Моделирование микроорганизмов и микрочастиц с помощью последовательной сборки с помощью капиллярности
Summary
Мы представляем технологию, которая использует сборку с помощью капиллярности в микрофлюидной платформе для формирования микроразмерных объектов, взвешенных в жидкости, таких как бактерии и коллоиды, в предписанные массивы на полидиметилсилоксановой подложке.
Abstract
Контролируемое формирование микроорганизмов в определенные пространственные механизмы предлагает уникальные возможности для широкого спектра биологических применений, включая исследования микробной физиологии и взаимодействий. На простейшем уровне точное пространственное моделирование микроорганизмов позволит получить надежную, долгосрочную визуализацию большого количества отдельных клеток и трансформирует способность количественно изучать зависящие от расстояния взаимодействия микробов и микробов. Более уникально то, что соединение точного пространственного моделирования и полного контроля над условиями окружающей среды, как предлагает микрофлюидная технология, обеспечит мощную и универсальную платформу для одноклеточных исследований в микробной экологии.
В данной работе представлена микрофлюидная платформа для получения универсальных и определяемых пользователем паттернов микроорганизмов в микрофлюидном канале, обеспечивающая полный оптический доступ для долгосрочного высокопроизводительного мониторинга. Эта новая микрофлюидная технология основана на сборке частиц с помощью капиллярности и использует капиллярные силы, возникающие в результате контролируемого движения испаряющейся суспензии внутри микрофлюидного канала, для осаждения отдельных микроразмерных объектов в массиве ловушек, микрофабрикованных на подложке из полидиметилсилоксана (PDMS). Последовательные осаждения генерируют желаемое пространственное расположение одиночных или нескольких типов микроразмерных объектов, продиктованное исключительно геометрией ловушек и последовательностью заполнения.
Платформа была откалибрована с использованием коллоидных частиц различных размеров и материалов: она зарекомендовала себя как мощный инструмент для генерации разнообразных коллоидных паттернов и выполнения функционализации поверхности захваченных частиц. Кроме того, платформа была протестирована на микробных клетках, используя клетки Escherichia coli в качестве модельной бактерии. Тысячи отдельных клеток были структурированы на поверхности, и их рост контролировался с течением времени. В этой платформе связь одноклеточного осаждения и микрофлюидной технологии позволяет как геометрически моделировать микроорганизмы, так и точно контролировать условия окружающей среды. Таким образом, он открывает окно в физиологию отдельных микробов и экологию взаимодействий микроб-микроб, как показали предварительные эксперименты.
Introduction
Пространственное моделирование отдельных микроорганизмов, особенно в экспериментальных областях, которые обеспечивают полный контроль над условиями окружающей среды, такими как микрофлюидные устройства, крайне желательно в широком диапазоне контекстов. Например, организация микроорганизмов в регулярные массивы позволит точно визуализировать большое количество отдельных клеток и изучать их рост, физиологию, экспрессию генов в ответ на стимулы окружающей среды и восприимчивость к лекарственным средствам. Это также позволило бы изучать клеточно-клеточные взаимодействия, представляющие особый интерес в исследованиях клеточной связи (например, зондирование кворума), перекрестное кормление (например, водорослево-бактериальный симбиоз) или антагонизм (например, аллелопатия) с полным контролем над пространственной локализацией клеток относительно друг друга. Исследования клеточной физиологии и эволюции1, исследования взаимодействия клеток2, скрининг фенотипической дифференцировки3, мониторинг окружающей среды4 и скрининг лекарств5 относятся к числу областей, которые могут извлечь большую пользу из технологии, способной достичь такого количественного одноклеточного анализа.
В последние годы было предложено несколько стратегий изоляции и обработки отдельных клеток, от голографических оптических ловушек6 и методов функционализации гетерогенной поверхности7,8,9,10 до одноклеточных хемостатов11 и капельной микрофлюидики12. Эти методы либо технически очень требовательны, либо влияют на физиологию клеток и не обеспечивают высокопроизводительную платформу для моделирования микробов, которые можно изучать в течение длительных периодов времени, обеспечивая одноклеточное разрешение, полный оптический доступ и контроль над условиями окружающей среды. Целью данной статьи является описание платформы для моделирования бактерий с микрометрической точностью в предписанные пространственные расположения на поверхности PDMS посредством сборки с помощью капиллярности. Эта платформа обеспечивает точное и гибкое пространственное моделирование микробов и обеспечивает полный оптический доступ и контроль над условиями окружающей среды благодаря своей микрофлюидной природе.
Технология, лежащая в основе этой платформы, представляет собой технологию сборки, разработанную в последние годы, названную sCAPA13,14,15 (последовательная сборка частиц с помощью капиллярности), которая была интегрирована в микрофлюидную платформу16. Мениск испаряющейся капли жидкости, отступая над узорчатым полидиметилсилоксановым (PDMS) субстратом внутри микрофлюидного канала, оказывает капиллярные силы, которые задерживают отдельные коллоидные частицы, взвешенные в жидкости, в микрометрические скважины, микрофабрикованные на подложке (рисунок 1A). Взвешенные частицы сначала транспортируются к границе раздела воздух-жидкость конвективными токами, а затем помещаются в ловушки по капиллярности. Капиллярные силы, оказываемые движущимся мениском, действуют в большем масштабе по сравнению с силами, участвующими во взаимодействиях частиц.
Таким образом, на механизм сборки не влияют материал, размеры и поверхностные свойства частиц. Такие параметры, как концентрация частиц, скорость мениска, температура и поверхностное натяжение суспензии, являются единственными параметрами, которые влияют на выход процесса моделирования. Подробное описание влияния вышеуказанных параметров на процесс паттернирования читатель может найти в 13,14,15. В оригинальной технологии sCAPA13,14,15 процесс коллоидного моделирования осуществлялся в открытой системе и требовал высокоточной пьезоэлектрической ступени для привода подвески по шаблону. Эта платформа использует другую стратегию и позволяет выполнять моделирование с помощью стандартного оборудования, обычно используемого в микрофлюидике в контролируемой среде, тем самым сводя к минимуму риски загрязнения образцов.
Эта микрофлюидная платформа была сначала оптимизирована на коллоидных частицах для создания регулярных массивов инертных частиц, а затем успешно применена к бактериям. Обе микрофлюидные платформы описаны в этой статье (рисунок 1B,C). Большинство подготовительных этапов и экспериментальное оборудование, описанные в протоколе, являются общими для двух применений (рисунок 2). Мы сообщаем о коллоидном паттерне, чтобы продемонстрировать, что метод может быть использован для выполнения нескольких последовательных отложений на одной и той же поверхности для создания сложных, многоматериальных паттернов. В частности, на каждую ступень на каждую ловушку наносили одну частицу для формирования коллоидных массивов с определенной геометрией и составом, продиктованным исключительно геометрией ловушек и последовательностью заполнения. Что касается бактериальной структуры, то описываются единичные осаждения, в результате чего одна бактерия осаждается на каждую ловушку. Как только клетки получают рисунок на поверхности, микрофлюидный канал промывается средой для стимулирования роста бактерий, что является предварительным этапом любого одноклеточного исследования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микрофлюидная платформа, описанная здесь, позволяет структурировать микроразмерные объекты, такие как коллоиды и бактерии, в предписанные пространственные расположения на субстрате PDMS. Полный контроль над условиями окружающей среды, предлагаемый микрофлюидикой, и способность модел?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают поддержку со стороны гранта SNSF PRIMA 179834 (для E.S.), исследовательского гранта ETH-15 17-1 (R. S.) и премии Гордона и Бетти Мур Foundation Investigator Award по водному микробному симбиозу (грант GBMF9197) (R. S.). Авторы благодарят доктора Мигеля Анхеля Фернандеса-Родригеса (Университет Гранады, Испания) за визуализацию бактерий SEM и за проницательные дискуссии. Авторы благодарят д-ра Джен Нгуен (Университет Британской Колумбии, Канада), д-ра Лауру Альварес (ETH Zürich, Швейцария), Кэмерона Боггона (ETH Zürich, Швейцария) и д-ра Фабио Грилло за проницательные дискуссии.
Materials
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin – Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
