Questo protocollo descrive la dinamica delle infezioni virali utilizzando la luciferasi e la fluorescenza che esprimono la ricombinante (r)SARS-CoV-2 e un sistema di imaging in vivo (IVIS) in topi transgenici K18 hACE2 per superare la necessità di approcci secondari necessari per studiare le infezioni da SARS-CoV-2 in vivo.
La pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19) è stata causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Ad oggi, SARS-CoV-2 è stato responsabile di oltre 242 milioni di infezioni e più di 4,9 milioni di morti in tutto il mondo. Analogamente ad altri virus, lo studio del SARS-CoV-2 richiede l’uso di metodi sperimentali per rilevare la presenza di virus in cellule infette e/o in modelli animali. Per superare questa limitazione, abbiamo generato una ricombinante (r)SARS-CoV-2 competente per la replicazione che esprime proteine bioluminescenti (nanoluciferasi, Nluc) o fluorescenti (Venus). Questi rSARS-CoV-2 che esprimono reporter consentono di tracciare le infezioni virali in vitro e in vivo sulla base dell’espressione dei geni reporter Nluc e Venus. Qui lo studio descrive l’uso di rSARS-CoV-2 / Nluc e rSARS-CoV-2 / Venere per rilevare e tracciare l’infezione da SARS-CoV-2 nell’enzima murino transgenico K18 K18 umano di conversione dell’angiotensina 2 (hACE2) precedentemente descritto utilizzando sistemi di imaging in vivo (IVIS). Questo rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus mostrano patogenicità rSARS-CoV-2/WT-like e replicazione virale in vivo. È importante sottolineare che l’espressione di Nluc e Venere ci consente di tracciare direttamente le infezioni virali in vivo ed ex vivo, nei topi infetti. Questi rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus rappresentano un’opzione eccellente per studiare la biologia di SARS-CoV-2 in vivo, per comprendere l’infezione virale e la malattia COVID-19 associata e per identificare efficaci trattamenti profilattici e / o terapeutici per combattere l’infezione da SARS-CoV-2.
La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è un virus a RNA avvolto, a senso positivo, a singolo filamento che appartiene al lignaggio Betacoronavirus della famiglia Coronaviridae 1. Questa famiglia virale è divisa in Alpha-, Beta-, Gamma-, e Delta-coronavirus1. Gli alfa e i betacoronavirus infettano principalmente i mammiferi, mentre il gamma e il deltacoronavirus infettano quasi esclusivamente gli uccelli2. Ad oggi, sette coronavirus (CoV) hanno attraversato le barriere delle specie ed sono emersi come coronavirus umani (HCoV): due alfa-CoV (HCoV-229E e HCoV-NL63) e cinque beta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, coronavirus della sindrome respiratoria del Medio Oriente [MERS-CoV] e SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2 sono altamente patogeni, causando gravi infezioni del tratto respiratorio inferiore7. Prima dell’emergere di SARS-CoV-2, ci sono stati due focolai epidemici causati da CoV: SARS-CoV a Guangdong Providence, in Cina, dal 2002 al 2003, con un tasso di mortalità dei casi (CFR) di circa il 9,7%; e MERS-CoV in Medio Oriente dal 2012 ad oggi, con un CFR di circa il 34%7,8. SARS-CoV-2 ha un CFR complessivo tra il 3,4% e il 49%, con condizioni sottostanti che contribuiscono a un CFR 8,9 più elevato. Dalla sua scoperta nel dicembre 2019, a Wuhan, in Cina, SARS-CoV-2 è stato responsabile di oltre 242 milioni di infezioni umane e oltre 4,9 milioni di morti umane in tutto il mondo 7,10,11,12. In particolare, dalla fine del 2020, le nuove varianti di preoccupazione (VoC) e le varianti di interesse (VoI) di SARS-CoV-2 hanno avuto un impatto sulle caratteristiche del virus, tra cui la trasmissione e l’antigenicità 9,13, e sulla direzione generale della pandemia di COVID-19. Per il trattamento delle infezioni da SARS-CoV-2, attualmente esiste un solo Stati Uniti (USA) Food and Drug Administration (FDA) antivirale terapeutico (remdesivir) e un farmaco di autorizzazione all’uso di emergenza (EUA) (baricitinib, da somministrare in combinazione con remdesivir)14. Ci sono anche 6 anticorpi monoclonali EUA approvati: REGEN-COV (casirivimab e imdevimab, somministrati insieme), sotrovimab, tocilizumab e bamlanivimab ed etesevimab somministrati insieme 15,16,17,18,19. Attualmente esiste un solo vaccino profilattico approvato dalla FDA, Pfizer-BioNTech, e altri due vaccini profilattici (Moderna e Janssen) sono stati approvati dall’EUA 20,21,22,23,24. Tuttavia, con il tasso di infezione incontrollato e l’emergere di VoC e VoI, SARS-CoV-2 rappresenta ancora una minaccia per la salute umana. Pertanto, sono urgentemente necessari nuovi approcci per identificare profilattici e terapie efficienti per controllare l’infezione da SARS-CoV-2 e la pandemia di COVID-19 ancora in corso.
Lo studio di SARS-CoV-2 richiede tecniche laboriose e approcci secondari per identificare la presenza del virus in cellule infette e/o modelli animali di infezione convalidati. L’uso della genetica inversa ha permesso la generazione di virus ricombinanti per rispondere a domande importanti nella biologia delle infezioni virali. Ad esempio, le tecniche di genetica inversa hanno fornito mezzi per scoprire e comprendere i meccanismi di infezione virale, patogenesi e malattia. Allo stesso modo, gli approcci di genetica inversa hanno spianato la strada all’ingegnerizzazione di virus ricombinanti privi di proteine virali per comprendere il loro contributo nella patogenesi virale. Inoltre, sono state utilizzate tecniche di genetica inversa per generare virus ricombinanti che esprimono geni reporter per applicazioni in vitro e in vivo, compresa l’identificazione di approcci profilattici e/o terapeutici per il trattamento delle infezioni virali. Le proteine fluorescenti e bioluminescenti sono i geni reporter più comunemente usati grazie alla loro sensibilità, stabilità e facilità di rilevamento basata sul miglioramento delle nuove tecnologie25,26. In vitro, le proteine fluorescenti hanno dimostrato di servire come opzione migliore per la localizzazione dei virus nelle cellule infette, mentre le luciferasi sono più convenienti per gli studi di quantificazione 27,28,29. In vivo, le luciferasi sono preferite rispetto alle proteine fluorescenti per l’imaging di animali interi, mentre le proteine fluorescenti sono preferite per l’identificazione di cellule infette o l’imaging ex vivo 30,31,32. L’uso di virus ricombinanti che esprimono reporter è servito come un potente strumento per lo studio dei virus in molte famiglie, tra cui, tra gli altri, flavivirus, enterovirus, alfavirus, lentivirus, arenavirus e virus dell’influenza 28,33,34,35,36.
Per superare la necessità di approcci secondari per studiare SARS-CoV-2 e caratterizzare l’infezione da SARS-CoV-2 in tempo reale in vivo, abbiamo generato una riproduzione ricombinante (r)SARS-CoV-2 competente per la replicazione che esprime proteine bioluminescenti (nanoluciferasi, Nluc) o fluorescenti (Venere) utilizzando la nostra genetica inversa basata su cromosomi artificiali batterici (BAC) precedentemente descritta, che viene mantenuta come una singola copia in E. coli al fine di ridurre al minimo la tossicità delle sequenze virali durante la sua propagazione nei batteri37,38. In particolare, rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus hanno mostrato patogenicità simile a rSARS-CoV-2/WT in vivo. L’alto livello di espressione di Venere da rSARS-CoV-2 /Venere ha permesso di rilevare l’infezione virale nei polmoni di topi transgenici K18 hACE2 infetti utilizzando un sistema di imaging in vivo (IVIS)39. I livelli di espressione di Venere si correlavano bene con i titoli virali rilevati nei polmoni, dimostrando la fattibilità dell’uso dell’espressione di Venere come valido surrogato dell’infezione da SARS-CoV-2. Utilizzando rSARS-CoV-2/Nluc, siamo stati in grado di tracciare la dinamica dell’infezione virale in tempo reale e valutare longitudinalmente l’infezione da SARS-CoV-2 in vivo utilizzando lo stesso approccio IVIS nei topi transgenici K18 hACE2.
Questo protocollo dimostra la fattibilità dell’utilizzo di questi geni reporter che esprimono rSARS-CoV-2 per monitorare le infezioni virali in vivo. Entrambi i virus ricombinanti che esprimono reporter forniscono uno strumento eccellente per studiare le infezioni da SARS-CoV-2 in vivo. I sistemi di imaging ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) descritti rappresentano un’ottima opzione per comprendere le dinamiche dell’infezione da SARS-CoV-2, la patogenesi virale e…
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare i membri del nostro istituto (Texas Biomedical Research Institute) per i loro sforzi nel mantenere le nostre strutture pienamente operative e sicure durante la pandemia di COVID-19. Vorremmo anche ringraziare il nostro Comitato istituzionale per la biosicurezza (IBC) e spell (IACUC) per aver rivisto i nostri protocolli in modo efficiente in termini di tempo. Ringraziamo il Dr. Thomas Moran della Icahn School of Medicine del Mount Sinai per aver fornito l’anticorpo monoclonale della proteina nucleocapsside (N) cross-reattivo 1C7C7 SARS-CoV. La ricerca SARS-CoV-2 nel laboratorio di Martinez-Sobrido è attualmente supportata dalle sovvenzioni NIAID / NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 e R43AI165089-01; il Dipartimento della Difesa (DoD) concede W81XWH2110095 e W81XWH2110103; la San Antonio Partnership for Precision Therapeutic; il Texas Biomedical Research Institute Forum; l’Università del Texas Health Science Center di San Antonio; la San Antonio Medical Foundation; e dal Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), un Centro di eccellenza per la ricerca e la risposta all’influenza finanziato dal NIAID (CEIRR, contratto # 75N93021C00014).
0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at room temperature (RT) |
1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
10% Formalin solution, neutral buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Agar | Oxoid | LP0028 | |
24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
5% Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S-5761 | |
6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Image analysis software | |
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
Anesthesia gas machine | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice | The Jackson Laboratory | 34860 | |
Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at RT |
MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Store at RT |
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
Precelleys Evolution homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit |