モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析

1. ソフトウェアの前提条件 ミニコンダの Python ディストリビューション27 (最小必要な Python バージョン: 3.7) をインストールします。 Windowsのスタートメニューでアナコンダのプロンプトを開くか、ターミナルを開き、LinuxまたはmacOSを使用している場合 はcondaアクティベートを 実行します。 次のコマンドを実行して、コミュニティー 保守の conda-forge パッケージ・リポジトリー28 を使用可能にします。コンダ構成 — チャンネルコンダフォージを追加するコンダ構成 –設定channel_priority厳密コンダアップデート –すべて 次のコマンドを実行して、必要な Python パッケージをインストールします。conda インストール opencv トラックピー lmfit ipympl サイキット学習 pyqt sdt-pythonジュピターラボ 解析ソフトウェアのユーザーインターフェイスである JupyterLabに慣れ親しみます(ソフトウェアのマニュアル29を参照)。 Git バージョン管理システムをインストールし、後で分析ソフトウェアのダウンロードと更新に使用します。Linux を使用している場合は、ディストリビューションのパッケージ管理ソフトウェアを使用してダウンロードおよび更新します。それ以外の場合は、次のコマンドを実行します。コンダインストールギット 必要に応じて、解析中にステップをフィルタリングした後にデータセットを表示するサイドカー Python パッケージをインストールします。コンダインストールサイドカー 2. サンプルの測定 図1:画像取得。 (A) 励起シーケンス。405 nmレーザーを使用して色素ロードされたセルの任意画像を記録した後、ドナーとアクセプターは、それぞれ532 nmおよび640 nmレーザーを使用して照明時間のtillのために交互かつ繰り返し励起されます。ドナーとアクソクター励起の間の時間trは、カメラによる画像の読み出しを可能にするのに十分な長さでなければなりません。遅延時間のtdelayを使用して、取得フレームレートを調整し、従って、光漂白前の観察時間を調整することができます。このパネルは16から変更されます。(B) フィデューシャルマーカーは、2 つの放出チャネル間の座標変換の計算に使用されます。一致する受託者は色で示されます。いくつかのシフト画像は、視野全体がカバーされていることを確認するために記録する必要があります。(C) フラットフィールド補正用のレーザープロファイルは、密に標識されたサンプルを使用して記録されます。アクシビタープロファイルは記録され、その後ドナープロファイルの取得が続きます。サンプルの不完全性(例えば、画像の中央上部の明るいスポット)の影響を軽減するために、複数の画像を異なるサンプル領域で撮影し、平均化し、平滑化する必要があります。(D) Cに記載されている20のレーザープロファイルから計算されたフラットフィールド補正マップp(x,y)略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達;ImDD = ドナー励起時のドナー放出画像;ImDA = ドナー励起時のアクソクエンサ放出画像ImAA = ドナー励起時のアクソクサ放出画像。スケールバー= 5 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 電子乗算電荷結合デバイス(EMCCD)カメラを使用する場合、EMゲインが高い信号対雑音比で単分子信号を観測できるようにします(メーカーの指示を参照)。 励起シーケンス(詳細は 図1A を参照)。 必要に応じて、セグメンテーション用の画像を記録し、データ分析を視野内の特定の領域に限定します。例えば、405 nmレーザーを使用してFura-2ロードされた細胞を励起し、510 nm前後の放出を捕捉して、細胞とサポートされる脂質二重層(SLB)の間の界縁部にあるプローブのみを評価します。その結果、時間 tr がカメラの読み出しを許可するのを待ちます。メモ: EMCCDカメラでは、trは選択した対象地域(ROI)の行数によって異なります。したがって、小さい ROI を選択すると、フレーム間の遅延と記録されたデータのサイズが減少するため、有利です。さらに、フレーム転送モードを有効にすると、tr をさらに削減できます。 交互にドナーとアクセプターフルオロフォアを繰り返し励起する。 ドナーに照度の高さ(通常は5~10 msはモーションブラーを避けるほど短い)を励起し、同時にカメラをトリガーします。 時間 tr がカメラの読み出しを許可するのを待ちます。 カメラをトリガーしながらアクシプレクターを励まします。 時間の遅延を待ちます。注: これは、カメラによる読み出しを有効にするには tr よりも長くする必要がありますが、それ以外の場合は任意に選択することができます。時間の解決とトレースの長さの要件のバランスをとるものとします。 ステップ 2.2.2.1 – 2.2.2.4 を繰り返します。視野内のプローブあたり少なくとも1つの蛍光色素の光化を確実にするのに十分な大きさの繰り返し数を選択し、凝集体からの単一分子シグナルの識別に対する段階的な光漂白分析を可能にします。注:適切な 高音色と励起レーザー強度を選択するには、一般的に何らかの実験が必要です:照明時間が長く、レーザー強度が高いほど、結果の画像の信号対雑音比が優れていますが、結果の時間トレースは短くなります。 各サンプルに十分な数のムービーを記録します。 3. 補正係数の決定のための追加測定 画像登録のために両方の放出チャネルに表示される一連のランダムに配置された受託マーカーを記録します(すなわち、ドナー放出チャネルの座標をアクセプタの放出チャネルにマッピングする変換を見つける。 図 1B を参照してください。注:画像の登録はソフトウェアによって行われます。ステップ 6.1.4 を参照してください。 フラットフィールド補正用のドナーとアクセクサ励起光源の両方の強度プロファイルを測定します(すなわち、視野全体で不均一な励起を補正します)。この目的のために、FRETプローブの高密度を特徴とするサンプルを調製し、最初にアクセクサ励起時に画像を取得し、続いて受理者のフォトブロイチ化とその後のドナー励起時の画像の記録を取得します。安定性を高めるには、異なるサンプル領域で数回繰り返します。図 1C,D を参照してください。あるいは、ドナー分子のみで装飾されたサンプルと、アクセプターフルオロフォアだけで飾られた2番目のサンプルを記録します。注: フラットフィールド補正は解析ソフトウェアによって行われます。ステップ 8.1.2 を参照してください。 アクセプター蛍光機を使わないプローブの単分子サンプル(セクション2など)を記録し、アクセプターチャネルに漏れるドナー放出を判定します。注:ドナー漏れは、アクセクサの漂白後の実際のプローブの時間トレースから計算することもできます。このようなイベントの十分な数が記録されている場合、追加の測定は必要ありません。どちらのオプションも解析ソフトウェアでサポートされています。 補足情報、セクション 3.15 を参照してください。 ドナー励起光源による直接アクセクター励起の定量化のためのドナー蛍光色素を含まないプローブの記録を取得する。注:直接アクセクサ励起はまた、ドナーの漂白後の実際のプローブの時間トレースから導き出すことができます。このようなイベントの十分な数が記録されている場合、追加の測定は必要ありません。どちらのオプションも解析ソフトウェアでサポートされています。 補足情報、セクション 3.15 を参照してください。 ドナーとアクソクサの放出チャネルの異なる検出効率と色素の量子収率の異点を修正するために、2つの異なるFRET効率を特徴とする単一分子サンプルを記録します。注: このようなサンプルは、例えば、2つの立体構造間で変動するHolliday junctions1、または異なる明確な距離にFRETペアが取り付けられたDNA棒である可能性があります。プローブが高く、十分に一定のFRET効率を備えている場合、補正はプローブの時間トレースのアクセクサまたは漂白イベントから計算することもできます。どちらのオプションも解析ソフトウェアでサポートされています。 補足情報、セクション 3.15 を参照してください。 4. 単一分子局在化アルゴリズム 注: いくつかの分析ステップでは、単一分子の局在化が必要です。信号密度、背景、および信号対雑音比に応じて、ガウスフィッティングアルゴリズム30 と中心質量計算31のどちらかを選択します。 ガウスフィッティングを実行するには、それぞれのユーザーインターフェイスを介して3D-DAOSTORM30アルゴリズムを選択します。注: 3D-DAOSTORM は、重なり合う点広がり関数を持つ偶数信号を区別するように設計されています。これは一般的に利点ですが、単一の明るい信号は、時折2つの隣接する信号として識別され、追跡アルゴリズムを混乱させ、単一の長い軌道ではなく2つの短い軌道を検出する可能性があります。次のパラメータを設定します(詳細については、アルゴリズムの実装を提供する sdt-python library32のドキュメントを参照してください)。 半径: ガウスフィット関数の初期σ値をピクセル単位で設定します(有効ピクセルサイズに応じて)。 しきい値: ローカルの強度の最大値を調整するために、最小振幅(つまり、最も明るいピクセル値、推定ローカル背景に対して修正)を設定します。注: しきい値は、おそらく最も重要なパラメータです。設定が低すぎると、ノイズが蛍光信号とみなされ、明るい信号には2つのガウスが合う場合があります。設定が高すぎると、薄暗い信号が合わない。 モデル: 円形ガウスに合わせて 2d に設定します。注: 他のモデルは smFRET データには適用されません。 フィルターを見つける:低信号対雑音比の状況で役立つノイズを低減するために、ローカルの最大値を見つける前にフィルタを適用します。これは i) ID で指定できます。ii) クロッカー・グリア: クロッカー・グリアアルゴリズムからのバンドパスフィルター31,33;または iii) ガウス: シグマ パラメータで設定されたσを持つガウス ブラー。注意:クロッカー・グリアの場合、 feat.size パラメータは、ポイントスプレッド関数の半径(ピクセル単位)にする必要があります。注: 継ぎ手は、フィルタ処理されていない生データを使用して実行されます。 最小距離: 1 つのガウス単位で最小距離ピクセルで区切られた 2 つの見込みシグナルを適合させます。注: これは、明るい信号が 2 つの隣接する信号として誤って検出される前述のシナリオで役立ちます。 サイズ範囲:ノイズによるスプリアス信号から検出を除去するために、フィットの最小および最大σを選択します。 質量の中心計算(クロッカーとグリアのidea33に基づく洗練されたアルゴリズム31)を実行するために、それぞれのユーザーインターフェイスを介してクロッカー・グリアアルゴリズムを選択します。注:このアルゴリズムは、低信号対雑音のシナリオでも非常に堅牢で、強度の範囲を特徴とする信号を扱う際に、重なり合う点広がり関数を持つ分子に正確に適合することはできません。 半径: ポイントスプレッド関数全体を含めるのに十分な大きさのディスクの半径(ピクセル単位)を設定します。 シグナルスレッシュ:解析する局所強度の最大値の最小振幅(推定背景を上回る最も明るいピクセル)を設定します。注:設定が低すぎると、ノイズが蛍光信号と見なされることがあります。設定が高すぎると、薄暗い信号が合わない。 質量のスレッシュ:解析する信号の最小合計強度(背景補正ピクセル値の合計)を設定します。注: 上記と同じ考慮事項が適用されます。 5. ソフトウェアの初期化 分析スクリプトをダウンロードします。 Anaconda プロンプトで、( cd コマンドを使用して) 分析を保存するフォルダーに移動し、git クローン https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git ターゲットフォルダ ターゲット フォルダーを 2021-06-FRET-実験などの説明的な名前14_Force置き換えます。注: 解析ソフトウェアは、このフォルダに入ります。このフォルダがあらかじめ存在していないことを確認してください。各実験の解析スクリプトのコピーをダウンロードすることをお勧めします。この方法では、後で解析を再検討し、使用されたパラメータを呼び戻して変更を行うことができます。 ジュピターノートブックをコピーする(01.トラッキング.ipynb, 02.分析.イピンブ、03。新しく作成されたフォルダに plots.ipynb) (それ以降はルート フォルダと呼ばれます)。初めてソフトウェアを使用する場合は、ルート フォルダの notebooks サブフォルダから取得します。注: 類似したデータセットが既に解析されている場合は、パラメータがわずかに変更されている可能性があるため、以前の実験からノートブックをコピーすると便利です。 Anaconda プロンプトで次のコマンドを実行して、JupyterLab を表示する Web ブラウザー ウィンドウを開いて JupyterLab サーバーを起動します。ジュピターラボ注: ブラウザはインターフェイスのみで、 Anaconda プロンプトで実行されているプロセスは実際の作業を行っています。その結果、ブラウザウィンドウを閉じる効果は最小限に抑えられます。セッションは、http://localhost:8888 にアクセスすることで復元できます 。 ただし、プロンプトで JupyterLab プロセスを中断するか、プロンプトを閉じると、解析が終了し、保存されていない作業が失われます。 JupyterLab ブラウザ ウィンドウで、左側のペインを使用して ルート フォルダに移動します。 01. Tracking.ipynb をダブルクリックして、最初のノートブックを起動します。起動後、Python コードのボックス(いわゆるセル)を表示する新しいタブを探します。注: Jupyter ノートブックには、各コード セルの機能を説明するコメントが含まれています。さらに、すべてのメソッド呼び出しのドキュメントは、テキストカーソルを開く直前に置いて 表示することができます ( および Shift + Tab キーを押します)。 データ分析プロセスの概要については、 図 2 を参照してください。 図 2: 一般的な分析パイプラインの概要 フィルタリング手順は、実験計画に従って適応される可能性があることに注意してください。この図は 16から修正されます。略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 注:ソフトウェアを試すサンプルデータは、https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files からダウンロードすることができます 6. 単一分子の局在、追跡、蛍光強度分析(01.トラッキング.イピンブ)。 を使用する 01. トラッキング.イピンブ 正確な定量化に合わせた単一分子信号の蛍光強度値の信頼性分析のためのジュピターノートブック、特にFRET測定で頻繁に発生する微弱な信号(例えば、高FRETイベントでのドナー信号の低さ、およびその逆など)に合わせた。注: このため、生データのピクセル強度とローカル背景の補正を直接統合することが実装されています。各分析ステップのスクリーンショットと関数呼び出しパラメータの説明については、 補足情報.照射シーケンスを指定して、ドナーとアクセプター励起フレームの選択、および記録された画像シーケンスからのイメージセグメンテーション用のフレームを選択できます。注:ソフトウェアは、任意の照明プロトコルで記録されたデータの処理を可能にするので、フッ素の種類をエキサイティングにしながら、画像シーケンス内のどのフレームが取得されたかを示す必要があります。 補足情報、セクション 1.2、ステップ 3 を参照してください。元のイメージ シーケンスのフレーム番号は保持されます。 データセットの説明と読み込み。同じイルミネーション設定を使用して記録されている場合は、複数のデータセットを一度に解析します。各データセットに、それぞれのイメージ シーケンス ファイル名に一致する識別子とパターンを割り当てます。また、画像登録用の受託者マーカーの記録、フラットフィールド補正用の励起光プロファイル、オプションでドナー専用サンプルおよびアクセプタ専用サンプルなど、特別な目的に特化したデータセットを定義して、補正係数を決定します。 両方のチャンネルが 1 つのカメラを使用して記録された場合は、生画像で放出チャネルを選択します。このためには、適切なグラフィカルウィジェットを使用して、ドナーとアクセクサの排出に適した領域を選択します。 両方の放出チャネルで受託マーカーをローカライズし、画像登録を行います。提供されたユーザーインターフェイスを使用して、ドナーとアクセクターの排出チャネルの両方に対するローカリゼーションアルゴリズムの適切なパラメータを見つけます。サポートされるローカリゼーション アルゴリズムについては、セクション 4 を参照してください。注: ランダムに分布した受託者マーカーは、近傍の空間分布によって放出チャネルを越えて識別できます(図 1B)。sdt-Pythonライブラリで選択的平面照明microscopy34のために提案されたアルゴリズムのカスタム実装は、ドナー放出チャネル内の各マーカーの位置をアクセクサ放出チャネル内の位置と自動的に一致させる。ドナー放出チャネルの座標をアクセプタ放出チャネルの座標にマッピングする変換 T は、アフィン変換の線形最小二乗フィットを介してマーカーの位置35に適合する。RANSAC は、前のステップの位置が間違って一致したなどの外れ値を考慮するために使用されます。 すべてのフレームでドナーとアクセプタ励起を個別に FRET プローブにローカライズし、元のフレーム番号、2 次元座標、およびソース イメージ ファイルを参照する識別子を含む 1 つのテーブルに結果をマージします。注: この目的のために、ソフトウェアはローカリゼーション アルゴリズムに適切なオプションを見つけるためにユーザー インターフェイスを提供します。 ドナー発光ImDDおよびアクセプターエミッションImDAから得られた画像の合計でドナー励起時にFRETプローブを局地化し、FRET効率にほとんど依存しない。ローカリゼーションアルゴリズムのオプションについては、セクション4を参照してください。注: 各合計画像は、以前に画像登録から取得し、ピクセル単位で ImDA に追加された変換 T を使用して ImDD を変換することによって計算されます。 アクセクサ放出チャネル ImAA でアクセクサ励起時にプローブをローカリゼーションします(ローカリゼーションアルゴリズムの詳細については、セクション 4 を参照)。 トラッキングと蛍光強度測定を行います。 図3:単一分子強度測定。 (A) オレンジ色のピクセルに位置するフルオロフォアの場合、その補正されていない強度Iuncorrは、信号の影響を受けるすべてのピクセルをカバーするのに十分な大きさのディスク(黄色とオレンジ色のピクセル)内のすべてのピクセルの強度を合計することによって決定されます。 ローカル背景は、円盤の周囲のリング(青いピクセル)のピクセルの平均として計算されます。 蛍光強度Iは、補正されていない強度から背景を差し引いた結果であり、I=Iuncorr – b ×ndisk、ndiskはディスク内のピクセル数である。円の半径は、トラッキング方法のfeat_radiusパラメータを使用して指定します。リングの幅は、bg_frameパラメータによって指定されます。ある信号のポイントスプレッド関数が別の(下部パネル)のバックグラウンドリングと重なる場合、影響を受けるピクセル(赤)はローカルバックグラウンド解析から除外されます。2つの点広がり関数が重なっている場合、蛍光強度は確実に計算できないため廃棄されます。(B、C)シミュレーションでは、1ピクセルの標準偏差を持つガウスブラーを適用すると、低蛍光強度(B)で信号対雑音比が2に近い倍数まで向上し、誤差(わずかな推定値1%未満、(C)16)がほとんど発生しないことがわかります。さらに、相対的誤差(すなわち、Itruthが地上真理であり、イメアスが分析の結果である)の相対的誤差(すなわちImeas – Itruth)/Itruthは、全体の強度範囲にわたって一定であり、FRET効率およびストイチオメトリなどの比量のためにキャンセルされる。すべてのプロットは、以前に公開された work16 に基づいています。略語: SNR = 信号対雑音比;FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 FRET プローブのローカリゼーションを軌道にリンクするために使用される trackpy36 アルゴリズムに対して適切なオプションを選択します。特に、1つのフレームから次のフレームまでの最大検索距離と、シグナルが検出されない連続フレームの数を設定します。注: これらのギャップは、前の位置と後の位置の間の補間によって埋められます。これらの補間された位置はマークされ、後で強度値を読み出すためだけに使用されますが、拡散解析には使用されません。トラックはアクサクタの放出チャネルの座標系で解析されます。蛍光強度解析(ステップ6.1.6.2)では、画像登録を介して得られた逆変換T-1を用いて、さらにトラッキングがドナー放出チャネルの座標系に変換される(ステップ6.1.4参照)。 蛍光強度計算アルゴリズムのオプションを選択します(詳細は 図3A を参照)。i) 信号の位置を中心にした場合に、その信号の影響を受けるすべてのピクセルを含むディスクの半径を指定し、ii) ローカル背景を決定するために使用する各ディスクの周囲のリングの幅を指定します。注: 取得した強度測定でノイズを低減するために、標準偏差が 1 ピクセルのガウス ブラーが画像に適用されます(図 3B、C)。 解析ソフトウェア機能を使用して、イメージシーケンスからの補助画像データを処理します。 セグメンテーションを容易にするために記録された追加の画像を抽出します(励起 シーケンスの s でマークされたステップ 2.2.1 を参照してください( 補足情報、セクション 1.2、ステップ 3 を参照)。 密にラベル付けされたサンプルに記録された画像から、視野全体でドナーとアクセクサ励起光プロファイルを決定します(ステップ3.2を参照)。注: ピクセル単位の平均値は、画像から計算され、ライト プロファイルが計算されます。カメラのベースラインが減算されます。画像は、サンプル不純物による効果を低減するためにガウスフィルターを使用してぼやけています。最後に、結果の画像は、プロファイル p(x,y) マッピング座標を間隔 [0,1] に取得するために、その最大値でピクセル単位で分割されます。 7. FRET軌道の可視化(オプション) インスペクターアプリケーションを使用して、生画像データと対応する蛍光強度と明らかなFRET効率とストイチオメトリーに単一分子トラックを表示します。注: これは、選択したパラメータの有効性を評価し、個々の時間トレースを手動で受け入れるか拒否する貴重なツールです。スクリーンショットと詳細な使用状況情報については、「 補足情報 」を参照してください。 8. 単一分子データの分析とフィルタリング (02.分析.イピンブ) を使用する 02. 分析.ipynbジュピター を介して得られた単一分子データの分析およびフィルタリングのためのノート 01. トラッキング.イピンブ ノートパソコン。一般的な分析パイプラインについては、以下の手順を参照してください。注: 科学的な質問や実験計画の違いによって、設定の調整が必要になる場合があります。Jupyter ノートブックを使用すると、分析ステップを省略、並べ替え、修正することで、簡単に適応できます。各分析ステップのスクリーンショットと関数呼び出しパラメータの説明については、 補足情報.初期フィルタ処理の手順を実行します。 重なり合うポイントスプレッドを持つ信号は、それらの蛍光強度を確実に決定することが困難であるため、機能を破棄します。 不均一な照明の場合、良好な信号対雑音比を確保するために、視野内の明照領域に位置する信号のみを受け入れます。 分子内FRETを研究する場合、画像シーケンスの最初から存在する軌跡に解析を制限して、すべての漂白ステップが記録され、段階的な光漂白解析の後で適切に評価されるようにします。注:分子間FRETプローブを用いて実験を行う場合、ドナーとアクセプター蛍光体は、事前形成された複合体の一部ではないが、最初に存在する軌道に分析を制限することは不可能である。 ステップ6.1.7.2で得られた励起光源プロファイルを使用して、不均一な照明に起因する位置依存蛍光強度変動を逆にするフラットフィールド補正を実行します。注: 位置(x,y)のプローブの蛍光強度I(x,y)は、図1C,Dを介して補正されます。 見かけのFRET効率効率(すなわち、ドナー蛍光機からアクセプター蛍光関数に伝達されるエネルギーの割合)および見かけのストイチオメトリーSapp(すなわち、ドナー蛍光体の数を回折限スポット内のフルオロフォアの総数で割った値)を計算する。注:各データポイントに対してE対Sをプロットすることにより、stoichiometry18の変化による変化によるドナーアクセプトの距離の変化による測定されたFRET効率の変化を区別することが可能です。これにより、アクティブなアクセクターがないため、E = 0 からの仕分けによる E = 0 の間の分化が可能になります。E-S プロットは、品質評価のためのツールとして解析全体を通して使用されます。例として図 4 を参照してください。 単一分子プローブと凝集体の識別に対する光漂白の段階的分析を行います。次のいずれかのオプションを選択します。注:この目的のために、解析ソフトウェアは、ドナー励起(IDD +IDA)およびアクソクサ励起(IAA)時の蛍光強度に、変更点検出アルゴリズムPELT37のカスタム実装32を個別に適用する。 選択肢1を選択し、受付者が部分的な漂白を示さない間、アクセクサフルオロフォア漂白を一段階で選択します(すなわち、非ゼロ強度への漂白ステップはありません)。注:このオプションは、ドナーがアクセクサの前に漂白する軌道を一歩で拒否します。オプション 1 は、アクソクエーターのフォトブリーチングレートが高い場合に推奨される選択肢です。 オプション2を選択し、ドナーは部分的なアクセクサまたは漂白がない間、一歩で漂白する。注:このオプションは、ドナーがアクセクサの後に漂白する軌道を一歩で拒否します。オプション 2 は、高いドナーフォトブリーチング率の場合に推奨される選択肢です。 オプション3を選択し、どちらかのフルオロフォア漂白剤を一段階で、もう一方は部分的に漂白しない。注: オプション 3 はオプション 1 と 2 よりも高い柔軟性を提供し、データ分析の推奨設定になります。 ドナーとアクセプター蛍光HOREがシングルステップの光漂白または全く光漂白を示さないオプション4を選択してください。注: オプション 4 は、フォトブリーチレートが低い場合に推奨されます。 アクサメーサチャネルαへのドナー排出漏出の補正係数、アクソクサ励起δ、検出効率γ、励起効率β 17を計算します。 補正係数を使用して、見かけの効率からFRET効率効率を計算し、見かけのストイチオメトリーSappからストイチオメトリーSを計算します。 さらにフィルタリング手順を実行します。各軌道の最初の漂白イベントの前のデータポイントのみを選択します。さらに、0.35< S <を満たすデータポイントの少なくとも75%の軌道のみを受け入れ、解析を単一分子プローブに制限します(数値は調整可能)。注: 対象の人口と分析から除外される人口の広がりに応じて上限と下限を選択する必要があります (例: ドナーのみおよびアクセクサのみの集団)。経験に基づいて、0.35< S < 0.6は多くの実験状況に適した選択であることが判明しました。 グローバルまたは適応型の閾値処理方法35 を使用して、適切な補助画像(ステップ2.2.1および6.1.7を参照)を使用して画像セグメンテーションを実行し、分析を視野内の異なる領域に制限します。注: たとえば、セル SLB インターフェイスまたはパターン構造にあるプローブの排他的な評価が可能です。 9. 結果のプロットとさらなる分析 (03.プロット.イピンブ) 注: Jupyter ノートブックのスクリーンショットと関数呼び出しパラメーターの説明については、 補足情報を 参照してください。 E-S プロットを作成して、誤ったストイチオメトリーの信号が正しく識別され、削除されたことを確認します。 FRET効率のヒストグラムをプロットして、FRET効率分布の確立された概要を提供します。ヒストグラムをグループ化して、異なる実験の結果を簡単に比較します。 科学的なPythonライブラリを利用して、ノートブック内のデータをさらに評価する(例えば、拡散解析、FRET効率の変換、分子力センサを用いた実験における力や遷移解析)注: データは、他の解析ソフトウェアへの入力として、多くのファイル形式でエクスポートすることもできます。