Drosophila melanogaster פרוטוקול הזרקת זחלים
Summary
זבובים בוגרים של Drosophila melanogaster נוצלו בהרחבה כאורגניזמים מודל כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התגובות החיסוניות המולדות של המארחים ואסטרטגיות זיהום מיקרוביאליות. כדי לקדם את שלב הזחלים D. melanogaster כמערכת מודל נוספת או חלופית, מתוארת טכניקת הזרקת זחלים.
Abstract
השימוש במודלים לא קונבנציונליים לחקר חסינות מולדת וארסיות פתוגן מספק חלופה בעלת ערך למודלים של יונקים, אשר יכול להיות יקר ולהעלות סוגיות אתיות. דגמים לא קונבנציונליים הם זולים לשמצה, קלים לטיפול ותרבות, ואינם תופסים הרבה מקום. הם נוחים גנטית ובעלי רצפי גנום שלמים, והשימוש בהם אינו מציג שיקולים אתיים. זבוב הפירות Drosophila melanogaster, למשל, סיפק תובנות נהדרות על מגוון רחב של התנהגות, התפתחות, חילוף חומרים, ומחקר חסינות. ליתר דיוק, D. melanogaster זבובים בוגרים וזחלים להחזיק כמה תגובות הגנה מולדות המשותפות עם בעלי חוליות. המנגנונים המסדירים את התגובות החיסוניות נחשפו בעיקר באמצעות מחקרים גנטיים ומולקולריים במודל D. melanogaster . כאן מסופקת טכניקת הזרקת זחלים חדשנית, אשר תקדם עוד יותר חקירות של תהליכים חיסוניים מולדים בזחלי D. melanogaster ולחקור את הפתוגנזה של מגוון רחב של זיהומים מיקרוביאליים.
Introduction
Drosophila melanogaster כבר מנוצל מאוד במחקר ביולוגי וביו-רפואי במשך כמה עשורים, כמו המערך המתוחכם של כלים גנטיים ומולקולריים התפתחו בהתמדה לניתוח של מגוון רחב של מחקרים1,2,3,4. ההיבטים השמורים אבולוציונית של התפתחות, הומאוסטזיס וחסינות מולדת ב– D. melanogaster הפכו אותו לאורגניזם מודל בעל ערך לחקר מחלות אנושיות וחרקים שונות5,6. ראוי לציין, את התפקיד הבסיסי של מודל D. melanogaster לחקר חסינות כבר בא לידי ביטוי במידה רבה במחקרים זבובים למבוגרים. עם זאת, D. melanogaster זחלים מחקרים תרמו גם לידע הנוכחי בעיקר חקר תגובות חיסוניות הסלולר, במיוחד עבור צרעות וזיהומים נמטודות המתרחשים דרך קוטיקל חרק7,8,9,10. זחלי Drosophila melanogaster מחזיקים בשלושה סוגים שונים של תאי דם, הנקראים ביחד המוציטים: פלסמטוציטים, תאי קריסטל ולאמלוציטים11,12,13. תאים אלה יכולים להרכיב מערך של תגובות חיסוניות כאשר זחלי D. melanogaster נגועים בפתוגנים כגון חיידקים, פטריות, וירוסים וטפילים14,15,16. התגובות החיסוניות התאיות כוללות בליעה ישירה (פאגוציטוזיס) של מולקולות קטנות או חיידקים, מלניזציה, אנקפסולציה של פתוגנים גדולים יותר כגון ביצי טפילים, וייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) וסינתיסייזרים תחמוצת החנקן (NOS)17,18,19.
לעומת זאת, פחות מחקרים פורסמו על השימוש במודל הזחל D. melanogaster כדי לנתח תגובות חיסוניות הומוריסטיות. זה בעיקר בשל היישום של בדיקות האכלה לזיהום אוראלי של זחלי D. melanogaster ומספר אתגרים הקשורים זחלים microinjecting כולל טיפול מדויק של זחלים ושימוש נכון של microneedle, במיוחד במהלך חדירה20,21. לפיכך, הידע המוגבל של זיהום זחלים וקשיים טכניים (כלומר, תמותה גבוהה) הפכו לעתים קרובות את מודל הזחל D. melanogaster קשה לשימוש. למודל זחל יהיה פוטנציאל לזהות מנגנונים מולקולריים חדשניים שיספקו תובנות נוספות על אינטראקציות מארח-פתוגן ועל אינדוקציה של תגובות חיסוניות מולדות מארח ספציפיות נגד זיהומים פתוגניים.
כאן פרוטוקול פשוט ויעיל שניתן להשתמש בו כדי להזריק D. melanogaster זחלים עם פתוגנים שונים, כגון חיידקים, מתואר בפירוט. בפרט, D. זחלי מלנוגאסטר משמשים לזריקות עם הפתוגן האנושי Photorhabdus asymbiotica והחיידקים הלא פתוגניים Escherichia coli. שיטה זו יכולה לשמש למניפולציה וניתוח של התגובות החיסוניות של D. melanogaster לזיהומים מיקרוביאליים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster הוא בין המודלים החשובים ביותר, מניפולציה ניסיונית המשמשים לחקירות של חסינות מולדת ופתוגנזה של זיהומים מיקרוביאליים שונים. הסיבה לכך היא מחזור החיים הפשוט והמהיר שלה, תחזוקה פשוטה במעבדה, גנטיקה אבולוציונית מבוססת היטב וארגז כלים גנטי מגוון. שיטות קודמות של D. melanogaster</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי המחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת ג’ורג’ וושינגטון (GWU) על הקריאה הביקורתית של כתב היד. GT נתמכה באמצעות מלגת קיץ של הרלן מ- GWU. כל הדמויות הגרפיות נעשו באמצעות BioRender.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
- Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
- Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
- Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
- Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
- Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host’s blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
- Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
- Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
- Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
- Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
- Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
- Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
- Honti, V., Csordás, G., Kurucz, &. #. 2. 0. 1. ;., Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
- Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
- Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
- Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).
- Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
- Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
- Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
- Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).
