Живая визуализация и количественная оценка вирусной инфекции у трансгенных мышей K18 hACE2 с использованием репортер-экспрессирующего рекомбинантного SARS-CoV-2

Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) представляет собой оболочку, с положительным чувством, одноцепочечный РНК-вирус, который принадлежит к линии бетакоронавирусов в семействе Coronaviridae ¹. Это вирусное семейство делится на альфа-, бета-, гамма- и дельта-коронавирус¹. Альфа- и бетакоронавирусы в основном заражают млекопитающих, тогда как гамма- и дельтакоронавирусы заражают почти исключительно птиц². На сегодняшний день семь коронавирусов (CoV) пересекли видовые барьеры и стали коронавирусами человека (HCoV): два альфа-CoV (HCoV-229E и HCoV-NL63) и пять бета-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, коронавирус ближневосточного респираторного синдрома [MERS-CoV] и SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2 являются высокопатогенными, вызывая тяжелую инфекцию нижних дыхательных путей⁷. До появления SARS-CoV-2 было две эпидемические вспышки, вызванные CoVs: SARS-CoV в Провинции Гуандун, Китай, с 2002 по 2003 год, с коэффициентом летальности (CFR) около 9,7%; и БВРС-КоВ на Ближнем Востоке с 2012 г. по настоящее время, при этом CFR составляет около 34%^7,8. SARS-CoV-2 имеет общий CFR между 3,4% -49%, при этом базовые условия способствуют более высокому CFR ^8,9. С момента своего открытия в декабре 2019 года в Ухане, Китай, SARS-CoV-2 был ответственен за более чем 242 миллиона случаев инфицирования людей и более 4,9 миллиона человеческих смертей во всем мире 7,10,11,12. Примечательно, что с конца 2020 года новые вызывающие озабоченность варианты SARS-CoV-2 (VoC) и интересующие их варианты (VoI) повлияли на характеристики вируса, включая передачу и антигенность ^9,13, а также на общее направление пандемии COVID-19. Для лечения инфекций SARS-CoV-2 в настоящее время существует только один Соединенные Штаты (США). Терапевтический противовирусный препарат Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) (ремдесивир) и один препарат с разрешением на экстренное использование (EUA) (барицитиниб, вводимый в комбинации с ремдесивиром)¹⁴. Существует также 6 одобренных моноклональных антител EUA: REGEN-COV (казиривимаб и имдевимаб, вводимые вместе), сотровимаб, тоцилизумаб, бамланивимаб и этесевимаб, вводимые вместе 15,16,17,18,19. В настоящее время существует только одна одобренная FDA профилактическая вакцина, Pfizer-BioNTech, и две другие профилактические вакцины (Moderna и Janssen) были одобрены EUA 20,21,22,23,24. Однако при неконтролируемом уровне инфицирования и появлении VoC и VoI SARS-CoV-2 по-прежнему представляет угрозу для здоровья человека. Поэтому срочно необходимы новые подходы для выявления эффективных профилактических и терапевтических средств для борьбы с инфекцией SARS-CoV-2 и все еще продолжающейся пандемией COVID-19.

Изучение SARS-CoV-2 требует трудоемких методов и вторичных подходов для выявления присутствия вируса в инфицированных клетках и / или проверенных животных моделях инфекции. Использование обратной генетики позволило генерации рекомбинантных вирусов ответить на важные вопросы биологии вирусных инфекций. Например, методы обратной генетики предоставили средства для выявления и понимания механизмов вирусной инфекции, патогенеза и болезни. Аналогичным образом, подходы обратной генетики проложили путь к разработке рекомбинантных вирусов, лишенных вирусных белков, чтобы понять их вклад в вирусный патогенез. Кроме того, методы обратной генетики были использованы для генерации рекомбинантных вирусов, экспрессирующих репортерные гены для применения in vitro и in vivo, включая выявление профилактических и/или терапевтических подходов к лечению вирусных инфекций. Флуоресцентные и биолюминесцентные белки являются наиболее часто используемыми репортерными генами из-за их чувствительности, стабильности и легкости обнаружения на основе совершенствования новых технологий^25,26. Было показано, что флуоресцентные белки in vitro служат лучшим вариантом локализации вирусов в инфицированных клетках, в то время как люциферазы более удобны для количественных исследований 27,28,29. In vivo люциферазы предпочтительнее флуоресцентных белков для визуализации целых животных, в то время как флуоресцентные белки предпочтительны для идентификации инфицированных клеток или визуализации ex vivo 30,31,32. Использование репортер-экспрессирующих рекомбинантных вирусов послужило мощным инструментом для изучения вирусов во многих семействах, включая, среди прочего, флавивирусы, энтеровирусы, альфавирусы, лентивирусы, аренавирусы и вирусы гриппа 28,33,34,35,36.

Чтобы преодолеть потребность во вторичных подходах к изучению SARS-CoV-2 и охарактеризовать инфекцию SARS-CoV-2 in vivo в реальном времени, мы создали репликационно-компетентный рекомбинантный (r)SARS-CoV-2, который экспрессирует биолюминесцентные (нанолюциферазы, Nluc) или флуоресцентные (Венера) белки, используя нашу ранее описанную обратную генетику на основе бактериальных искусственных хромосом (BAC), которые поддерживаются как единая копия в E. colili с целью минимизации токсичности последовательностей вируса при его размножении в бактериях^37,38. Примечательно, что rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus показали rSARS-CoV-2/WT-подобную патогенность in vivo. Высокий уровень экспрессии Венеры от rSARS-CoV-2/Venus позволил обнаружить вирусную инфекцию в легких инфицированных трансгенных мышей K18 hACE2 с помощью системы визуализации in vivo (IVIS)³⁹. Уровни экспрессии Венеры хорошо коррелировали с вирусными титрами, обнаруженными в легких, демонстрируя возможность использования экспрессии Венеры в качестве действительного суррогата инфекции SARS-CoV-2. Используя rSARS-CoV-2/Nluc, мы смогли отслеживать динамику вирусной инфекции в режиме реального времени и продольно оценивать инфекцию SARS-CoV-2 in vivo, используя тот же подход IVIS у трансгенных мышей K18 hACE2.