Этот протокол описывает рабочий процесс получения макрофагов, полученных из моноцитов (MDM) из образцов крови человека, простой метод эффективного введения воспалительной каспазы бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) в MDM человека без ущерба для жизнеспособности и поведения клеток, а также основанный на визуализации подход к измерению активации воспалительной каспазы в живых клетках.
Воспалительные каспазы включают каспазу-1, -4, -5, -11 и -12 и относятся к подгруппе инициаторных каспаз. Каспаза-1 необходима для обеспечения правильной регуляции воспалительной сигнализации и активируется бесконтактно-индуцированной димеризацией после рекрутирования в воспаленные. Каспаза-1 в изобилии присутствует в моноцитарной клеточной линии и индуцирует созревание провоспалительных цитокинов интерлейкина (IL)-1β и IL-18 до активных секретируемых молекул. Другие воспалительные каспазы, каспаза-4 и -5 (и их мышиный гомолог каспаза-11) способствуют высвобождению IL-1β, индуцируя пироптоз. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) – это инструмент, используемый для измерения воспалительной близости, вызванной каспазой, в качестве показания активации каспазы. Продомен каспазы-1, -4 или -5, который содержит область, которая связывается с воспалением, сливается с нефлуоресцентными фрагментами желтого флуоресцентного белка Venus (Venus-N [VN] или Venus-C [VC]), которые связываются с реформой флуоресцентного комплекса Венеры, когда каспазы подвергаются индуцированной близости. Этот протокол описывает, как вводить эти репортеры в первичные человеческие моноцитарные макрофаги (MDM) с использованием нуклеофекции, обрабатывать клетки, чтобы индуцировать воспалительную активацию каспазы, и измерять активацию каспазы с помощью флуоресценции и конфокальной микроскопии. Преимущество такого подхода заключается в том, что его можно использовать для выявления компонентов, требований и локализации комплекса активации воспалительной каспазы в живых клетках. Тем не менее, необходимо учитывать тщательный контроль, чтобы избежать ущерба жизнеспособности и поведению клеток. Этот метод является мощным инструментом для анализа динамических взаимодействий каспазы на уровне воспалительных сигналов, а также для опроса воспалительных сигнальных каскадов в живых МДМ и моноцитах, полученных из образцов крови человека.
Каспазы представляют собой семейство цистеиновых аспартатных протеаз, которые могут быть сгруппированы в инициирующие каспазы и каспазы палача. Каспазы палача включают каспазу-3, -6 и -7. Они естественным образом обнаруживаются в клетках в виде димеров и расщепляются инициаторами каспаз для выполнения апоптоза1. К каспазам-инициаторам относятся человеческие каспазы-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 и -12. Они обнаруживаются в виде неактивных зимогенов (прокаспасов), которые активируются бесконтактно-индуцированной димеризацией и стабилизируются автопротеолитическим расщеплением 2,3. Воспалительные каспазы являются подмножеством инициирующих каспаз2 и охватывают каспазу-1, -4, -5 и -12 у людей и каспазу-1, -11 и -12 у мыши 4,5. Вместо апоптотической роли, они играют центральную роль в воспалении. Они опосредуют протеолитическую обработку и секрецию про-интерлейкина (IL)-1β и про-IL-18 6,7, которые являются первыми цитокинами, высвобождаемыми в ответ на патогенные захватчики 8,9. Caspase-1 активируется при наборе на его платформу активации; большой молекулярно-массовый белковый комплекс, называемый инфламмасомой (рисунок 1А)10. Димеризация каспазы-4, -5 и -11 происходит независимо от этих платформ через неканонический воспалительный путь11,12.
Канонические инфламмасомы представляют собой цитозольные многомерные белковые комплексы, которые состоят из белка датчика воспаления, адапторного белка ASC (апоптоз-ассоциированный спекоподобный белок, содержащий CARD) и эффекторного белка каспазы-110. Наиболее хорошо изученными каноническими инфламмасомами являются NOD-подобное семейство рецепторов, содержащее пириновый домен (NLRP), NLRP1 и NLRP3, семейство NLR, содержащее CARD (NLRC), NLRC4 и отсутствующее в меланоме 2 (AIM2). Каждый из них содержит пириновый домен, CARD или оба домена. Домен CARD опосредует взаимодействие между CARD-содержащими каспазами и их восходящими активаторами. Поэтому молекула каркаса ASC, которая состоит из N-концевого пиринового домена (PYD) и мотива C-концевой CARD 13,14, необходима для рекрутирования каспазы-1 в воспалительные модели NLRP110, NLRP315 и AIM216.
Каждая инфламмасома названа в честь своего уникального сенсорного белка, который распознает различные провоспалительные стимулы (рисунок 1B). Активаторы этого пути называются каноническими стимулами. Инфламмасомы служат датчиками микробных компонентов и тканевого стресса и собираются, чтобы вызвать сильную воспалительную реакцию путем активации воспалительных каспаз17. Сборка инфламмасом инициирует активацию каспазы-1 для опосредования созревания и секреции ее основных субстратов pro-IL-1β и pro-IL-18. Этот процесс происходит с помощью двухэтапного механизма. Во-первых, прайминговый стимул повышает экспрессию определенных белков инфламмасомы и про-IL-1β путем активации пути NF-κB. Во-вторых, внутриклеточный (канонический) стимул индуцирует сборку и набор прокаспазы-1 6,7.
Каспаза-4 и каспаза-5 являются человеческими ортологами мышиной каспазы-1111. Они активируются инфламмасомно-независимым образом внутриклеточным липополисахаридом (ЛПС), молекулой, обнаруженной во внешней мембране грамотрицательныхбактерий 18,19,20, и внеклеточным гемом, продуктом гемолиза эритроцитов21. Было высказано предположение, что ЛПС связывается непосредственно с мотивом CARD этих белков и индуцирует их олигомеризацию20. Активация каспазы-4 или каспазы-5 способствует высвобождению IL-1β путем индуцирования воспалительной формы гибели клеток, называемой пироптозом, путем расщепления порообразующего белка гасдермина D (GSDMD)18,19. Кроме того, отток ионов калия, образующийся в результате каспазы-4 и GSDMD-опосредованной пироптотической смерти, индуцирует активацию воспалительной системы NLRP3 и последующую активацию каспазы-122,23. Поэтому каспаза-4, -5 и -11 считаются внутриклеточными датчиками для ЛПС, которые способны индуцировать пироптоз и активацию каспазы-1 в ответ на специфические стимулы11,24.
Рисунок 1: Анализ воспалительных каспаз и каспазо-бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC). (A) Диаграмма, показывающая систему каспазы-BiFC, где два продомена каспазы-1 (C1-pro), связанные с каждым нефлуоресцентным фрагментом Венеры (Venus-C или Venus-N), набираются на платформу активации NLRP3, заставляя Венеру пересворачиваться и флуоресцентировать. Этот комплекс появляется в виде зеленого пятна под микроскопом и служит считыванием для воспалительной близости, вызванной каспазой, что является первым шагом в активации инициатора каспазы. (B) Схема, показывающая доменную организацию компонентов воспаления и воспалительных каспаз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Измерение активации конкретных инициирующих каспаз затруднено, и существует не так много методов, доступных для этого с помощью подходов к визуализации. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) может быть использована для визуализации воспалительной активации каспазы непосредственно в живых клетках (Рисунок 1A)25. Этот метод был недавно адаптирован для использования в макрофагах человека, полученных из моноцитов (MDM)21. Caspase BiFC измеряет первый шаг в воспалительной активации каспазы, индуцированной близостью для облегчения димеризации. Использована экспрессия плазмид, кодирующих CARD-содержащий каспазный продомен, слитый с нефлуоресцентными фрагментами фотостабильного желтого флуоресцентного белка Venus (Venus-C [VC]) и Venus-N [VN]). Когда два продомена каспазы набираются на их платформу активации или подвергаются индуцированной близости, две половины Венеры приближаются в непосредственной близости и вынуждены переворачиваться и флуоресцентировать (см. Рисунок 1A, B). Это обеспечивает считывание в режиме реального времени специфической активации воспалительной каспазы.
Человеческий МДМ обильно экспрессирует гены воспаления и рецепторы распознавания образов, которые идентифицируют сигналы опасности и патогенные продукты. Это обеспечивает идеальный тип клеток для опроса воспалительных путей каспазы. Кроме того, они могут быть получены из периферической крови и даже из образцов пациентов для оценки активации воспалительной каспазы в определенном болезненном состоянии. Этот протокол описывает, как вводить репортеры каспазы BiFC в MDM с использованием нуклеофекции, метода трансфекции на основе электропорации, как обрабатывать клетки для индуцирования активации воспалительной каспазы и как визуализировать активные комплексы каспазы с использованием подходов микроскопии. Кроме того, эта методология может быть адаптирована для определения молекулярного состава этих комплексов, субклеточной локализации, кинетики и размера этих высокоупорядоченных структур 25,26,27.
Этот протокол описывает рабочий процесс получения макрофагов из моноцитов, выделенных из образцов крови человека, и метод эффективного введения воспалительной каспазы Репортеров BiFC в МДМ человека без ущерба для жизнеспособности и поведения клеток.
Этот протокол испол?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим членов лаборатории LBH в прошлом и настоящем, которые внесли свой вклад в разработку этой техники. Эта лаборатория поддерживается NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Рисунок 2 был нарисован с помощью программного обеспечения Biorender.
48 well tissue culture2:34 plates | Genesee Scientific | 25-108 | |
10 cm Tissue Culture Dishes | VWR | 25382-166 | |
2 Mercaptoethanol 1000x | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass | Cellvis | c8-1.5H-N | |
AutoMACS columns | Miltenyi (Biotec) | 130-021-101 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
AutoMACS Pro Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-092-545 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
AutoMACS Pro Washing Solution | Miltenyi (Biotec) | 130-092-987 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
AutoMACS Rinsing Solution | Miltenyi (Biotec) | 130-091-222 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
AutoMacs running buffer | Miltenyi (Biotec) | 130-091-221 | For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator |
Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit | Zeiss | Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used | |
AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope | Zeiss | Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used | |
CD14+ MICROBEADS | Miltenyi (Biotec) | 130-050-201 | For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator |
DPBS without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma | D8537-6x500ML | |
DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL | Sigma | GE17-1440-02 | |
GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050079 | |
GM-CSF | Thermo Fisher Scientific | PHC2011 | |
Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC) | Sigma | 51280-1G | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
Inflammatory caspase BiFC plasmids | Available by request from LBH lab | ||
LPS-EB Ultrapure | Invivogen | TLRL-3PELPS | |
LS Columns | Miltenyi (Biotec) | 130-042-401 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
MACS 15 mL Tube Rack | Miltenyi (Biotec) | 130-091-052 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
MACS MultiStand | Miltenyi (Biotec) | 130-042-303 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
mCherry plasmid | Yungpeng Wang Lab | Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene | |
Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station |
Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK1096 | Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 µL Neon tips and Neon electroporation tubes |
Nigericin sodium salt, ready made solution | Sigma | SML1779-1ML | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280-5mg | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-090-976 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
qVD-OPh | Fisher (ApexBio) | 50-101-3172 | |
RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software | Zeiss | Any software used to operate the confocal microscope of choice |