Mobil Tek Moleküllü FRET Problarının Otomatik İki Boyutlu Mekansal Analizi

1. Yazılım önkoşulları Miniconda Python dağıtımını yükleyin27 (minimum gerekli Python sürümü: 3.7). Windows Başlat menüsünde bir Anaconda istemi açın veya linux veya macOS kullanıyorsanız bir terminal açın ve conda activate yürütün. Aşağıdaki komutları yürüterek topluluk tarafından tutulan conda-forge paketi deposu28’i etkinleştirin:conda yapılandırması –kanal ekle conda-forgeconda yapılandırması –set channel_priority katıconda güncelleştirmesi –tümü Aşağıdakileri yürüterek gerekli Python paketlerini yükleyin:conda install opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab Analiz yazılımının kullanıcı arayüzü olan JupyterLab’ı tanımaya devam edin (yazılım belgelerine bakın29). Analiz yazılımını indirmek ve güncellemek için daha sonra kullanılacak git sürüm kontrol sistemini yükleyin. Linux kullanıyorsanız, indirmek ve güncellemek için dağıtımın paket yönetimi yazılımını kullanın. Aksi takdirde, yürütün:conda yükleme git İsteğe bağlı olarak, analiz sırasındaki adımları filtre ettikten sonra veri kümelerini görüntülemek için sepet Python paketini yükleyin:conda sepet kurmak 2. Numunelerin ölçümü Şekil 1: Görüntü Alma. (A) Heyecan sırası. 405 nm lazer kullanarak boya yüklü bir hücrenin isteğe bağlı görüntüsünü kaydettikten sonra, donör ve alıcı sırasıyla 532 nm ve 640 nm lazerler kullanarak aydınlatma süresi eşiği için dönüşümlü ve tekrar tekrar heyecanlanır. Donör ve alıcı çıkarma arasındaki süre, kamera tarafından görüntü okunmasına izin vermek için yeterince uzun olmalıdır. Gecikme süresi tdelay, alım kare hızını ve bu nedenle fotobleaching öncesi gözlem süresini ayarlamak için kullanılabilir. Bu panel 16’dan değiştirildi. (B) İki emisyon kanalı arasındaki koordinat dönüşümlerinin hesaplanmasında fidüsyal belirteçler kullanılır. Eşleşen fiducials renk ile gösterilir. Tüm görüş alanının kapsanmasını sağlamak için birkaç kaydırılmış görüntü kaydedilmelidir. (C) Düz alan düzeltmesi için lazer profilleri yoğun etiketli bir örnek kullanılarak kaydedilir. Kabul eden profili kaydedilir ve fotobleached, ardından donör profili elde edilir. Farklı örnek bölgelerde birden fazla görüntü alınmalı, ortalama alınmalı ve örnek kusurlarının etkisini azaltmak için düzeltilmelidir (örneğin, görüntünün orta üstündeki parlak nokta). (D) C’de açıklandığı gibi kaydedilen 20 lazer profilinden hesaplanan düz alan düzeltme haritası p(x,y). Kısaltmalar: FRET = Förster rezonans enerji transferi; ImDD = donör ekscitasyonu üzerine donör emisyon görüntüsü; ImDA = donör ekscitasyonu üzerine alıcı emisyon görüntüsü; ImAA = donör ekscitasyonu üzerine alıcı emisyon görüntüsü. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Elektron çarpan yük bağlantılı bir cihaz (EMCCD) kamera kullanırken, EM kazancının tek moleküllü sinyalleri yüksek sinyal-gürültü oranlarında gözlemlemesini sağlayın (üreticinin talimatlarına bakın). Heyecanlanma sırası (daha fazla ayrıntı için Şekil 1A’ya bakın). İsteğe bağlı olarak, veri çözümlemini görünüm alanındaki belirli bölgelerle sınırlamak için segmentasyon için bir görüntü kaydedin. Örneğin, 405 nm lazer kullanarak Fura-2 yüklü hücreleri heyecanlandırın ve sadece hücreler ve desteklenen lipid bilayerleri (SLB’ ler) arasındaki arayüzlerde bulunan probları değerlendirmek için emisyonlarını 510 nm civarında yakalayın. Sonuç olarak, kamera okumasına izin vermek için tr süresini bekleyin.NOT: EMCCD kameralarda tr, seçilen ilgi alanı (YATıRıM GETIRISi) bölgesindeki satır sayısına bağlıdır. Bu nedenle, çerçeveler ve kaydedilen verilerin boyutu arasındaki gecikmeyi azalttığı için küçük bir yatırım getirisi seçmek avantajlı olabilir. Ayrıca, kare aktarım modunun etkinleştirilmesi tr’nin daha da azaltılmasını sağlar. Alternatif olarak donör ve kabul eden floroforları tekrar tekrar heyecanlandırır. Bir aydınlatma süresi eşiği için donörü heyecanlandırın (5-10 ms genellikle hareket bulanıklığını önleyecek kadar kısadır) ve aynı zamanda kamerayı tetikler. Kamera okumasına izin vermek için tr süresini bekleyin. Kamerayı tetiklerken kabul edeni heyecanlandır. Bir zaman tdelay bekleyin.NOT: Bu, kamera tarafından okumayı etkinleştirmek için tr’den daha uzun olmalıdır, ancak aksi takdirde keyfi olarak seçilebilir. Zaman çözünürlüğü ve izleme uzunluğu gereksinimlerini dengeler. 2.2.2.1-2.2.2.4 adımlarını yineleyin. Agregalardan tek moleküllü sinyallerin ayrımcılığı için adım adım fotobleaching analizine izin veren görüş alanında prob başına en az bir floroforun fotobleachingini sağlayacak kadar büyük olacak tekrar sayısını seçin.NOT: Uygun eşik ve heyecan lazer yoğunluklarının seçilmesi genellikle bazı deneyler gerektirir: Aydınlatma süreleri ne kadar uzun olursa ve lazer yoğunlukları ne kadar yüksek olursa, ortaya çıkan görüntülerdeki sinyal-gürültü oranı o kadar iyidir, ancak elde eden zaman izleri o kadar kısadır. Her örnek için yeterli sayıda film kaydedin. 3. Düzeltme faktörlerinin belirlenmesi için ek ölçümler Görüntü kaydı için her iki emisyon kanalında da görülebilen bir dizi rastgele yerleştirilmiş fidücial işaretleyici kaydedin (yani, donör emisyon kanalının koordinatlarını alıcı emisyon kanalına eşleyen dönüşümü bulmak ve bunun tersi). Bkz. Şekil 1B.NOT: Görüntü kaydı yazılım tarafından gerçekleştirilir; bkz. adım 6.1.4. Düz alan düzeltmesi için hem donör hem de alıcı çıkarma ışık kaynakları için yoğunluk profilini ölçün (yani, görüş alanında inhomogeneous excitation için düzeltme). Bu amaçla, yüksek yoğunlukta FRET probları içeren bir örnek hazırlayın ve önce alıcının çıkarılması üzerine bir görüntü elde edin, ardından alıcının fotobleaching’i ve daha sonra donör çıkarılması üzerine bir görüntünün kaydedilmesi. Daha fazla stabilite için, farklı örnek bölgelerde birkaç kez tekrarlayın. Bkz. Şekil 1C,D. Alternatif olarak, sadece donör molekülle süslenmiş bir numuneyi ve sadece kabul eden floroforlarla süslenmiş ikinci bir numune kaydedin.NOT: Düz alan düzeltmesi analiz yazılımı tarafından gerçekleştirilir; bkz. adım 8.1.2. Alıcı kanalına sızan donör emisyonu belirlemek için alıcı floroforu olmayan bir probun tek moleküllü örneğini (bölüm 2’de olduğu gibi) kaydedin.NOT: Donör sızıntısı, alıcı ağartma işleminden sonra gerçek probların zaman izlerinden de hesaplanabilir. Bu tür olayların yeterli sayıda kaydedilirse, ek ölçüm gerekmez. Her iki seçenek de analiz yazılımı tarafından desteklenir; Ek Bilgiler bölümüne bakın, bölüm 3.15. Donör flüforu olmayan bir probun kayıtlarını, donör ekscitasyon ışık kaynağı tarafından doğrudan kabul edenin çıkarılması için alın.NOT: Doğrudan alıcı çıkarma, donör ağartma işleminden sonra gerçek probların zaman izlerinden de türetilebilir. Bu tür olayların yeterli sayıda kaydedilirse, ek ölçüm gerekmez. Her iki seçenek de analiz yazılımı tarafından desteklenir; Ek Bilgiler bölümüne bakın, bölüm 3.15. Donör ve alıcı emisyon kanallarının farklı algılama verimliliklerini ve boyaların farklı kuantum verimlerini düzeltmek için iki farklı FRET verimliliği içeren tek moleküllü bir örnek kaydedin.NOT: Bu tür örnekler, örneğin, iki konformasyon arasında dalgalanan Holliday kavşakları1 veya farklı, iyi tanımlanmış mesafelerde FRET çiftleri eklenmiş DNA çubukları olabilir. Problar yüksek ve yeterince sabit FRET verimliliklerine sahipse, düzeltme, probların zaman izlerinin kabul edici ağartma olaylarından da hesaplanabilir, bu durumda ek ölçümlere gerek yoktur. Her iki seçenek de analiz yazılımı tarafından desteklenir; Ek Bilgiler bölümüne bakın, bölüm 3.15. 4. Tek moleküllü lokalizasyon algoritmaları NOT: Çeşitli analiz adımları tek moleküllü lokalizasyon gerektirir. Sinyal yoğunluğuna, arka plana ve sinyal-gürültü oranına bağlı olarak Gauss bağlantı algoritması30 ve kütle merkezi hesaplama31 arasında seçim yapın. Gauss montajını gerçekleştirmek için, ilgili kullanıcı arayüzleri aracılığıyla 3D-DAOSTORM30 algoritmasını seçin.NOT: 3D-DAOSTORM , çakışan nokta yayılma işlevleriyle sinyalleri bile ayırt etmek için tasarlanmıştır. Bu genellikle bir avantaj olsa da, bir uyarı ile birlikte gelir: tek, parlak sinyaller bazen izleme algoritmasını karıştırabilen ve tek bir uzun yörünge yerine iki kısa yörüngenin algılanmasını sağlayan iki bitişik sinyal olarak tanımlanır.Aşağıdaki parametreleri ayarlayın (ayrıntılar için algoritmanın uygulanmasını sağlayan sdt-python library32 belgelerine bakın). radius: Gauss uyum işlevinin başlangıç σ değerini, etkili piksel boyutuna bağlı olarak piksel cinsinden ayarlayın. eşik: Yerel yoğunluğun sığacağı en yüksek değer için minimum genlik (örneğin, tahmini yerel arka plan için düzeltilmiş en parlak piksel değeri) ayarlayın.NOT: Eşik tartışmasız en önemli parametredir. Çok düşük ayarlanırsa, gürültü floresan sinyali olarak kabul edilebilir ve parlak sinyaller iki Gaussian ile donatılabilir. Çok yüksek ayarlanırsa, loş sinyaller uygun değildir. model: Dairesel Gaussian’lara uyacak şekilde 2d olarak ayarlayın.NOT: Diğer modeller smFRET verileri için geçerli değildir. filtre bulma: Gürültüyü azaltmak için yerel maxima bulmadan önce bir filtre uygulayın, bu da düşük sinyal-gürültü oranı durumlarında yardımcı olur. Bu i) kimlik olabilir: filtre yok; ii) Crocker-Grier: Crocker-Grier algoritmasından bandpass filtresi31,33; veya iii) Gauss: sigma parametresi tarafından ayarlanan σ gauss bulanıklığı.NOT: Crocker-Grier için feat. boyut parametresi piksel cinsinden bir noktaya yayılma işlevinin yarıçapı olmalıdır.NOT: Sığdırma filtresiz ham veriler kullanılarak gerçekleştirilir. min. mesafe: Tek bir Gaussian ile min. mesafe piksellerinden daha az ile ayrılmış iki olası sinyali sığdır.NOT: Bu, parlak bir sinyalin yanlış bir şekilde iki bitişik sinyal olarak algılandığı yukarıda belirtilen senaryoda yardımcı olabilir. boyut aralığı: Gürültü nedeniyle algılamaları sahte sinyallerden kaldırmak için sığdırmaların minimum ve maksimum σ seçin. Kütle merkezi hesaplaması (Crocker’ın ve Grier’in fikrine dayalı rafine bir algoritma313) gerçekleştirmek için ilgili kullanıcı arayüzleri aracılığıyla Crocker-Grier algoritmasını seçin.NOT: Bu algoritma, düşük sinyalden gürültüye senaryolarda ve bir dizi yoğunluk içeren sinyallerle başa çıkmada bile çok sağlamdır, ancak çakışan nokta yayılma işlevlerine sahip molekülleri tam olarak sığdıramaz. radius: Diskin yarıçapını (piksel cinsinden) tüm nokta yayılma işlevini içerecek kadar büyük olarak ayarlayın. signal thresh.: Yerel bir yoğunluğun analiz edilmesi için minimum genliği (tahmini arka planın üzerindeki en parlak piksel) ayarlayın.NOT: Çok düşük ayarlanırsa, gürültü floresan sinyali olarak kabul edilebilir. Çok yüksek ayarlanırsa, loş sinyaller uygun değildir. kütle harmanı:: Analiz edilecek bir sinyalin minimum toplam yoğunluğunu (arka planda düzeltilmiş piksel değerlerinin toplamı) ayarlayın.NOT: Yukarıdaki hususlar geçerlidir. 5. Yazılım başlatma Analiz komut dosyalarını indirin. Anaconda isteminde , çözümlemeyi kaydetmek ( CD komutunu kullanarak) vegit klonlama https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git hedef klasör Hedef klasörü 2021-06-14_Force-FRET-experiment gibi açıklayıcı bir adla değiştirin.NOT: Analiz yazılımı bu klasörde sona erecek; bu klasörün önceden varolmamasını sağlayın. Her deneme için analiz komut dosyalarının bir kopyasının indirilmesi önerilir. Bu şekilde, analizi daha sonra yeniden gözden geçirmek, kullanılan parametreleri geri çağırmak ve değişiklikler yapmak mümkündür. Jupyter not defterlerini kopyalayın (01. İzleme.ipynb, 02. Analiz.ipynb, 03. Plots.ipynb) yeni oluşturulan klasöre (bundan böyle kök klasör olarak adlandırılır). Yazılımı ilk kez kullanıyorsanız, bunları kök klasörün not defterleri alt klasöründen alın.NOT: Benzer veri kümeleri zaten analiz edilmişse, parametreler yalnızca biraz değişmiş olabileceğinden, not defterlerini önceki bir denemeden kopyalamak uygun bir seçenek olabilir. JupyterLab’ı görüntüleyen bir web tarayıcısı penceresi açmak için Anaconda isteminde aşağıdaki komutu yürüterek JupyterLab sunucusunu başlatın.jupyter laboratuvarıNOT: Anaconda isteminde çalışan işlem gerçek işi yaparken tarayıcı yalnızca arabirimdir. Sonuç olarak, tarayıcı penceresini kapatmanın yalnızca en az etkisi vardır; oturum http://localhost:8888 erişerek geri yüklenebilir . Ancak, JupyterLab işlemini istem içinde kesmek veya istemi kapatmak analizi sonlandırır ve kaydedilmemiş çalışma kaybına neden olur. JupyterLab tarayıcı penceresinde, kök klasöre gitmek için sol bölmeyi kullanın. İlk dizüstü bilgisayarı başlatmak için 01. Tracking.ipynb’ye çift tıklayın. Başlattıktan sonra, Python kodunun hücreleri olarak adlandırılan kutuları görüntüleyen yeni bir sekmenin görünmesini arayın.NOT: Tüm Jupyter not defterlerinde her kod hücresinin işlevselliğini açıklayan açıklamalar bulunur. Ayrıca, her yöntem çağrısı için belgeler, metin imleci açılıştan hemen önce yerleştirilerek görüntülenebilir ( ve Shift+Sekme tuşlarına basın). Veri çözümleme sürecine genel bakış için Şekil 2’ye bakın. Şekil 2: Tipik bir analiz ardışık düzenine genel bakış. Filtreleme adımlarının deneysel tasarıma göre adaptasyona tabi olduğunu unutmayın. Bu rakam 16’dan değiştirilir. Kısaltma: FRET = Förster rezonans enerji transferi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. NOT: Yazılımı denemek için örnek veriler https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files 6. Tek moleküllerin lokalizasyonu, takibi ve floresan yoğunluğu analizi (01. İzleme.ipynb). 01. İzleme.ipynb Jupyter dizüstü bilgisayar, özellikle FRET ölçümlerinde sıklıkla meydana gelen soluk sinyallerin (örneğin, yüksek FRET olaylarındaki düşük donör sinyalleri nedeniyle ve tam tersi) hassas nicelik için özel olarak tasarlanmış tek moleküllü sinyallerin floresan yoğunluk değerlerinin güvenilir analizi için.NOT: Bu amaçla, ham verilerdeki piksel yoğunluklarının yerel arka plan için düzeltme ile doğrudan entegrasyonu uygulanır. Her analiz adımının ekran görüntüleri ve işlev çağrısı parametrelerinin açıklaması için, Ek Bilgiler.Donör ve alıcı çıkarma çerçevelerinin yanı sıra kaydedilen görüntü dizilerinden görüntü segmentasyonu için çerçevelerin seçilmesine izin vermek için aydınlatma sırasını belirtin.NOT: Yazılım, rasgele aydınlatma protokolleriyle kaydedilen verilerin işlenmesine izin verdiğinden, ne tür bir floroforun heyecan vericiyken bir görüntü dizisindeki hangi karenin elde edildiğini belirtmek gerekir; Bkz. Ek Bilgiler, bölüm 1.2, adım 3. Özgün görüntü dizisinin kare numaraları korunur. Veri kümelerini açıklayın ve yükleyin. Aynı aydınlatma ayarları kullanılarak kaydedilmiş olmaları koşuluyla aynı anda birden fazla veri kümesini analiz edin. Her veri kümesine ilgili görüntü sırası dosya adlarıyla eşleşen bir tanımlayıcı ve desen atayın. Ayrıca, görüntü kaydı için fiducial işaretleyicilerin kayıtları, düz alan düzeltmesi için heyecan ışığı profilleri ve düzeltme faktörlerini belirlemek için isteğe bağlı olarak yalnızca donör ve alıcı örnekleri gibi özel amaçlar için belirli veri kümeleri tanımlayın. Her iki kanal da tek bir kamera kullanılarak kaydedilmişse ham görüntülerde emisyon kanallarını seçin. Bunun için, donör ve kabul eden emisyon için uygun bölgeleri seçmek üzere uygun grafik widget’ını kullanın. Her iki emisyon kanalında da fiducial işaretleyicileri yerelleştirin ve görüntü kaydı gerçekleştirin. Hem donör hem de alıcı emisyon kanalları için yerelleştirme algoritması için uygun parametreleri bulmak için sağlanan kullanıcı arabirimini kullanın. Desteklenen yerelleştirme algoritmaları hakkında bilgi için bölüm 4’e bakın.NOT: Rastgele dağıtılmış fidüsyal belirteçler, emisyon kanallarında en yakın komşularının mekansal dağılımı ile tanımlanabilir (Şekil 1B). Sdt-python kütüphanesindeki seçici düzlem aydınlatma mikroskopisi34 için önerilen algoritmanın özel bir uygulaması, donör emisyon kanalındaki her bir işaretçinin konumunu alıcı emisyon kanalındaki konumla otomatik olarak eşleştirer. Donör emisyon kanalının koordinatlarını alıcı emisyon kanalının koordinatlarıyla eşleştiren bir dönüşüm T, afin dönüşümünün işaretleyicilerin konumlarına en az kareler sığdırılan doğrusal bir şekilde bulunur35. RANSAC, önceki adımdaki yanlış eşleşen pozisyonlar gibi aykırı değerleri hesaba katmak için kullanılır. FRET problarını tüm çerçevelerde donör ve alıcı çıkarma üzerine bağımsız olarak yerelleştirin ve sonuçları orijinal çerçeve numarasını, 2 boyutlu koordinatları ve kaynak görüntü dosyasına başvuran bir tanımlayıcıyı içeren tek bir tabloda birleştirin.NOT: Bu amaçla, yazılım yerelleştirme algoritması için uygun seçenekleri bulmak için kullanıcı arabirimleri sağlar. Donör emisyonu ImDD ve kabul eden emisyon ImDA’dan elde edilen görüntülerin toplamında donör ekscitasyonu üzerine FRET problarını lokalize edin, bu da FRET verimliliğine pek bağlı değildir. Yerelleştirme algoritması seçenekleri hakkında bilgi için bölüm 4’e bakın.NOT: Her toplam görüntü, daha önce görüntü kaydından elde edilen ve ImDA’ya piksel yönünde eklenen dönüşüm T kullanılarak ImDD dönüştürülerek hesaplanır. Kabul eden emisyon kanalı ImAA’da kabul edenin çıkarılması üzerine probları yerelleştirin (yerelleştirme algoritmaları hakkında ayrıntılı bilgi için bölüm 4’e bakın). İzleme ve floresan yoğunluğu ölçümü gerçekleştirin. Şekil 3: Tek moleküllü yoğunluk ölçümü. (A) Turuncu pikselde bulunan bir florofor için, düzeltilmemiş yoğunluğu Iuncorr, sinyalden etkilenen tüm pikselleri kapsayacak kadar büyük bir diskteki (sarı ve turuncu pikseller) tüm piksellerin yoğunluklarını özetleyerek belirlenir: . Yerel arka plan, diskin etrafındaki bir halkadaki (mavi pikseller) piksellerin ortalaması olarak hesaplanır: burada nring halkadaki piksel sayısıdır. Floresan yoğunluğu I, arka planı düzeltilmemiş yoğunluktan çıkarmanın sonucudur, I = Iuncorr – b × ndisk, burada ndisk diskteki piksel sayısıdır. Daire yarıçapı, izleme yönteminin feat_radius parametresi aracılığıyla belirtilir. Halkanın genişliği bg_frame parametresi tarafından verilir. Bir sinyalin nokta yayma işlevi diğerinin (alt panelin) arka plan halkasıyla çakınırsa, etkilenen pikseller (kırmızı) yerel arka plan analizinin dışında tutulur. İki nokta yayılma fonksiyonu çakışıyorsa, floresan yoğunlukları güvenilir bir şekilde hesaplanamaz ve bu nedenle atılır. (B, C) Simülasyonlar, standart sapması 1 piksel olan gauss bulanıklığının uygulanmasının, düşük floresan yoğunluklarında (B) 2’ye yakın bir faktöre kadar sinyal-gürültü oranını artırdığını ve neredeyse hiç hata (%1’den az hafife alma, (C))16’yı ortaya çıkardığını göstermektedir. Ayrıca, göreceli hata (yani, (Imeas – Itruth)/Itruth, Itruth’un temel gerçek olduğu ve Imeas’ın analizin sonucu olduğu) tüm yoğunluk aralığında sabittir ve bu nedenle FRET verimlilikleri ve stoichiometries gibi oransal miktarlar için iptal eder. Tüm çizimler daha önce yayımlanır 16 çalışmaya dayanmaktadır. Kısaltmalar: SNR = sinyal-gürültü oranı; FRET = Förster rezonans enerji transferi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. FRET prob yerelleştirmelerini yörüngelere bağlamak için kullanılan trackpy36algorithm için uygun seçenekleri belirleyin. Özellikle, bir kareden diğerine en fazla arama mesafesini ve ağartma veya kaçırılan yerelleştirmeler nedeniyle bir sinyalin algılanamayan ardışık kare sayısını ayarlayın.NOT: Bu boşluklar, önceki ve sonraki pozisyonlar arasındaki enterpolasyon yoluyla doldurulur. Bu enterpolasyonlu konumlar işaretlenir ve yalnızca daha sonra yoğunluk değerlerini okumak için kullanılır, ancak difüzyon analizi için kullanılmaz. İzler, kabul eden emisyon kanalının koordinat sisteminde analiz edilir. Floresan yoğunluk analizi için (adım 6.1.6.2), izler ayrıca görüntü kaydı yoluyla elde edilen ters dönüşüm T-1 kullanılarak donör emisyon kanalının koordinat sistemine dönüştürülür (bkz. adım 6.1.4). Floresan yoğunluğu hesaplama algoritması için seçenekleri belirleyin (ayrıntılar için Şekil 3A’ya bakın). i) Bir sinyalin konumuna ortalandığında, bu sinyalden etkilenen tüm pikselleri içeren bir diskin yarıçapını ve ii) yerel arka planı belirlemek için kullanılan her diskin etrafındaki bir halkanın genişliğini belirtin.NOT: Elde edilen yoğunluk ölçümlerindeki gürültüyü azaltmak için görüntülere standart sapması 1 piksel olan gauss bulanıklığı uygulanır (Şekil 3B,C). Görüntü dizilerinden yardımcı görüntü verilerini işlemek için analiz yazılımı işlevini kullanın. Segmentasyonu kolaylaştırmak için kaydedilen ek görüntüleri ayıklayın (bkz. adım 2.2.1, s ile işaretlenmiş ek bilgi, bölüm 1.2, adım 3). Yoğun etiketli bir örnekte kaydedilen görüntülerden görüş alanındaki donör ve alıcı çıkarma ışığı profillerini belirleyin (bkz. adım 3.2).NOT: Işık profillerini hesaplamak için görüntülerden piksel piksel ortalama hesaplanır. Kamera taban çizgisi çıkarılır. Görüntüler, örnek safsızlıklar nedeniyle etkileri azaltmak için Gauss filtresi kullanılarak bulanıklaştırilir. Son olarak, elde edilen görüntüler, profil p(x,y) eşleme koordinatlarını [0,1] aralığına almak için maksimum değerlerine piksel yönünde bölünür. 7. FRET yörüngelerinin görselleştirilmesi (isteğe bağlı) Ham görüntü verilerinde tek moleküllü izleri ve buna karşılık gelen floresan yoğunluklarını ve belirgin FRET verimliliklerini ve stoichiometries’i görüntülemek için müfettiş uygulamasını kullanın.NOT: Bu, seçilen parametrelerin geçerliliğini değerlendirmek ve tek tek zaman izlemelerini manuel olarak kabul etmek veya reddetmek için değerli bir araçtır. Ekran görüntüsü ve ayrıntılı kullanım bilgileri için Ek Bilgiler’e bakın. 8. Tek moleküllü verilerin analizi ve filtrelenmesi (02. Analysis.ipynb) 02. Analiz.ipynb Jupyter aracılığıyla elde edilen tek moleküllü verilerin analizi ve filtreleri için dizüstü bilgisayar 01. İzleme.ipynb defter. Tipik bir analiz ardışık düzeni için aşağıdaki adımlara bakın.NOT: Farklı bilimsel sorular ve deneysel tasarımlar ayarların ayarını gerektirebilir. Jupyter dizüstü bilgisayarların kullanımı, analiz adımlarını atlayarak, yeniden düzenleyerek ve değiştirerek kolay uyarlamaya izin sağlar. Her analiz adımının ekran görüntüleri ve işlev çağrısı parametrelerinin açıklaması için, Ek Bilgiler.İlk filtreleme adımlarını gerçekleştirin. Floresan yoğunluklarını güvenilir bir şekilde belirlemek zor olduğundan, çakışan nokta yayılma işlevlerine sahip sinyalleri atın. Evsel aydınlatma durumunda, iyi bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için yalnızca görüş alanındaki iyi aydınlatılmış bölgelerde bulunan sinyalleri kabul edin. Intramoleküler FRET’i inceliyorsanız, tüm ağartma adımlarının kaydedildiğini ve daha sonra adım adım fotobleaching analizi sırasında uygun şekilde değerlendirilebildiğinden emin olmak için analizi görüntü dizisinin başından itibaren mevcut olan yörüngelerle kısıtlayın.NOT: Donör ve kabul eden floroforların önceden biçimlendirilmiş bir kompleksin parçası olmadığı intermoleküler FRET probları ile deneyler yapılırken, analizin başlangıçta yörüngeleri sunacak şekilde kısıtlanması mümkün olmayabilir. 6.1.7.2 adımında elde edilen heyecan verici ışık kaynağı profillerini kullanarak, inhomogeneous aydınlatmanın neden olduğu konuma bağlı floresan yoğunluğu değişimlerini tersine çevirmek için düz alan düzeltmesini yürütün.NOT: Konumdaki bir probun floresan yoğunluğu I(x,y) ile düzeltilir ; bkz. Görünür FRET verimliliğini hesapla Eapp (yani, donör floroforundan kabul eden florofora iletilen enerjinin fraksiyonu) ve görünür stoichiometry Sapp (yani, donör floroforlarının sayısı, kırınım sınırlı bir nokta içindeki toplam florofor sayısına bölün).NOT: Her veri noktası için E ve S çizerek, stoichiometry18’deki değişiklikler nedeniyle donör-alıcı uzaklığındaki değişikliklerden kaynaklanan değişiklikler nedeniyle ölçülen FRET verimliliklerindeki değişiklikleri ayırt etmek mümkündür18. Bu, etkin bir alıcının olmaması nedeniyle E = 0’dan boya ayrımı nedeniyle E = 0 arasında ayrıma izin verir. E-S arazileri analiz boyunca kalite değerlendirmesi için bir araç olarak kullanılır; örnek olarak Şekil 4’e bakın. Tek moleküler problar ve agregalar arasındaki ayrımcılık için fotobleaching’in adım adım analizini yapın. Aşağıdaki seçeneklerden birini kabul etmeyi seçin.NOT: Bu amaçla, analiz yazılımı, donör çıkarma (IDD + IDA) ve alıcı çıkarma (IAA) üzerine floresan yoğunluğuna ayrı ayrı değişiklik noktası algılama algoritması PELT37’nin özel bir uygulamasını uygular. Donör kısmi ağartma gösterirken kabul eden floroforun tek bir adımda ağarttığı (yani, sıfır olmayan yoğunluğa ağartma adımı olmadığı) 1 seçeneğini seçin.NOT: Bu seçenek, donörün alıcıdan önce tek bir adımda ağarttığı yörüngeleri daha da reddeder. Seçenek 1, yüksek kabul eden fotobleaching oranlarında tercih edilen seçimdir. Kısmi kabul edici ağartma yokken donörün tek bir adımda ağarttığı seçenek 2’yi seçin.NOT: Bu seçenek, bağışçının alıcıdan sonra tek bir adımda ağarttığı yörüngeleri daha da reddeder. Donör fotobleaching oranlarının yüksek olması durumunda tercih edilen tercih 2 seçeneğidir. Seçenek 3’ü seçin, burada florofor tek bir adımda ağartılırken, diğeri kısmen ağartmaz.NOT: Seçenek 3, 1 ve 2 seçeneklerinden daha yüksek esneklik sağlar ve veri analizi için önerilen tercih olacaktır. Donör ve kabul eden floroforların tek adımlı fotobleaching gösterdiği veya hiç fotobleaching göstermediği seçenek 4’ü seçin.NOT: Düşük fotobleaching oranları durumunda seçenek 4 tercih edilir. Kabul eden kanala donör emisyon sızıntısı için düzeltme faktörlerini α, doğrudan kabul edeni δ, algılama verimliliklerini γ ve heyecan verici verimlilikleri β 17 hesaplayın. FRET verimliliğini Eapp’in görünür verimliliğinden ve stoichiometry S’nin görünür stoichiometry Sapp’tan hesaplamak için düzeltme faktörlerini kullanın. Daha fazla filtreleme adımı gerçekleştirin. Her yörüngedeki ilk ağartma olayından önce yalnızca veri noktalarını seçin. Ayrıca, analizi tek moleküllü problarla sınırlamak için yalnızca 0,35 < S < 0,6'yı karşılayan veri noktalarının en az% 75'ine sahip yörüngeleri kabul edin (sayılar ayarlanabilir).NOT: Üst ve alt sınırlar, ilgi gören nüfusun analizden dışlanacak popülasyonlara (örneğin, yalnızca bağışçı ve yalnızca kabul eden nüfuslar) yayılmasına göre seçilmelidir. Deneyime dayanarak, 0.35 < S < 0.6 birçok deneysel durum için iyi bir seçim olduğu ortaya çıktı. Analizi görünüm alanındaki farklı bölgelerle sınırlamak için uygun yardımcı görüntülerde (bkz. adımlar 2.2.1 ve 6.1.7) genel veya uyarlanabilir eşikleme yöntemleri35 aracılığıyla görüntü segmentasyonu gerçekleştirin.NOT: Bu, örneğin, bir hücre SLB arabiriminde veya desenli bir yapıda bulunan probların özel olarak değerlendirilmesine izin verilir. 9. Sonuçların çizilme ve daha fazla analiz (03. Plot.ipynb) NOT: Jupyter not defterinin ekran görüntüleri ve işlev çağrısı parametrelerinin açıklaması için Ek Bilgiler’e bakın. Yanlış stoichiometry sinyallerinin doğru şekilde tanımlandığını ve kaldırıldığını doğrulamak için E-S çizimleri oluşturun. FRET verimlilik dağılımlarına iyi bir genel bakış sağlamak için FRET verimliliklerinin histogramlarını çizin. Farklı deneylerden elde edilen sonuçların uygun karşılaştırması için histogramları grupla. Verileri daha fazla değerlendirin (örneğin, difüzyon analizi, FRET verimliliklerinin moleküler kuvvet sensörleri veya geçiş analizi kullanılarak yapılan deneylerde kuvvetlere dönüştürülmesi) bilimsel Python kütüphanelerinden yararlanarak not defterinde.NOT: Veriler, diğer analiz yazılımlarına giriş olarak birçok dosya biçiminde de dışa aktarılabilir.