כימות של פרמטרי כלי דם ברשתיות הר שלמות של עכברים עם רטינופתיות שאינן מתרבות ושגשוגות
Summary
מאמר זה מתאר בדיקת כתמי לציטין מבוססת וניתן לשחזור עבור כל ההכנות לרשתית ההר ואת הפרוטוקולים הנדרשים למדידה כמותית של פרמטרים וסקולריים משתנים לעתים קרובות ברטינופתיות שגשוג ולא מתרבות.
Abstract
רטינופתיות הן קבוצה הטרוגנית של מחלות המשפיעות על הרקמה הנוירו-חושית של העין. הם מאופיינים על ידי ניוון עצבי, גליוזיס ושינוי הדרגתי בתפקוד כלי הדם ובמבנה. למרות תחילת הרטינופתיות מאופיינת בהפרעות עדינות בתפיסה החזותית, השינויים בקליעת כלי הדם הם הסימנים הראשונים שזוהו על ידי קלינאים. היעדר או נוכחות של ניאווסקולריזציה קובע אם הרטינופתיה מסווגת כלא-התפשטות (NPDR) או להתרבות (PDR). במובן זה, מספר מודלים של בעלי חיים ניסו לחקות תכונות כלי דם ספציפיות של כל שלב כדי לקבוע את המנגנונים הבסיסיים המעורבים בשינויים אנדותל, מוות עצבי ואירועים אחרים המתרחשים ברשתית. במאמר זה, אנו נספק תיאור מלא של ההליכים הנדרשים למדידת הפרמטרים של כלי הדם ברשתית אצל מבוגרים ועכברי לידה מוקדמת ביום שלאחר הלידה (P)17. אנו נפרט את הפרוטוקולים לביצוע כתמי כלי דם ברשתית עם Isolectin GSA-IB4 בהרים שלמים להדמיה מיקרוסקופית מאוחרת יותר. צעדים מרכזיים לעיבוד תמונה עם תוכנת Image J Fiji מסופקים גם הם, ולכן, הקוראים יוכלו למדוד את צפיפות כלי הדם, הקוטר והטורטואוזיות, הסתעפות כלי הדם, כמו גם אזורים וסקולריים וניאווסקולריים. כלים אלה מועילים מאוד כדי להעריך ולכמת שינויים בכלי הדם הן רטינופתיות שאינן מתרבות והן התפשטות.
Introduction
העיניים ניזונות משני מערכת עורקים-ורידים: כלי הדם הכורואידיים, רשת כלי דם חיצונית המשקה אפיתל פיגמנטי ברשתית ופוטותרפטורים; ואת כלי הדם הנוירו-רשתיים המשקים את שכבת תאי הגנגליון ואת השכבה הגרעינית הפנימית של הרשתית1. כלי הדם ברשתית היא רשת מאורגנת של כלי שיט המספקים חומרים מזינים וחמצן לתאי הרשתית ומוצרי פסולת קציר כדי להבטיח העברת איתות חזותית נכונה. כלי דם זה יש כמה תכונות ברורות, כולל: חוסר innervation אוטונומי, הרגולציה של טון כלי הדם על ידי מנגנוני רשתית פנימית והחזקת מחסום דם רשתית מורכב2. לכן, כלי דם ברשתית היה המוקד של חוקרים רבים אשר חקרו בהרחבה לא רק vasculogenesis במהלך הפיתוח, אלא גם את השינויים ואת אנגיוגנזה פתולוגית כי כלי אלה עוברים במחלות3. השינויים הסקולריים הנפוצים ביותר שנצפו ברטינופתיות הם הרחבת כלי דם, ניאווסקולריזציה, אובדן ארבוריזציה וסקולרית ועיוות של כלי הדם הראשיים ברשתית, מה שהופך אותם יותר זיגאגי4,5,6. אחד או יותר מהשינויים המתוארים הם הסימנים המוקדמים ביותר שזוהו על ידי רופאים. הדמיה וסקולרית מספקת שיטת סינון מהירה, לא פולשנית וזולה7. המחקר הנרחב של השינויים שנצפו בעץ כלי הדם יקבע אם הרטינופתיה אינה מתרבה או מתרבה והטיפול הנוסף. רטינופתיות שאינן מתרבות יכולות להתבטא עם מורפולוגיה כלי דם חריגה, ירידה בצפיפות כלי הדם, נימים תאיים, מוות pericytes, בצקת מקולרית, בין היתר. בנוסף, רטינופתיות שגשוג גם לפתח חדירות כלי דם מוגברת, שיפוץ חוץ תאי, ואת היווצרות של tufts כלי דם לכיוון חלל הזגוגית כי בקלות התמוטטות או לגרום ניתוק רשתית8.
לאחר שזוהה, ניתן לעקוב אחר רטינופתיה באמצעות שינויי כלי הדם שלה9,10. התקדמות הפתולוגיה ניתן לעקוב אחר שינויים מבניים של כלי הדם, אשר מגדירים בבירור את שלבי המחלה11. הכימות של שינויים בכלי הדם במודלים אלה אפשר לתאם שינויים בכלי הדם ומוות עצבי ולבדוק טיפולים תרופתיים לחולים בשלבים שונים של המחלה.
לאור ההצהרות לעיל, אנו רואים כי ההכרה והכימות של שינויים בכלי הדם הם בסיסיים במחקרי רטינופתיה. בעבודה זו, נראה כיצד למדוד פרמטרים שונים של כלי הדם. כדי לעשות זאת, נשתמש בשני מודלים של בעלי חיים. אחד מהם הוא מודל העכבר רטינופתיה המושרה חמצן12, אשר מחקה רטינופתיה של פגות וכמה היבטים של רטינופתיה סוכרתית מתרבה13,14. במודל זה, נמדוד אזורים וסקולריים, אזורים ניאו-וסקולריים והרחבה וטורטואוזיות של כלי הדם העיקריים. במעבדה שלנו, פותח מודל עכבר תסמונת מטבולית (MetS), אשר גורם רטינופתיה לא שגשוג15. כאן, נעריך את צפיפות כלי הדם ואת ההסתעפות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודלים מן החי של רטינופתיות הם כלים רבי עוצמה לחקר התפתחות כלי הדם, שיפוץ או אנגיוגנזה פתולוגית. ההצלחה של מחקרים אלה בתחום מסתמכת על הגישה הקלה לרקמה המאפשרת לבצע מגוון רחב של טכניקות, ומספקת נתונים מ- in vivo ועכברים לאחר המוות26,27. יתר על כן, נמצא מתא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לקרלוס מאס, מריה פילאר קרספו וססיליה סמפדרו מ- CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, קורדובה, ארגנטינה) על הסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית, לסולדד מירו וויקטוריה בלנקו על טיפול מסור בבעלי חיים ולורה גטיקה על סיוע היסטולוגי. אנו מודים גם לויקטור דיאז (פרו-מזכיר התקשורת המוסדית של FCQ) על הפקת הווידאו והמהדורה ופול הובסון על הקריאה הביקורתית שלו ותיקון השפה של כתב היד.
מאמר זה מומן על ידי מענקים מ Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (all to M.C.S.).
Materials
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D. Autonomic control of the eye. Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
- Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).
- Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).
- Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
- Lechner, J., O’Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
- Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
- Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
- Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
- Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362 (2016).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
- Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
- Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
- Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).
- Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
- Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).
- Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
- Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).
