Modellazione di microrganismi e microparticelle attraverso l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità

La modellazione spaziale di singoli microrganismi, in particolare all’interno di arene sperimentali che consentono il pieno controllo sulle condizioni ambientali, come i dispositivi microfluidici, è altamente auspicabile in una vasta gamma di contesti. Ad esempio, organizzare i microrganismi in array regolari consentirebbe l’imaging accurato di un gran numero di singole cellule e lo studio della loro crescita, fisiologia, espressione genica in risposta a stimoli ambientali e suscettibilità ai farmaci. Consentirebbe inoltre di studiare le interazioni cellula-cellula di particolare interesse nella ricerca sulla comunicazione cellulare (ad esempio, quorum sensing), cross-feeding (ad esempio, simbiosi algale-batterica) o antagonismo (ad esempio, allelopatia), con pieno controllo sulla localizzazione spaziale delle cellule l’una rispetto all’altra. Gli studi di fisiologia ed evoluzione ^cellulare1, gli studi di interazione cellula-cellula2, lo screening fenotipico della ^{differenziazione3}, il monitoraggio ^ambientale4 e lo screening ^{farmacologico5} sono tra i campi che possono trarre grande beneficio da una tecnologia in grado di ottenere tale analisi quantitativa a singola cellula.

Negli ultimi anni sono state proposte diverse strategie per isolare e gestire singole cellule, dalle trappole ottiche ^olografiche6 e metodi di funzionalizzazione di superficie eterogenei7,8,9,10 ai chemiostati monocellulari11 e alla microfluidica delle goccioline12. Questi metodi sono tecnicamente molto impegnativi o influenzano la fisiologia cellulare e non riescono a fornire una piattaforma ad alto rendimento per modellare i microbi che possono essere studiati per lunghi periodi, garantendo la risoluzione a singola cellula, il pieno accesso ottico e il controllo sulle condizioni ambientali. L’obiettivo di questo documento è descrivere una piattaforma per modellare i batteri con precisione micrometrica in disposizioni spaziali prescritte su una superficie PDMS attraverso l’assemblaggio assistito dalla capillarità. Questa piattaforma consente una modellazione spaziale precisa e flessibile dei microbi e consente l’accesso ottico completo e il controllo delle condizioni ambientali, grazie alla sua natura microfluidica.

La tecnologia alla base di questa piattaforma è una tecnologia di assemblaggio sviluppata negli ultimi anni, denominata sCAPA13,14,15 (sequenziale capillarity-assisted particle assembly) che è stata integrata in una piattaforma microfluidica16. Il menisco di una goccia liquida evaporante, mentre si ritira su un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) modellato all’interno di un canale microfluidico, esercita forze capillari che intrappolano le singole particelle colloidali sospese nel liquido in pozzi micrometrici microfabbricati sul substrato (Figura 1A). Le particelle sospese vengono prima trasportate all’interfaccia aria-liquido da correnti convettive e quindi collocate nelle trappole per capillarità. Le forze capillari esercitate dal menisco in movimento agiscono su una scala più ampia rispetto alle forze coinvolte nelle interazioni particellarie.

Pertanto, il meccanismo di assemblaggio non è influenzato dal materiale, dalle dimensioni e dalle proprietà superficiali delle particelle. Parametri come la concentrazione delle particelle, la velocità del menisco, la temperatura e la tensione superficiale della sospensione sono gli unici parametri che influenzano la resa del processo di patterning. Il lettore può trovare una descrizione dettagliata dell’influenza dei suddetti parametri sul processo di patterning in13,14,15. Nella tecnologia sCAPA originale13,14,15, il processo di pattern colloidale veniva eseguito in un sistema aperto e richiedeva uno stadio piezoelettrico ad alta precisione per guidare la sospensione attraverso il modello. Questa piattaforma sfrutta una strategia diversa e consente di effettuare il patterning con apparecchiature standard generalmente utilizzate in microfluidica in ambiente controllato, riducendo così al minimo i rischi di contaminazione dei campioni.

Questa piattaforma microfluidica è stata inizialmente ottimizzata su particelle colloidali per creare matrici regolari di particelle inerti e poi applicata con successo ai batteri. Entrambe le piattaforme microfluidiche sono descritte in questo articolo (Figura 1B,C). La maggior parte delle fasi preparatorie e le apparecchiature sperimentali descritte nel protocollo sono comuni per le due applicazioni (Figura 2). Riportiamo modelli colloidali per dimostrare che la tecnica può essere utilizzata per eseguire più deposizioni sequenziali sulla stessa superficie per creare modelli complessi e multimateriali. In particolare, una singola particella è stata depositata per trappola per ogni passo per formare matrici colloidali con una geometria e una composizione specifiche, dettate esclusivamente dalla geometria e dalla sequenza di riempimento delle trappole. Per quanto riguarda il pattern batterico, vengono descritte singole deposizioni, con conseguente deposito di un batterio per trappola. Una volta che le cellule sono modellate sulla superficie, il canale microfluidico viene lavato con il mezzo per promuovere la crescita batterica, la fase preliminare di qualsiasi studio a singola cellula.