 40% адгезии бактерий (Escherichia coli) в мочевыводящих путях после потребления клюквы11.

Структурное разнообразие встречающихся в природе фенольных соединений, в сочетании с разнообразием их метаболитов и их низкой биодоступностью, делает их идентификацию в плазме еще более сложной. Метаболомное профилирование с использованием платформ спектроскопического анализа, таких как ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и тандемная масс-спектроскопия (MS / MS), вероятно, является лучшим подходом для достижения этой цели; к сожалению, оборудование не является легкодоступным, а разработка протоколов анализа по-прежнему ^{ограничена12}. В нескольких исследованиях сообщалось о РС / МС в сочетании с системой разделения (такой как жидкостная хроматография) в качестве стратегии снижения сложности масс-спектров в метаболомических исследованиях. Недавнее внедрение методов разделения сверхвысокопроизводительной жидкостной хроматографии (UPLC) сократило время анализа и повысило разрешение и чувствительность по сравнению с обычными высокопроизводительными жидкостными протоколами, поэтому системы UPLC-MS/MS быстро получили широкое признание сообщества аналитической ^{метаболомики13}. Таким образом, некоторые исследования исследовали фенольные метаболиты и обнаружили глюкуронизированные производные из кофейной кислоты, кверцетина и феруловой кислоты, а также сульфированные производные из сиринговой и ванильной кислоты в плазме лиц после приема клюквы14. Предыдущие протоколы предназначались для поиска фенольных соединений и фенольных метаболитов в биожидкостях, таких как плазма. Эти протоколы были основаны на идентификации и количественной оценке с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), соединенной с УФ-ви-детектором15. Тем не менее, такие протоколы требуют использования аутентичных стандартов для оценки абсолютной идентификации и точной количественной оценки. Широкий круг исследований выявил наиболее распространенные метаболиты в биожидкостях (сульфированные, глюкуронизированные и метилированные формы) UPLC-MS и UPLC-MS/MS; однако большая часть бактериальных метаболитов не была зарегистрирована из-за отсутствия баз данных, содержащих их полную ^{информацию16}. Идентификация метаболитов осложняется стоимостью и коммерческой доступностью стандартов метаболитов. Поэтому наилучшей стратегией может быть нецелевой или полуцелевой анализ метаболитов РС/МС, который опирается на использование информации о молекулярных признаках (m/z, моноизотопная точная масса, изотопное распределение и паттерн фрагментации) для определения химической идентичности и сравнивает ее со свободно доступными онлайн-базами данных, содержащими полифенольные метаболиты, идентифицированные в биожидкостях после потребления полиполифенол-рихттов12 . Наиболее важными базами данных, используемыми в исследованиях UPLC-MS / MS для идентификации фенольных соединений и их метаболитов, являются база данных метаболомов человека (HMDB), библиотека LipidBlast, библиотека METLIN и другие дополнительные базы данных, такие как PubChem, ChemSpider и Phenol ^Explorer17.

В настоящем исследовании был разработан полуцелевой метод UPLC-MS/MS для анализа образцов плазмы группы пожилых людей, участвующих в исследовании потребления кекса и напитков, содержащих ^RSF7. Данные из различных бесплатных онлайн-баз данных метаболитов плазмы были собраны и интегрированы в специализированную базу данных. Эта база данных может быть автоматически доступна программному обеспечению оборудования для идентификации полифенольных метаболитов в пяти образцах плазмы до и после 30-дневного вмешательства в питание. Это делается для выявления основных фенольных соединений, или их метаболитов, которые всасываются из специально разработанных функциональных продуктов, предназначенных для профилактики саркопении.