Summary

Imaging dal vivo e quantificazione dell'infezione virale in topi transgenici K18 hACE2 utilizzando SARS-CoV-2 ricombinante che esprime reporter

Published: November 05, 2021
doi:

Summary

Questo protocollo descrive la dinamica delle infezioni virali utilizzando la luciferasi e la fluorescenza che esprimono la ricombinante (r)SARS-CoV-2 e un sistema di imaging in vivo (IVIS) in topi transgenici K18 hACE2 per superare la necessità di approcci secondari necessari per studiare le infezioni da SARS-CoV-2 in vivo.

Abstract

La pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19) è stata causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Ad oggi, SARS-CoV-2 è stato responsabile di oltre 242 milioni di infezioni e più di 4,9 milioni di morti in tutto il mondo. Analogamente ad altri virus, lo studio del SARS-CoV-2 richiede l’uso di metodi sperimentali per rilevare la presenza di virus in cellule infette e/o in modelli animali. Per superare questa limitazione, abbiamo generato una ricombinante (r)SARS-CoV-2 competente per la replicazione che esprime proteine bioluminescenti (nanoluciferasi, Nluc) o fluorescenti (Venus). Questi rSARS-CoV-2 che esprimono reporter consentono di tracciare le infezioni virali in vitro e in vivo sulla base dell’espressione dei geni reporter Nluc e Venus. Qui lo studio descrive l’uso di rSARS-CoV-2 / Nluc e rSARS-CoV-2 / Venere per rilevare e tracciare l’infezione da SARS-CoV-2 nell’enzima murino transgenico K18 K18 umano di conversione dell’angiotensina 2 (hACE2) precedentemente descritto utilizzando sistemi di imaging in vivo (IVIS). Questo rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus mostrano patogenicità rSARS-CoV-2/WT-like e replicazione virale in vivo. È importante sottolineare che l’espressione di Nluc e Venere ci consente di tracciare direttamente le infezioni virali in vivo ed ex vivo, nei topi infetti. Questi rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus rappresentano un’opzione eccellente per studiare la biologia di SARS-CoV-2 in vivo, per comprendere l’infezione virale e la malattia COVID-19 associata e per identificare efficaci trattamenti profilattici e / o terapeutici per combattere l’infezione da SARS-CoV-2.

Introduction

La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è un virus a RNA avvolto, a senso positivo, a singolo filamento che appartiene al lignaggio Betacoronavirus della famiglia Coronaviridae 1. Questa famiglia virale è divisa in Alpha-, Beta-, Gamma-, e Delta-coronavirus1. Gli alfa e i betacoronavirus infettano principalmente i mammiferi, mentre il gamma e il deltacoronavirus infettano quasi esclusivamente gli uccelli2. Ad oggi, sette coronavirus (CoV) hanno attraversato le barriere delle specie ed sono emersi come coronavirus umani (HCoV): due alfa-CoV (HCoV-229E e HCoV-NL63) e cinque beta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, coronavirus della sindrome respiratoria del Medio Oriente [MERS-CoV] e SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2 sono altamente patogeni, causando gravi infezioni del tratto respiratorio inferiore7. Prima dell’emergere di SARS-CoV-2, ci sono stati due focolai epidemici causati da CoV: SARS-CoV a Guangdong Providence, in Cina, dal 2002 al 2003, con un tasso di mortalità dei casi (CFR) di circa il 9,7%; e MERS-CoV in Medio Oriente dal 2012 ad oggi, con un CFR di circa il 34%7,8. SARS-CoV-2 ha un CFR complessivo tra il 3,4% e il 49%, con condizioni sottostanti che contribuiscono a un CFR 8,9 più elevato. Dalla sua scoperta nel dicembre 2019, a Wuhan, in Cina, SARS-CoV-2 è stato responsabile di oltre 242 milioni di infezioni umane e oltre 4,9 milioni di morti umane in tutto il mondo 7,10,11,12. In particolare, dalla fine del 2020, le nuove varianti di preoccupazione (VoC) e le varianti di interesse (VoI) di SARS-CoV-2 hanno avuto un impatto sulle caratteristiche del virus, tra cui la trasmissione e l’antigenicità 9,13, e sulla direzione generale della pandemia di COVID-19. Per il trattamento delle infezioni da SARS-CoV-2, attualmente esiste un solo Stati Uniti (USA) Food and Drug Administration (FDA) antivirale terapeutico (remdesivir) e un farmaco di autorizzazione all’uso di emergenza (EUA) (baricitinib, da somministrare in combinazione con remdesivir)14. Ci sono anche 6 anticorpi monoclonali EUA approvati: REGEN-COV (casirivimab e imdevimab, somministrati insieme), sotrovimab, tocilizumab e bamlanivimab ed etesevimab somministrati insieme 15,16,17,18,19. Attualmente esiste un solo vaccino profilattico approvato dalla FDA, Pfizer-BioNTech, e altri due vaccini profilattici (Moderna e Janssen) sono stati approvati dall’EUA 20,21,22,23,24. Tuttavia, con il tasso di infezione incontrollato e l’emergere di VoC e VoI, SARS-CoV-2 rappresenta ancora una minaccia per la salute umana. Pertanto, sono urgentemente necessari nuovi approcci per identificare profilattici e terapie efficienti per controllare l’infezione da SARS-CoV-2 e la pandemia di COVID-19 ancora in corso.

Lo studio di SARS-CoV-2 richiede tecniche laboriose e approcci secondari per identificare la presenza del virus in cellule infette e/o modelli animali di infezione convalidati. L’uso della genetica inversa ha permesso la generazione di virus ricombinanti per rispondere a domande importanti nella biologia delle infezioni virali. Ad esempio, le tecniche di genetica inversa hanno fornito mezzi per scoprire e comprendere i meccanismi di infezione virale, patogenesi e malattia. Allo stesso modo, gli approcci di genetica inversa hanno spianato la strada all’ingegnerizzazione di virus ricombinanti privi di proteine virali per comprendere il loro contributo nella patogenesi virale. Inoltre, sono state utilizzate tecniche di genetica inversa per generare virus ricombinanti che esprimono geni reporter per applicazioni in vitro e in vivo, compresa l’identificazione di approcci profilattici e/o terapeutici per il trattamento delle infezioni virali. Le proteine fluorescenti e bioluminescenti sono i geni reporter più comunemente usati grazie alla loro sensibilità, stabilità e facilità di rilevamento basata sul miglioramento delle nuove tecnologie25,26. In vitro, le proteine fluorescenti hanno dimostrato di servire come opzione migliore per la localizzazione dei virus nelle cellule infette, mentre le luciferasi sono più convenienti per gli studi di quantificazione 27,28,29. In vivo, le luciferasi sono preferite rispetto alle proteine fluorescenti per l’imaging di animali interi, mentre le proteine fluorescenti sono preferite per l’identificazione di cellule infette o l’imaging ex vivo 30,31,32. L’uso di virus ricombinanti che esprimono reporter è servito come un potente strumento per lo studio dei virus in molte famiglie, tra cui, tra gli altri, flavivirus, enterovirus, alfavirus, lentivirus, arenavirus e virus dell’influenza 28,33,34,35,36.

Per superare la necessità di approcci secondari per studiare SARS-CoV-2 e caratterizzare l’infezione da SARS-CoV-2 in tempo reale in vivo, abbiamo generato una riproduzione ricombinante (r)SARS-CoV-2 competente per la replicazione che esprime proteine bioluminescenti (nanoluciferasi, Nluc) o fluorescenti (Venere) utilizzando la nostra genetica inversa basata su cromosomi artificiali batterici (BAC) precedentemente descritta, che viene mantenuta come una singola copia in E. coli al fine di ridurre al minimo la tossicità delle sequenze virali durante la sua propagazione nei batteri37,38. In particolare, rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus hanno mostrato patogenicità simile a rSARS-CoV-2/WT in vivo. L’alto livello di espressione di Venere da rSARS-CoV-2 /Venere ha permesso di rilevare l’infezione virale nei polmoni di topi transgenici K18 hACE2 infetti utilizzando un sistema di imaging in vivo (IVIS)39. I livelli di espressione di Venere si correlavano bene con i titoli virali rilevati nei polmoni, dimostrando la fattibilità dell’uso dell’espressione di Venere come valido surrogato dell’infezione da SARS-CoV-2. Utilizzando rSARS-CoV-2/Nluc, siamo stati in grado di tracciare la dinamica dell’infezione virale in tempo reale e valutare longitudinalmente l’infezione da SARS-CoV-2 in vivo utilizzando lo stesso approccio IVIS nei topi transgenici K18 hACE2.

Protocol

I protocolli che coinvolgono topi transgenici K18 hACE2 sono stati approvati dal Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) e dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Tutti gli esperimenti seguono le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio del Consiglio Nazionale delleRicerche 40. Il dispositivo di protezione individuale (DPI) appropriato è necessario quando si lavora con i topi. <p class="…

Representative Results

Infezione da rSARS-CoV-2/Nluc in topi transgenici K18 hACE2 (Figure 1 e 2)La Figura 1A mostra una rappresentazione schematica di rSARS-CoV-2/WT (in alto) e rSARS-CoV-2/Nluc (in basso) utilizzati per valutare le infezioni in vivo. La Figura 1B mostra il diagramma di flusso schematico applicato per valutare la dinamica dell’infezione da rSARS-CoV-2/Nluc nei topi transgenici K18 hACE2. Top…

Discussion

Questo protocollo dimostra la fattibilità dell’utilizzo di questi geni reporter che esprimono rSARS-CoV-2 per monitorare le infezioni virali in vivo. Entrambi i virus ricombinanti che esprimono reporter forniscono uno strumento eccellente per studiare le infezioni da SARS-CoV-2 in vivo. I sistemi di imaging ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) descritti rappresentano un’ottima opzione per comprendere le dinamiche dell’infezione da SARS-CoV-2, la patogenesi virale e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare i membri del nostro istituto (Texas Biomedical Research Institute) per i loro sforzi nel mantenere le nostre strutture pienamente operative e sicure durante la pandemia di COVID-19. Vorremmo anche ringraziare il nostro Comitato istituzionale per la biosicurezza (IBC) e spell (IACUC) per aver rivisto i nostri protocolli in modo efficiente in termini di tempo. Ringraziamo il Dr. Thomas Moran della Icahn School of Medicine del Mount Sinai per aver fornito l’anticorpo monoclonale della proteina nucleocapsside (N) cross-reattivo 1C7C7 SARS-CoV. La ricerca SARS-CoV-2 nel laboratorio di Martinez-Sobrido è attualmente supportata dalle sovvenzioni NIAID / NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 e R43AI165089-01; il Dipartimento della Difesa (DoD) concede W81XWH2110095 e W81XWH2110103; la San Antonio Partnership for Precision Therapeutic; il Texas Biomedical Research Institute Forum; l’Università del Texas Health Science Center di San Antonio; la San Antonio Medical Foundation; e dal Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), un Centro di eccellenza per la ricerca e la risposta all’influenza finanziato dal NIAID (CEIRR, contratto # 75N93021C00014).

Materials

0.5% Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at room temperature (RT)
1% DEAE-Dextran MP Biomedicals 195133
10% Formalin solution, neutral buffered Sigma-Aldrich HT501128
Agar Oxoid LP0028
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
5% Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S-5761
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) ATCC CRL-1586
Ami HT Spectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0 Spectral Instruments Imaging Image analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Anesthesia gas machine Veterinary Anesthesia Systems, Inc. VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice The Jackson Laboratory 34860
Graphpad Prism Version 9.1.0 GraphPad
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at RT
MARS Data Analysis Software BMG LABTECH
MB10 tablets QUIP Laboratories MBTAB1.5 Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
PHERAstar FSX BMG LABTECH PHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL Bertin Instruments P000940-LYSK0-A
T75 EasYFlask ThermoFisher Scientific 156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase Vector Laboratories PK-4002 ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit

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Morales Vasquez, D., Chiem, K., Silvas, J., Park, J., Ye, C., Martínez-Sobrido, L. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (177), e63127, doi:10.3791/63127 (2021).

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