Summary

Sıralı Capillarity destekli Montaj yoluyla Mikroorganizmaların ve Mikropartiküllerin Deseni

Published: November 04, 2021
doi:

Summary

Bakteri ve kolloidler gibi bir sıvıda asılı mikro boyutlu nesneleri polidimetilsiloksisan substratında öngörülen dizilere desenleştirmek için mikroakışkan bir platformda kapilarite destekli montaj kullanan bir teknoloji sunuyoruz.

Abstract

Mikroorganizmaların tanımlanmış mekansal düzenlemelere kontrollü bir şekilde desenlenerek, mikrobiyal fizyoloji ve etkileşim çalışmaları da dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik uygulamalar için benzersiz olanaklar sunar. En basit düzeyde, mikroorganizmaların doğru mekansal desenlemleri, çok sayıda bireysel hücrenin güvenilir, uzun süreli görüntülenmesini sağlayacak ve mesafeye bağlı mikrop-mikrop etkileşimlerini nicel olarak inceleme yeteneğini dönüştürecektir. Daha benzersiz bir şekilde, mikroakışkan teknolojinin sunduğu gibi, doğru mekansal desenleme ve çevresel koşullar üzerinde tam kontrol sağlamak, mikrobiyal ekolojide tek hücreli çalışmalar için güçlü ve çok yönlü bir platform sağlayacaktır.

Bu makale, mikroakışkan bir kanal içinde çok yönlü ve kullanıcı tanımlı mikroorganizma desenleri üretmek için mikroakışkan bir platform sunarak uzun süreli, yüksek verimli izleme için tam optik erişim sağlar. Bu yeni mikroakışkan teknoloji, kılcal damar destekli parçacık montajına dayanır ve mikroakışkan bir kanalın içindeki buharlaşan süspansiyonun kontrollü hareketinden kaynaklanan kılcal kuvvetlerden yararlanarak mikro boyutlu nesneleri polidimetilsiloksisan (PDMS) substratına mikrofabrik bir dizi tuzakta biriktirir. Sıralı çökeltiler, yalnızca tuzakların geometrisi ve dolum sırası tarafından dikte edilen tek veya birden fazla mikro boyutlu nesne türünün istenen uzamsal düzenini oluşturur.

Platform, farklı boyut ve malzemelerden kolloidal parçacıklar kullanılarak kalibre edilmiştir: çeşitli kolloidal desenler oluşturmak ve sıkışmış parçacıkların yüzey fonksiyonelleştirmesini gerçekleştirmek için güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, platform Escherichia coli hücreleri model bakteri olarak kullanılarak mikrobiyal hücreler üzerinde test edildi. Yüzeyde binlerce bireysel hücre desenlendi ve zaman içinde büyümeleri izlendi. Bu platformda, tek hücreli biriktirme ve mikroakışkan teknolojinin birleşmesi, hem mikroorganizmaların geometrik desenlenmesine hem de çevresel koşulların hassas kontrolüne izin verir. Böylece, ön deneylerde gösterildiği gibi, tek mikropların fizyolojisine ve mikrop-mikrop etkileşimlerinin ekolojisine bir pencere açar.

Introduction

Tek mikroorganizmaların, özellikle mikroakışkan cihazlar gibi çevresel koşullar üzerinde tam kontrol sağlayan deneysel arenalarda mekansal desenleme, çok çeşitli bağlamlarda son derece arzu edilir. Örneğin, mikroorganizmaların düzenli diziler halinde düzenlenmesi, çok sayıda bireysel hücrenin doğru görüntülenmesine ve çevresel uyaranlara yanıt olarak büyüme, fizyoloji, gen ekspresyonu ve ilaç duyarlılığının incelenmesine izin verecektir. Ayrıca, hücresel iletişim (örneğin, çekirdek algılama), çapraz besleme (örneğin, alg-bakteriyel simbiyoz) veya antagonizm (örneğin, allelopati) araştırmalarında özel olarak ilgi çekici hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesine ve hücrelerin birbirine göre mekansal lokalizasyonu üzerinde tam kontrole sahip olmasına izin verecektir. Hücre fizyolojisi ve evrim çalışmaları1, hücre-hücre etkileşim çalışmaları2, fenotipik farklılaşma taraması3, çevresel izleme4 ve ilaç taraması5 , bu tür nicel tek hücreli analizleri başarabilen bir teknolojiden büyük ölçüde yararlanabilecek alanlar arasındadır.

Holografik optik tuzaklar6 ve heterojen yüzey fonksiyonelleştirme yöntemleri7,8,9,10’dan tek hücreli kemostatlara11 ve damlacık mikroakışkanlarına12 kadar tek hücreleri izole etmek ve işlemek için son yıllarda çeşitli stratejiler önerilmiştir. Bu yöntemler teknik olarak çok zorludur veya hücre fizyolojisini etkiler ve tek hücreli çözünürlük, tam optik erişim ve çevresel koşullar üzerinde kontrol sağlayarak uzun süre çalışılabilen mikropları örüntülemek için yüksek verimli bir platform sağlayamaz. Bu makalenin amacı, bakterileri mikrometrik hassasiyetle, kapilarite destekli montaj yoluyla PDMS yüzeyinde öngörülen mekansal düzenlemelere desenlamak için bir platform tanımlamaktır. Bu platform, mikropların hassas ve esnek uzamsal desenlemesine izin verir ve mikroakışkan doğası sayesinde çevresel koşullar üzerinde tam optik erişim ve kontrol sağlar.

Bu platformun arkasındaki teknoloji, mikroakışkan bir platforma entegre edilen sCAPA13,14,15 (sıralı kapilarite destekli parçacık montajı) adlı son yıllarda geliştirilen bir montaj teknolojisidir16. Buharlaşan bir sıvı damlacığın menisküsleri, mikroakışkan bir kanalın içindeki desenli bir polidimetilsiloksan (PDMS) substratı üzerinde çekilirken, sıvıda asılı kalan bireysel kolloidal parçacıkları alt tabaka üzerinde mikrofebrik kuyulara hapseden kılcal kuvvetler uygular (Şekil 1A). Askıda parçacıklar önce konvektif akımlarla hava-sıvı arayüzüne taşınır ve daha sonra kapilarite ile tuzaklara yerleştirilir. Hareketli menisküs tarafından uygulanan kılcal kuvvetler, parçacık etkileşimlerine katılan kuvvetlere kıyasla daha büyük ölçekte hareket eder.

Böylece, montaj mekanizması parçacıkların malzeme, boyut ve yüzey özelliklerinden etkilenmez. Partikül konsantrasyonu, menisküs hızı, sıcaklık ve süspansiyonun yüzey gerilimi gibi parametreler, desenleme işleminin verimini etkileyen tek parametrelerdir. Okuyucu, yukarıda belirtilen parametrelerin desenleme işlemi üzerindeki etkisinin ayrıntılı bir açıklamasını 13,14,15’te bulabilir. Orijinal sCAPA teknolojisinde13,14,15, kolloidal desenleme işlemi açık bir sistemde gerçekleştirildi ve süspansiyonu şablon boyunca sürmek için yüksek hassasiyetli bir piezoelektrik aşama gerektirdi. Bu platform farklı bir stratejiden yararlanır ve desenlemenin genellikle mikroakışkanlarda kullanılan standart ekipmanlarla kontrollü bir ortamda gerçekleştirildiğini ve böylece numunelerin kirlenme risklerini en aza indirmesini sağlar.

Bu mikroakışkan platform, düzenli inert parçacık dizileri oluşturmak için önce kolloidal parçacıklar üzerinde optimize edildi ve daha sonra bakterilere başarıyla uygulandı. Her iki mikroakışkan platform da bu makalede açıklanmıştır (Şekil 1B,C). Hazırlık adımlarının ve protokolde açıklanan deneysel ekipmanların çoğu iki uygulama için ortaktır (Şekil 2). Tekniğin karmaşık, çokmal desenler oluşturmak için aynı yüzeyde birden fazla sıralı çökelti gerçekleştirmek için kullanılabileceğini göstermek için kolloidal desenleme rapor ediyoruz. Özellikle, belirli bir geometriye ve bileşime sahip kolloidal diziler oluşturmak için her adım için tuzak başına tek bir parçacık biriktirildi, sadece tuzakların geometrisi ve dolum sırası tarafından dikte edildi. Bakteriyel desenleme gelince, tek ifadeler tanımlanır ve bu da tuzak başına bir bakterinin birikmesine neden edilir. Hücreler yüzeyde desenlendikten sonra, mikroakışkan kanal, herhangi bir tek hücreli çalışmanın ön adımı olan bakteri üremesini teşvik etmek için orta ile yıkanır.

Protocol

1. Silikon master hazırlığı NOT: Kolloidal ve mikrobiyal desenleme şablonlarını oluşturan mikrofabrik tuzakları taşıyan PDMS şablonları Geissler ve ark. 17. Silikon ustası, temiz bir odada geleneksel litografi ile hazırlandı. Prosedür için aşağıdaki adımlara ve ekipman için Malzeme Tablosuna bakın. Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanarak özellikleri tasarlayın….

Representative Results

Kolloidal parçacıkları ve bakterileri pdms şablonunda mikrofabrik olarak tasarlanmış tuzaklara sokmak için kapillarite destekli montajdan yararlanan mikroakışkan bir platform geliştirilmiştir. Kolloidlerin ve bakterilerin kapillarite destekli montaj yoluyla desenlerini optimize etmek için iki farklı kanal geometrisi tasarlanmıştır. İlk kanal geometrisi (Şekil 1B), aralarında fiziksel bariyer olmayan üç 23 mm uzunluğunda paralel bölümden oluşur. Yanlardaki iki bölüm…

Discussion

Burada açıklanan mikroakışkan platform, kolloidler ve bakteriler gibi mikro boyutlu nesnelerin PDMS alt tabakasında öngörülen uzamsal düzenlemelere desenlenerek örüntülmesini sağlar. Mikroakışkanların sunduğu çevresel koşullar üzerindeki tam kontrol ve sCAPA teknolojisinin verdiği mikrometrik hassasiyetle hücreleri desenleme yeteneği, onu gelecekteki fizyoloji ve ekoloji çalışmaları için çok umut verici bir platform haline getirmektedir.

Bu çalışmada sunulan den…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, SNSF PRIMA hibe 179834 (E.S.’ye), bir ETH Araştırma Hibesi ETH-15 17-1’den (R. S.) ve Gordon ve Betty Moore Vakfı SuCul Mikrobiyal Simbiyoz Araştırmacı Ödülü’nden (GBMF9197 hibe) (R. S.) destek kabul ediyorlar. Yazarlar, bakterilerin SEM görüntülemesi ve içgörülü tartışmalar için Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez’e (İspanya Granada Üniversitesi) teşekkür ediyor. Yazarlar, içgörülü tartışmalar için Dr. Jen Nguyen (Kanada British Columbia Üniversitesi), Dr. Laura Alvarez (ETH Zürih, İsviçre), Cameron Boggon (ETH Zürih, İsviçre) ve Dr. Fabio Grillo’ya teşekkür ediyor.

Materials

Alcatel AMS 200SE I-Speeder Alcatel Micro Machining System deep reactive ion exchange system
Alconox detergent
AZ400K developer MicroChemicals AZ400K
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) BD 300912 used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel
Box Incubator Life Imaging Services used to ensure a uniform and constant temperature in the channel
Centrifuge Eppendorf 5424R used to replace the overnight media with fresh minimal media
Centrifuge vial Eppendorf 30120086 1.5 mL
CETONI Base 120 CETONI GmbH syringe pump
Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) microParticles GmbH PS-FluoRed-Fi267
Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) microParticles GmbH PS-FluoGreen-Fi182
Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) microParticles GmbH PS-FluoGreen-Fi183
Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) microParticles GmbH PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M PVA TePla used to plasma treat a 10 cm silicon wafer
H401-T-CONTROLLER Okolab controller of the heated glass plate
H601-NIKON-TS2R-GLASS Okolab heated glass plate
Heidelberg DWL 2000 Heidelberg Instruments UV direct laser writer
Insulin syringes, U 100, with luer Codan Medical ApS CODA621640 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process
Klayout Opensource used to design the features on the silicon master
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific 244610 Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel
Masterflex transfer tubing Masterflex HV-06419-05 0.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x) Teknova M2101 diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium
Nikon Eclipse Ti2 Nikon Instruments microscope
openSCAD Opensource used to design the mold
OPTIspin SB20 ATM group 51-0002-01-00 spin developer
Plasma chamber Zepto Diener Electronic ZEPTO-1 used to plasma treat the template and microchannel to bond them
Positive photoresist AZ1505 MicroChemicals AZ1505
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P3786 added to MOPS 1x
Prusa curing and Washing machine CW1S Prusa used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold
Prusa Resin – Tough Prusa Research a.s. UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing
Prusa SL1 3d printer Prusa used to print the mold
Scale VWR-CH 611-2605 used to weight PDMS mixture
Silicon wafer (10 cm) Silicon Materials Inc. N/Phos <100> 1-10 Ω cm
Süss MA6 Mask aligner SUSS MicroTec Group used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate
Sylgard 184 Dow Corning silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01 Technic chromium etchant
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma Aldrich 448931 used to silianize the 3D printed mold
TWEEN 20 Sigma Aldrich P1379 used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process
Veeco Dektak 6 M Veeco profilometer
VTC-100 Vacuum Spin Coater MTI corporation vacuum spin coater

References

  1. Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
  2. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
  3. Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
  4. Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
  5. Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
  6. Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
  7. Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
  8. Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
  9. Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
  10. Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
  11. Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
  12. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
  13. Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
  14. Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
  15. Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
  16. Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
  17. Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
  18. Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
  19. Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).

Play Video

Cite This Article
Pioli, R., Stocker, R., Isa, L., Secchi, E. Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (177), e63131, doi:10.3791/63131 (2021).

View Video