Summary

Визуализация воспалительных каспаз, индуцированных близостью в макрофагах, полученных из моноцитов человека

Published: April 06, 2022
doi:

Summary

Этот протокол описывает рабочий процесс получения макрофагов, полученных из моноцитов (MDM) из образцов крови человека, простой метод эффективного введения воспалительной каспазы бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) в MDM человека без ущерба для жизнеспособности и поведения клеток, а также основанный на визуализации подход к измерению активации воспалительной каспазы в живых клетках.

Abstract

Воспалительные каспазы включают каспазу-1, -4, -5, -11 и -12 и относятся к подгруппе инициаторных каспаз. Каспаза-1 необходима для обеспечения правильной регуляции воспалительной сигнализации и активируется бесконтактно-индуцированной димеризацией после рекрутирования в воспаленные. Каспаза-1 в изобилии присутствует в моноцитарной клеточной линии и индуцирует созревание провоспалительных цитокинов интерлейкина (IL)-1β и IL-18 до активных секретируемых молекул. Другие воспалительные каспазы, каспаза-4 и -5 (и их мышиный гомолог каспаза-11) способствуют высвобождению IL-1β, индуцируя пироптоз. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) – это инструмент, используемый для измерения воспалительной близости, вызванной каспазой, в качестве показания активации каспазы. Продомен каспазы-1, -4 или -5, который содержит область, которая связывается с воспалением, сливается с нефлуоресцентными фрагментами желтого флуоресцентного белка Venus (Venus-N [VN] или Venus-C [VC]), которые связываются с реформой флуоресцентного комплекса Венеры, когда каспазы подвергаются индуцированной близости. Этот протокол описывает, как вводить эти репортеры в первичные человеческие моноцитарные макрофаги (MDM) с использованием нуклеофекции, обрабатывать клетки, чтобы индуцировать воспалительную активацию каспазы, и измерять активацию каспазы с помощью флуоресценции и конфокальной микроскопии. Преимущество такого подхода заключается в том, что его можно использовать для выявления компонентов, требований и локализации комплекса активации воспалительной каспазы в живых клетках. Тем не менее, необходимо учитывать тщательный контроль, чтобы избежать ущерба жизнеспособности и поведению клеток. Этот метод является мощным инструментом для анализа динамических взаимодействий каспазы на уровне воспалительных сигналов, а также для опроса воспалительных сигнальных каскадов в живых МДМ и моноцитах, полученных из образцов крови человека.

Introduction

Каспазы представляют собой семейство цистеиновых аспартатных протеаз, которые могут быть сгруппированы в инициирующие каспазы и каспазы палача. Каспазы палача включают каспазу-3, -6 и -7. Они естественным образом обнаруживаются в клетках в виде димеров и расщепляются инициаторами каспаз для выполнения апоптоза1. К каспазам-инициаторам относятся человеческие каспазы-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 и -12. Они обнаруживаются в виде неактивных зимогенов (прокаспасов), которые активируются бесконтактно-индуцированной димеризацией и стабилизируются автопротеолитическим расщеплением 2,3. Воспалительные каспазы являются подмножеством инициирующих каспаз2 и охватывают каспазу-1, -4, -5 и -12 у людей и каспазу-1, -11 и -12 у мыши 4,5. Вместо апоптотической роли, они играют центральную роль в воспалении. Они опосредуют протеолитическую обработку и секрецию про-интерлейкина (IL)-1β и про-IL-18 6,7, которые являются первыми цитокинами, высвобождаемыми в ответ на патогенные захватчики 8,9. Caspase-1 активируется при наборе на его платформу активации; большой молекулярно-массовый белковый комплекс, называемый инфламмасомой (рисунок 1А)10. Димеризация каспазы-4, -5 и -11 происходит независимо от этих платформ через неканонический воспалительный путь11,12.

Канонические инфламмасомы представляют собой цитозольные многомерные белковые комплексы, которые состоят из белка датчика воспаления, адапторного белка ASC (апоптоз-ассоциированный спекоподобный белок, содержащий CARD) и эффекторного белка каспазы-110. Наиболее хорошо изученными каноническими инфламмасомами являются NOD-подобное семейство рецепторов, содержащее пириновый домен (NLRP), NLRP1 и NLRP3, семейство NLR, содержащее CARD (NLRC), NLRC4 и отсутствующее в меланоме 2 (AIM2). Каждый из них содержит пириновый домен, CARD или оба домена. Домен CARD опосредует взаимодействие между CARD-содержащими каспазами и их восходящими активаторами. Поэтому молекула каркаса ASC, которая состоит из N-концевого пиринового домена (PYD) и мотива C-концевой CARD 13,14, необходима для рекрутирования каспазы-1 в воспалительные модели NLRP110, NLRP315 и AIM216.

Каждая инфламмасома названа в честь своего уникального сенсорного белка, который распознает различные провоспалительные стимулы (рисунок 1B). Активаторы этого пути называются каноническими стимулами. Инфламмасомы служат датчиками микробных компонентов и тканевого стресса и собираются, чтобы вызвать сильную воспалительную реакцию путем активации воспалительных каспаз17. Сборка инфламмасом инициирует активацию каспазы-1 для опосредования созревания и секреции ее основных субстратов pro-IL-1β и pro-IL-18. Этот процесс происходит с помощью двухэтапного механизма. Во-первых, прайминговый стимул повышает экспрессию определенных белков инфламмасомы и про-IL-1β путем активации пути NF-κB. Во-вторых, внутриклеточный (канонический) стимул индуцирует сборку и набор прокаспазы-1 6,7.

Каспаза-4 и каспаза-5 являются человеческими ортологами мышиной каспазы-1111. Они активируются инфламмасомно-независимым образом внутриклеточным липополисахаридом (ЛПС), молекулой, обнаруженной во внешней мембране грамотрицательныхбактерий 18,19,20, и внеклеточным гемом, продуктом гемолиза эритроцитов21. Было высказано предположение, что ЛПС связывается непосредственно с мотивом CARD этих белков и индуцирует их олигомеризацию20. Активация каспазы-4 или каспазы-5 способствует высвобождению IL-1β путем индуцирования воспалительной формы гибели клеток, называемой пироптозом, путем расщепления порообразующего белка гасдермина D (GSDMD)18,19. Кроме того, отток ионов калия, образующийся в результате каспазы-4 и GSDMD-опосредованной пироптотической смерти, индуцирует активацию воспалительной системы NLRP3 и последующую активацию каспазы-122,23. Поэтому каспаза-4, -5 и -11 считаются внутриклеточными датчиками для ЛПС, которые способны индуцировать пироптоз и активацию каспазы-1 в ответ на специфические стимулы11,24.

Figure 1
Рисунок 1: Анализ воспалительных каспаз и каспазо-бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC). (A) Диаграмма, показывающая систему каспазы-BiFC, где два продомена каспазы-1 (C1-pro), связанные с каждым нефлуоресцентным фрагментом Венеры (Venus-C или Venus-N), набираются на платформу активации NLRP3, заставляя Венеру пересворачиваться и флуоресцентировать. Этот комплекс появляется в виде зеленого пятна под микроскопом и служит считыванием для воспалительной близости, вызванной каспазой, что является первым шагом в активации инициатора каспазы. (B) Схема, показывающая доменную организацию компонентов воспаления и воспалительных каспаз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Измерение активации конкретных инициирующих каспаз затруднено, и существует не так много методов, доступных для этого с помощью подходов к визуализации. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) может быть использована для визуализации воспалительной активации каспазы непосредственно в живых клетках (Рисунок 1A)25. Этот метод был недавно адаптирован для использования в макрофагах человека, полученных из моноцитов (MDM)21. Caspase BiFC измеряет первый шаг в воспалительной активации каспазы, индуцированной близостью для облегчения димеризации. Использована экспрессия плазмид, кодирующих CARD-содержащий каспазный продомен, слитый с нефлуоресцентными фрагментами фотостабильного желтого флуоресцентного белка Venus (Venus-C [VC]) и Venus-N [VN]). Когда два продомена каспазы набираются на их платформу активации или подвергаются индуцированной близости, две половины Венеры приближаются в непосредственной близости и вынуждены переворачиваться и флуоресцентировать (см. Рисунок 1A, B). Это обеспечивает считывание в режиме реального времени специфической активации воспалительной каспазы.

Человеческий МДМ обильно экспрессирует гены воспаления и рецепторы распознавания образов, которые идентифицируют сигналы опасности и патогенные продукты. Это обеспечивает идеальный тип клеток для опроса воспалительных путей каспазы. Кроме того, они могут быть получены из периферической крови и даже из образцов пациентов для оценки активации воспалительной каспазы в определенном болезненном состоянии. Этот протокол описывает, как вводить репортеры каспазы BiFC в MDM с использованием нуклеофекции, метода трансфекции на основе электропорации, как обрабатывать клетки для индуцирования активации воспалительной каспазы и как визуализировать активные комплексы каспазы с использованием подходов микроскопии. Кроме того, эта методология может быть адаптирована для определения молекулярного состава этих комплексов, субклеточной локализации, кинетики и размера этих высокоупорядоченных структур 25,26,27.

Protocol

Этот протокол следует руководящим принципам комитета по этике исследований человека Медицинского колледжа Бейлора по манипулированию человеческими образцами. Образцы крови обрабатываются в соответствии с институциональными руководящими принципами безопасности для образцов челов…

Representative Results

Схема, показанная на рисунке 2, дает обзор того, как получить, трансфектировать и изобразить МДМ человека. После инкубации выбранных моноцитов CD14+ с GM-CSF в течение 7 дней морфология клеток изменяется в течение периода дифференцировки (рисунок 3A), переходя о?…

Discussion

Этот протокол описывает рабочий процесс получения макрофагов из моноцитов, выделенных из образцов крови человека, и метод эффективного введения воспалительной каспазы Репортеров BiFC в МДМ человека без ущерба для жизнеспособности и поведения клеток.

Этот протокол испол?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим членов лаборатории LBH в прошлом и настоящем, которые внесли свой вклад в разработку этой техники. Эта лаборатория поддерживается NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Рисунок 2 был нарисован с помощью программного обеспечения Biorender.

Materials

48 well tissue culture2:34 plates Genesee Scientific 25-108
10 cm Tissue Culture Dishes VWR 25382-166
2 Mercaptoethanol 1000x Thermo Fisher Scientific 21985023
8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass Cellvis c8-1.5H-N
AutoMACS columns Miltenyi (Biotec) 130-021-101 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Pro Separator Miltenyi (Biotec) 130-092-545 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Pro Washing Solution Miltenyi (Biotec) 130-092-987 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMACS Rinsing Solution Miltenyi (Biotec) 130-091-222 For automated separation using AutoMACS Pro Separator only
AutoMacs running buffer Miltenyi (Biotec) 130-091-221 For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator
Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit Zeiss Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used
AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope Zeiss Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used
CD14+ MICROBEADS Miltenyi (Biotec) 130-050-201 For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator
DPBS without calcium chloride and magnesium chloride Sigma D8537-6x500ML
DsRed mito plasmid Clontech 632421 Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL Sigma GE17-1440-02
GlutaMAX Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 35050079
GM-CSF Thermo Fisher Scientific PHC2011
Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC) Sigma 51280-1G
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630106
Inflammatory caspase BiFC plasmids Available by request from LBH lab
LPS-EB Ultrapure Invivogen TLRL-3PELPS
LS Columns Miltenyi (Biotec) 130-042-401 For manual separation using QuadroMACS Separator only
MACS 15 mL Tube Rack Miltenyi (Biotec) 130-091-052 For manual separation using QuadroMACS Separator only
MACS MultiStand Miltenyi (Biotec) 130-042-303 For manual separation using QuadroMACS Separator only
mCherry plasmid Yungpeng Wang Lab Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
Neon Transfection System Thermo Fisher Scientific MPK5000 Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo Fisher Scientific MPK1096 Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 µL Neon tips and Neon electroporation tubes
Nigericin sodium salt, ready made solution Sigma SML1779-1ML
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Poly-D-Lysine Hydrobromide Sigma P7280-5mg
QuadroMACS Separator Miltenyi (Biotec) 130-090-976 For manual separation using QuadroMACS Separator only
qVD-OPh Fisher (ApexBio) 50-101-3172
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875119
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200072
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575020
Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software Zeiss Any software used to operate the confocal microscope of choice

References

  1. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  2. Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
  3. Boice, A., Bouchier-Hayes, L. Targeting apoptotic caspases in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688 (2020).
  4. Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease. The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).
  5. Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117 (5), 561-574 (2004).
  6. Lamkanfi, M., Vishva, M. D. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).
  7. Viganò, E., et al. Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes. Nature Communications. 6, 8761 (2015).
  8. Cerretti, D. P., et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256 (5053), 97 (1992).
  9. van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection. Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).
  10. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  11. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).
  12. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  13. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  14. Bertin, J., DiStefano, P. S. The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins. Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).
  15. Agostini, L., et al. NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).
  16. Bürckstümmer, T., et al. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).
  17. Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).
  18. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  19. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  20. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  21. Bolívar, B. E., et al. Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death. The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).
  22. Schmid-Burgk, J. L., et al. Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).
  23. Baker, P. J., et al. NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5. European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).
  24. Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis. Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).
  25. Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death & Disease. 6, 1813 (2015).
  26. Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316 (2018).
  27. Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
  28. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
  29. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).
  30. Perregaux, D., et al. IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin. The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).
  31. Cheneval, D., et al. Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing. Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).
  32. Fernandes-Alnemri, T., et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).
  33. Lu, A., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
  34. Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases. Blood. 32 (5), 811-815 (1968).
  35. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
  36. Thornberry, N. A., et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
  37. Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).
  38. Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).
  39. Bhowmik, P., et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 8 (1), 6502 (2018).
  40. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What’s the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).
  41. Kurokawa, M., Kornbluth, S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 138 (5), 838-854 (2009).

Play Video

Cite This Article
Bolívar, B. E., Bouchier-Hayes, L. Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (182), e63162, doi:10.3791/63162 (2022).

View Video