Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Lukas Schrangl; Janett G&#246;hring; Florian Kellner; Johannes B. Huppa; Gerhard J. Sch&#252;tz

doi:10.3791/63124

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Bioengineering

Analisi spaziotemporale bidimensionale automatizzata di sonde FRET mobili a singola molecola

Published: November 23, 2021

doi:

10.3791/63124

Lukas Schrangl¹, Janett Göhring², Florian Kellner², Johannes B. Huppa², Gerhard J. Schütz¹

¹Institute of Applied Physics,TU Wien, ²Institute for Hygiene and Applied Immunology, Center for Pathophysiology, Infectiology and Immunology,Medical University of Vienna

Summary

Questo articolo presenta un metodo per l’analisi spaziotemporale di sonde mobili a singola molecola basate sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (smFRET) utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo. Il toolkit software di nuova concezione consente la determinazione delle tracce temporali smFRET delle sonde in movimento, compresa la corretta efficienza FRET e le posizioni molecolari, come funzioni del tempo.

Abstract

Il trasferimento di energia di risonanza Förster a singola molecola (smFRET) è una tecnica versatile che riporta le distanze nell’intervallo da sub-nanometro a nanometro. È stato utilizzato in una vasta gamma di esperimenti biofisici e biologici molecolari, tra cui la misurazione delle forze molecolari, la caratterizzazione della dinamica conformazionale delle biomolecole, l’osservazione della colocalizzazione intracellulare delle proteine e la determinazione dei tempi di interazione recettore-ligando. In una configurazione di microscopia a campo largo, gli esperimenti vengono in genere eseguiti utilizzando sonde immobilizzate in superficie. Qui viene presentato un metodo che combina il tracciamento di singole molecole con esperimenti smFRET di eccitazione alternata (ALEX), consentendo l’acquisizione di tracce temporali smFRET di sonde mobili legate alla superficie in membrane plasmatiche o doppi strati lipidici supportati da vetro. Per l’analisi dei dati registrati, è stata sviluppata una raccolta software automatizzata e open source che supporta (i) la localizzazione di segnali fluorescenti, (ii) il tracciamento di singole particelle, (iii) la determinazione delle quantità relative a FRET compresi i fattori di correzione, (iv) la verifica rigorosa delle tracce smFRET e (v) la presentazione intuitiva dei risultati. I dati generati possono essere comodamente utilizzati come input per ulteriori esplorazioni tramite software specializzato, ad esempio per la valutazione del comportamento diffusionale delle sonde o l’indagine delle transizioni FRET.

Introduction

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è stato uno dei principali motori della ricerca biologica e biofisica molecolare, in quanto consente lo studio di processi a risoluzione sub-nanometrica. Poiché l’efficienza del trasferimento di energia tra fluorofori donatore e accettore dipende fortemente dalla distanza inter-colorante nell’intervallo da sub-nanometro a nanometro, è stato efficacemente utilizzato come righello spettroscopico per esplorare la conformazione statica e dinamica delle biomolecole1,2,3,4. Inoltre, il fenomeno FRET è stato ampiamente utilizzato per studi di colocalizzazione di proteine associate alla membrana e intracellulari a livello di ^massa5,6. Negli ultimi due decenni, il metodo è stato adattato per il monitoraggio degli eventi ^smFRET7, il che ha contribuito ad aumentare sostanzialmente la risoluzione temporale e spaziale e ha risolto anche sottopopolazioni rare in campioni eterogenei. Equipaggiati con queste tecniche, sono state acquisite informazioni uniche sulla dinamica dei macchinari molecolari come la velocità di elaborazione del trascritto della RNA polimerasi ^II8, la velocità di replicazione delle DNA polimerasi9,10, la velocità di traslocazione del ^nucleosoma11, la velocità di splicing del trascritto e di stallo degli spliceosomi ^assemblati12, l’attività delle sottopopolazioni ribosomiali13 e la velocità di camminata dei motori kinesin14 , per citarne alcuni. Le durate di interazione recettore-ligando15 e le forze ^molecolari16 sono state quantificate.

Gli studi smFRET basati sull’intensità si basano tipicamente sull’emissione sensibilizzata per misurare l’efficienza FRET: uno splitter a fascio nel percorso di emissione separa spazialmente la luce proveniente dai fluorofori donatore e accettore all’eccitazione del donatore, consentendo la quantificazione delle singole intensità di fluorescenza. L’efficienza può essere successivamente calcolata come la frazione di fotoni emessa dall’accettore rispetto al conteggio totale dei ^fotoni17. Inoltre, l’eccitazione dell’accettore dopo l’eccitazione del donatore (ALEX) consente la misurazione della stechiometria degli eventi FRET, contribuendo alla discriminazione tra i veri segnali FRET bassi provenienti da segnali derivanti, ad esempio, da sonde dotate di un fluoroforo accettore ^{fotosacchettato18}.

Gli esperimenti FRET a singola molecola sono comunemente condotti in uno dei due modi. In primo luogo, una piccola regione nel volume del campione viene illuminata utilizzando un microscopio confocale. Le singole molecole di sonda in soluzione sono eccitate quando si diffondono all’interno del volume focale. Con questa tecnica, è possibile utilizzare rilevatori veloci di conteggio dei fotoni, consentendo una risoluzione temporale inferiore al microsecondo. In secondo luogo, le sonde sono specificamente immobilizzate sulle superfici e monitorate tramite microscopia a campo largo, spesso utilizzando la configurazione a riflessione interna totale (TIR) per ridurre al minimo la fluorescenza di fondo. L’immobilizzazione della sonda consente tempi di registrazione molto più lunghi rispetto all’utilizzo del primo approccio. Inoltre, il campo visivo più ampio consente il monitoraggio di più sonde in parallelo. La necessità di una fotocamera rende questo metodo lento rispetto a quello sopra descritto. La risoluzione temporale è limitata al millisecondo al secondo intervallo.

Se sono necessarie tracce di tempo lunghe, ad esempio per studiare processi dinamici su una scala temporale da millisecondo a secondo, il primo metodo non è applicabile, poiché i burst di fluorescenza sono in genere troppo brevi. Il secondo approccio fallisce ogni volta che l’immobilizzazione non è fattibile, ad esempio in esperimenti di cellule vive con sonde che si diffondono all’interno della membrana cellulare. Inoltre, è stato osservato che i sistemi modello biologico possono variare notevolmente la loro risposta a seconda della mobilità della superficie ^contattata16.

Mentre in passato sono stati eseguiti esperimenti combinati di smFRET e di tracciamento di singole particelle che registrano sonde FRET ^mobili19, non esiste un software disponibile pubblicamente per la valutazione dei dati. Ciò ha spinto lo sviluppo di una nuova piattaforma di analisi, che consente la determinazione di molteplici proprietà delle sonde fluorescenti mobili, tra cui l’efficienza smFRET e la stechiometria, le posizioni con precisione sub-pixel e le intensità di fluorescenza come funzioni del tempo. Sono stati stabiliti metodi per filtrare le tracce risultanti esaminando il comportamento di sbiancamento graduale, le distanze vicine, le intensità di emissione e altri tratti per scegliere esclusivamente molecole a sonda singola correttamente sintetizzate e funzionali. Il software supporta anche tecniche sperimentali e analitiche recentemente concordate in uno studio multilaboratorio per produrre dati smFRET affidabili e ^{quantitativi17}. In particolare, l’implementazione aderisce alle procedure validate per il calcolo dell’efficienza FRET e della stechiometria. Le intensità di fluorescenza all’eccitazione del donatore nel canale di emissione del donatore _IDD e nel canale di emissione dell’accettore _IDAsono utilizzate per il calcolo dell’efficienza FRET apparente Eapp utilizzando Eq (1).

(1)

Con l’aiuto dell’intensità di fluorescenza nel canale di emissione dell’accettore all’eccitazione dell’accettore _IAA, la stechiometria apparente viene calcolata usando Eq (2).

(2)

L’efficienza FRET E e la stechiometria S possono essere derivate da Eapp e Sapp considerando quattro fattori di correzione.

α descrive la fuoriuscita di fluorescenza del donatore nel canale di emissione dell’accettore e può essere determinato utilizzando un campione contenente solo fluorofori donatori o analizzando parti di traiettorie in cui l’accettore è stato sbiancato. δ corregge l’eccitazione diretta dell’accettore da parte della sorgente luminosa di eccitazione del donatore e può essere misurata utilizzando un campione con solo fluorofori accettori o analizzando parti di traiettorie in cui il donatore è stato sbiancato.

.

γ scala l’IDD per correggere le efficienze di rilevamento divergenti nei canali di emissione del donatore e dell’accettore e le diverse efficienze quantistiche dei fluorofori. Il fattore può essere calcolato analizzando l’aumento dell’intensità del donatore dopo lo sbiancamento dell’accettore in traiettorie con elevate efficienze ^FRET20 o studiando un campione con più stati FRET discreti.

β scala _L’IAA per correggere le disparate efficienze dell’eccitazione del donatore e dell’accettore. Se γ è stato determinato tramite l’analisi dello sbiancamento degli accettori, β potrebbe essere calcolato da un campione di rapporto donatore-accettore ^noto21. In caso contrario, il campione FRET multistato produce anche β.

Insieme, le correzioni consentono il calcolo dell’efficienza FRET corretta utilizzando Eq (3).

(3)

e la stechiometria corretta usando Eq (4).

(4)

Idealmente, la stechiometria corretta per un rapporto donatore-accettore 1:1 dà S = 0,5. In pratica, un rapporto segnale-rumore ridotto produce una diffusione dei valori misurati di S, ostacolando la discriminazione dai segnali solo donatore (S = 1) e dai segnali solo accettore (S = 0). Le tracce temporali risultanti possono essere utilizzate come input per un’analisi più dettagliata delle traiettorie a singola molecola per ottenere informazioni quali profili di forza spaziotemporale16, la mobilità degli eventi a singola ^molecola22 o la cinetica di transizione tra diversi ^stati1.

Il seguente protocollo descrive i parametri e le procedure sperimentali per gli esperimenti di tracciamento smFRET, nonché il principio di funzionamento alla base dell’analisi dei dati utilizzando la suite software di nuova concezione. Per l’acquisizione di dati sperimentali, si consiglia di utilizzare un setup di microscopia rispondente ai seguenti requisiti: i) capacità di rilevare l’emissione di singole molecole coloranti; ii) illuminazione a campo largo: in particolare per gli esperimenti su cellule vive, si raccomanda la configurazione a riflessione interna totale (^TIR23,24,25); iii) separazione spaziale della luce di emissione in base alla lunghezza d’onda in modo tale che la fluorescenza del donatore e dell’accettore sia proiettata su regioni diverse dello stesso chip della ^telecamera25 o su telecamere diverse; iv) modulazione di sorgenti luminose per eccitazione di donatori e accettori con precisione al millisecondo, ad esempio utilizzando laser direttamente modulabili o modulazione tramite modulatori acusto-ottici. Ciò consente l’illuminazione stroboscopica per ridurre al minimo il fotosbiancamento dei fluorofori e l’eccitazione alternata per determinare le stechiometrie; v) output di un file per sequenza di immagini registrate in un formato leggibile dal pacchetto PimS ^Python26. In particolare, sono supportati i file TIFF multipagina.

Protocol

1. Prerequisiti software Installare la distribuzione Python miniconda27 (versione minima richiesta di Python: 3.7). Apri un prompt Anaconda nel menu Start di Windows oppure apri un terminale ed esegui conda activate se usi Linux o macOS. Abilitare il repository dei pacchetti conda-forge gestito dalla comunità28 eseguendo i seguenti comandi:conda config –add channels conda-forgeconda config –set channel_priority strictconda update –all Installa i pacchetti Python richiesti eseguendo:conda installare opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab Acquisire familiarità con JupyterLab, l’interfaccia utente del software di analisi (fare riferimento alla documentazione del software29). Installare il sistema di controllo della versione git , che verrà utilizzato in seguito per scaricare e aggiornare il software di analisi. Se si utilizza Linux, utilizzare il software di gestione dei pacchetti della distribuzione per scaricare e aggiornare. In caso contrario, eseguire:Conda install git Facoltativamente, installare il pacchetto Python sidecar per visualizzare i set di dati dopo aver filtrato i passaggi durante l’analisi:conda install sidecar 2. Misurazione dei campioni Figura 1: Acquisizione di immagini. (A) Sequenza di eccitazione. Dopo aver registrato un’immagine opzionale di una cella caricata con colorante utilizzando il laser a 405 nm, donatore e accettore vengono eccitati alternativamente e ripetutamente per il tempo di illuminazione till utilizzando rispettivamente laser a 532 nm e 640 nm. Il tempo tr tra l’eccitazione del donatore e dell’accettore deve essere abbastanza lungo da consentire la lettura dell’immagine da parte della fotocamera. Il tempo di ritardo tdelay può essere utilizzato per regolare il frame rate di acquisizione e, quindi, l’intervallo di tempo di osservazione prima del fotosbiancamento. Questo pannello è stato modificato da 16. (B) I marcatori fiduciali sono utilizzati per il calcolo delle trasformazioni di coordinate tra i due canali di emissione. I fiduciali corrispondenti sono indicati per colore. Diverse immagini spostate devono essere registrate per garantire che l’intero campo visivo sia coperto. (C) I profili laser per la correzione del campo piatto vengono registrati utilizzando un campione densamente etichettato. Il profilo dell’accettore viene registrato e fotosbiancato, seguito dall’acquisizione del profilo del donatore. Più immagini devono essere scattate in diverse regioni del campione, mediate e levigate per mitigare l’influenza delle imperfezioni del campione (ad esempio, il punto luminoso nella parte centrale dell’immagine). (D) Mappa di correzione flatfield p(x,y) calcolata a partire da 20 profili laser registrati come descritto al punto C. Abbreviazioni: FRET = Förster resonance energy transfer; ImDD = immagine dell’emissione del donatore all’eccitazione del donatore; ImDA = immagine di emissione dell’accettore all’eccitazione del donatore; ImAA = immagine di emissione dell’accettore all’eccitazione del donatore. Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Quando si utilizza una telecamera EMCCD (Charge-Coupled Device) a moltiplicazione di elettroni, consentire al guadagno EM di osservare i segnali a singola molecola con elevati rapporti segnale-rumore (fare riferimento alle istruzioni del produttore). Sequenza di eccitazione (vedere la Figura 1A per ulteriori dettagli). Facoltativamente, registrare un’immagine per la segmentazione per limitare l’analisi dei dati a determinate aree nel campo visivo. Ad esempio, eccitare le cellule caricate fura-2 utilizzando un laser a 405 nm e catturare la loro emissione intorno a 510 nm per valutare solo le sonde situate nelle interfacce tra le cellule e i doppi strati lipidici supportati (SLB). Di conseguenza, attendere il tempo tr per consentire la lettura della fotocamera.NOTA: sulle telecamere EMCCD, tr dipende dal numero di linee nella regione di interesse (ROI) scelta. Pertanto, la scelta di un ROI ridotto può essere vantaggiosa perché riduce il ritardo tra i frame e la dimensione dei dati registrati. Inoltre, l’abilitazione della modalità di trasferimento del frame consente un’ulteriore riduzione del tr. In alternativa eccita ripetutamente i fluorofori donatore e accettore. Eccitare il donatore per un tempo di illuminazione till (5-10 ms è in genere abbastanza breve da evitare la sfocatura del movimento) mentre si attiva anche la fotocamera. Attendere il tempo tr per consentire la lettura della fotocamera. Eccitare l’accettatore per mentre si attiva la fotocamera. Aspetta un tempo tdelay.NOTA: questo deve essere più lungo di tr per consentire la lettura da parte della fotocamera, ma può altrimenti essere scelto arbitrariamente. Essa bilancia i requisiti per la risoluzione temporale e la lunghezza delle tracce. Ripetere i passaggi 2.2.2.1-2.2.2.4. Scegli il numero di ripetizioni in modo che sia abbastanza grande da garantire il fotosbiancamento di almeno un fluoroforo per sonda all’interno del campo visivo, che consente l’analisi graduale del fotosbiancamento per la discriminazione dei segnali a singola molecola dagli aggregati.NOTA: la scelta di intensità laser a davanzali ed eccitazione appropriate richiede comunemente una certa sperimentazione: più lunghi sono i tempi di illuminazione e maggiori sono le intensità del laser, migliore è il rapporto segnale-rumore nelle immagini risultanti, ma più brevi sono le tracce temporali risultanti. Registrare un numero sufficiente di filmati per ogni campione. 3. Misurazioni supplementari per la determinazione dei fattori di correzione Registrare una serie di marcatori fiduciali posizionati casualmente visibili in entrambi i canali di emissione per la registrazione delle immagini (cioè, trovando la trasformazione che mappa le coordinate del canale di emissione del donatore sul canale di emissione dell’accettore e viceversa). Vedere la Figura 1B.NOTA: la registrazione delle immagini viene eseguita dal software; vedere il passaggio 6.1.4. Misurare il profilo di intensità sia per le sorgenti luminose di eccitazione del donatore che per quelle dell’accettore per la correzione del campo piatto (cioè, correggendo l’eccitazione disomogenea in tutto il campo visivo). A tal fine, preparare un campione con un’alta densità di sonde FRET e acquisire prima un’immagine dopo l’eccitazione dell’accettore, seguita dalla fotosbiancamento dell’accettore e dalla successiva registrazione di un’immagine dopo l’eccitazione del donatore. Per una maggiore stabilità, ripetere più volte in diverse regioni del campione. Vedere la Figura 1C,D. In alternativa, registrare un campione decorato con solo la molecola donatrice e un secondo campione decorato con solo i fluorofori accettori.NOTA: la correzione Flatfield viene eseguita dal software di analisi; vedere il passaggio 8.1.2. Registrare un campione a singola molecola (come nella sezione 2) di una sonda senza un fluoroforo accettore per determinare la fuoriuscita di emissioni del donatore nel canale accettore.NOTA: la perdita del donatore può anche essere calcolata dalle tracce temporali delle sonde effettive dopo lo sbiancamento dell’accettatore. Se viene registrato un numero sufficiente di tali eventi, non è necessaria alcuna misurazione aggiuntiva. Entrambe le opzioni sono supportate dal software di analisi; vedere Informazioni supplementari, paragrafo 3.15. Acquisire registrazioni di una sonda senza fluoroforo donatore per la quantificazione dell’eccitazione diretta dell’accettore da parte della sorgente luminosa di eccitazione del donatore.NOTA: l’eccitazione diretta dell’accettore può anche essere derivata dalle tracce temporali delle sonde effettive dopo lo sbiancamento del donatore. Se viene registrato un numero sufficiente di tali eventi, non è necessaria alcuna misurazione aggiuntiva. Entrambe le opzioni sono supportate dal software di analisi; vedere Informazioni supplementari, paragrafo 3.15. Registrare un campione a singola molecola con due distinte efficienze FRET per correggere le diverse efficienze di rilevamento dei canali di emissione del donatore e dell’accettore e le diverse rese quantistiche dei coloranti.NOTA: Tali campioni potrebbero essere, ad esempio, giunzioni holliday1, che fluttuano tra due conformazioni, o barre di DNA che hanno coppie FRET attaccate a distanze diverse e ben definite. Se le sonde presentano efficienze FRET elevate e sufficientemente costanti, la correzione può anche essere calcolata da eventi di sbiancamento dell’accettore delle tracce temporali delle sonde, nel qual caso non sono necessarie ulteriori misurazioni. Entrambe le opzioni sono supportate dal software di analisi; vedere Informazioni supplementari, paragrafo 3.15. 4. Algoritmi di localizzazione a singola molecola NOTA: diverse fasi di analisi richiedono la localizzazione di una singola molecola. Scegli tra un algoritmo di fitting gaussiano30 e un calcolo del centro di massa31, a seconda della densità del segnale, dello sfondo e del rapporto segnale-rumore. Per eseguire il fitting gaussiano, scegliere l’algoritmo 3D-DAOSTORM30 tramite le rispettive interfacce utente.NOTA: 3D-DAOSTORM è progettato per distinguere anche i segnali con funzioni di diffusione dei punti sovrapposti. Mentre questo è generalmente un vantaggio, viene fornito con un avvertimento: i singoli segnali luminosi sono occasionalmente identificati come due adiacenti, il che può confondere l’algoritmo di tracciamento e portare al rilevamento di due traiettorie brevi invece di una singola lunga.Impostare i seguenti parametri (per i dettagli, vedere la documentazione della libreria sdt-python32, che fornisce l’implementazione dell’algoritmo). raggio: imposta il valore iniziale σ della funzione gaussiana fit in pixel a seconda della dimensione effettiva dei pixel. soglia: imposta un’ampiezza minima (ad esempio, il valore dei pixel più luminosi, corretto per lo sfondo locale stimato) per un massimo di intensità locale da adattare.NOTA: la soglia è probabilmente il parametro più importante. Se impostato troppo basso, il rumore può essere considerato un segnale di fluorescenza e i segnali luminosi possono essere dotati di due gaussiani. Se impostato troppo in alto, i segnali deboli non sono adatti. modello: impostato su 2d per adattarsi ai gaussiani circolari.NOTA: gli altri modelli non sono applicabili ai dati smFRET. trova filtro: applica un filtro prima di trovare massimi locali per ridurre il rumore, il che è utile in situazioni di basso rapporto segnale-rumore. Questo può essere i) identità: nessun filtro; ii) Crocker-Grier: filtro passa-banda dall’algoritmo Crocker-Grier31,33; o iii) Gaussiano: una sfocatura gaussiana con σ impostata dal parametro sigma.NOTA: per Crocker-Grier, il parametro feat. size deve essere approssimativamente il raggio di una funzione di diffusione puntiforme in pixel.NOTA: il raccordo viene eseguito utilizzando dati non filtrati non filtrati. distanza minima: adatta due segnali prospettici separati da meno di pixel di distanza minima da un singolo gaussiano.NOTA: questo può aiutare nello scenario di cui sopra in cui un segnale luminoso viene erroneamente rilevato come due segnali adiacenti. intervallo di dimensioni: selezionare la σ minima e massima degli adattamenti per rimuovere i rilevamenti da segnali spuri dovuti al rumore. Scegli l’algoritmo Crocker-Grier tramite le rispettive interfacce utente per eseguire il calcolo del centro di massa (un algoritmo raffinato31 basato sull’idea di Crocker e Grier33).NOTA: Questo algoritmo è molto robusto anche in scenari a basso rapporto segnale-rumore e nel trattare con segnali con una gamma di intensità, ma non può adattare con precisione molecole con funzioni di diffusione del punto sovrapposto. raggio: consente di impostare il raggio (in pixel) di un disco abbastanza grande da contenere l’intera funzione di diffusione del punto. thresh del segnale.: Imposta l’ampiezza minima (pixel più luminoso sopra lo sfondo stimato) per un massimo di intensità locale da analizzare.NOTA: se impostato su un valore troppo basso, il rumore può essere considerato un segnale di fluorescenza. Se impostato troppo in alto, i segnali deboli non sono adatti. trebbiatura di massa: imposta l’intensità totale minima (somma dei valori dei pixel corretti in background) di un segnale da analizzare.NOTA: si applicano le stesse considerazioni di cui sopra. 5. Inizializzazione del software Scaricare gli script di analisi. In un prompt di Anaconda , passare a una cartella per salvare l’analisi (utilizzando il comando cd ) ed eseguiregit clone https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git cartella di destinazione Sostituire la cartella di destinazione con un nome descrittivo, ad esempio 2021-06-14_Force-FRET-experiment.NOTA: il software di analisi finirà in questa cartella; assicurarsi che questa cartella non esista in anticipo. Si consiglia di scaricare una copia degli script di analisi per ogni esperimento. In questo modo, è possibile rivedere l’analisi in un secondo momento, richiamare i parametri utilizzati e apportare modifiche. Copia quaderni Jupyter (01. Tracking.ipynb, 02. Analysis.ipynb, 03. Plots.ipynb) nella cartella appena creata (d’ora in poi denominata cartella principale). Se è la prima volta che si utilizza il software, scaricarli dalla sottocartella notebook della cartella principale.NOTA: se set di dati simili sono già stati analizzati, la copia dei blocchi appunti da un esperimento precedente può essere un’opzione conveniente, poiché i parametri potrebbero essere cambiati solo leggermente. Avviare il server JupyterLab eseguendo il seguente comando nel prompt di Anaconda per aprire una finestra del browser Web che visualizza JupyterLab.laboratorio jupyterNOTA: il browser è solo l’interfaccia, mentre il processo in esecuzione nel prompt Anaconda sta eseguendo il lavoro effettivo. Di conseguenza, la chiusura della finestra del browser ha solo un effetto minimo; la sessione può essere ripristinata accedendo a http://localhost:8888. Tuttavia, interrompere il processo JupyterLab nel prompt o chiudere il prompt terminerà l’analisi, portando alla perdita di lavoro non salvato. Nella finestra del browser JupyterLab, utilizzare il riquadro di sinistra per passare alla cartella principale. Fare doppio clic su 01. Tracking.ipynb per avviare il primo notebook. Dopo l’avvio, cerca una nuova scheda da visualizzare, che visualizza le caselle, le cosiddette celle, del codice Python.NOTA: tutti i notebook Jupyter presentano commenti che descrivono la funzionalità di ogni cella di codice. Inoltre, la documentazione per ogni chiamata al metodo può essere visualizzata posizionando il cursore di testo immediatamente prima dell’apertura ( e premere MAIUSC + TAB. Vedere la Figura 2 per una panoramica del processo di analisi dei dati. Figura 2: Panoramica di una tipica pipeline di analisi. Si noti che le fasi di filtraggio sono soggette ad adattamento in base al progetto sperimentale. Questa cifra è modificata da 16. Abbreviazione: FRET = Förster resonance energy transfer. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. NOTA: i dati di esempio per provare il software possono essere scaricati da https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files 6. Localizzazione, tracciamento e analisi dell’intensità di fluorescenza di singole molecole (01. Tracking.ipynb). Utilizzare il comando 01. Tracking.ipynb Jupyter notebook per l’analisi affidabile dei valori di intensità di fluorescenza dei segnali a singola molecola, che è su misura per la quantificazione precisa, in particolare dei segnali deboli che si verificano spesso nelle misurazioni FRET (ad esempio, a causa di segnali di donatori bassi a eventi FRET elevati e viceversa).NOTA: a tal fine, viene implementata l’integrazione diretta delle intensità dei pixel nei dati grezzi con correzione per lo sfondo locale. Per le schermate di ogni fase di analisi e la descrizione dei parametri di chiamata della funzione, fare riferimento al Informazioni supplementari.Specificate la sequenza di illuminazione per consentire la selezione dei fotogrammi di eccitazione del donatore e dell’accettore, nonché dei fotogrammi per la segmentazione delle immagini dalle sequenze di immagini registrate.NOTA: Poiché il software consente l’elaborazione di dati registrati con protocolli di illuminazione arbitrari, è necessario indicare quale fotogramma in una sequenza di immagini è stato acquisito mentre si eccita quale tipo di fluoroforo; vedere Informazioni supplementari, sezione 1.2, fase 3. I numeri di fotogramma della sequenza di immagini originale vengono mantenuti. Descrivere e caricare i set di dati. Analizza più set di dati contemporaneamente, a condizione che siano stati registrati utilizzando le stesse impostazioni di illuminazione. Assegnare un identificatore e un modello che corrispondano ai rispettivi nomi di file di sequenza di immagini a ciascun set di dati. Inoltre, definire set di dati specifici per scopi speciali, come registrazioni di marcatori fiduciali per la registrazione delle immagini, profili di luce di eccitazione per la correzione flatfield e, facoltativamente, campioni solo donatore e solo accettore per determinare i fattori di correzione. Selezionare i canali di emissione nelle immagini raw se entrambi i canali sono stati registrati utilizzando una singola telecamera. Per questo, utilizzare il widget grafico appropriato per selezionare le regioni appropriate per l’emissione di donatori e accettori. Localizzare i marcatori fiduciali in entrambi i canali di emissione ed eseguire la registrazione delle immagini. Utilizzare l’interfaccia utente fornita per trovare i parametri appropriati per l’algoritmo di localizzazione sia per il canale di emissione del donatore che per quello dell’accettore. Vedere la sezione 4 per informazioni sugli algoritmi di localizzazione supportati.NOTA: i marcatori fiduciali distribuiti casualmente possono essere identificati attraverso i canali di emissione dalla distribuzione spaziale dei loro vicini più prossimi (Figura 1B). Un’implementazione personalizzata dell’algoritmo proposto per la microscopia a illuminazione piana selettiva34 nella libreria sdt-python abbina automaticamente la posizione di ciascun marcatore nel canale di emissione del donatore con la posizione nel canale di emissione dell’accettore. Una trasformazione T che mappa le coordinate del canale di emissione del donatore alle coordinate del canale di emissione dell’accettore si trova tramite un adattamento lineare dei minimi quadrati di una trasformazione affine alle posizioni dei marcatori35. RANSAC viene utilizzato per tenere conto dei valori anomali, ad esempio le posizioni erroneamente abbinate del passaggio precedente. Localizza le sonde FRET in modo indipendente dall’eccitazione del donatore e dell’accettore in tutti i fotogrammi e unisci i risultati in un’unica tabella contenente il numero di fotogramma originale, le coordinate bidimensionali e un identificatore che fa riferimento al file immagine di origine.NOTA: a tal fine, il software fornisce interfacce utente per trovare le opzioni appropriate per l’algoritmo di localizzazione. Localizzare le sonde FRET all’eccitazione del donatore nella somma delle immagini ottenute dall’emissione del donatore ImDD e dall’emissione dell’accettore ImDA, che difficilmente dipendono dall’efficienza FRET. Per informazioni sulle opzioni per l’algoritmo di localizzazione, vedere la sezione 4.NOTA: ogni immagine somma viene calcolata trasformando ImDD utilizzando la trasformazione T precedentemente ottenuta dalla registrazione dell’immagine e aggiunta pixelalmente a ImDA. Localizzare le sonde all’eccitazione dell’accettore nel canale di emissione dell’accettore ImAA (vedere la sezione 4 per i dettagli sugli algoritmi di localizzazione). Eseguire il monitoraggio e la misurazione dell’intensità di fluorescenza. Figura 3: Misurazione dell’intensità a singola molecola. (A) Per un fluoroforo situato al pixel arancione, la sua intensità non corretta Iuncorr è determinata sommando le intensità di tutti i pixel all’interno di un disco (pixel gialli e arancioni) abbastanza grande da coprire tutti i pixel interessati dal segnale: . Lo sfondo locale viene calcolato come la media dei pixel in un anello (pixel blu) attorno al disco: , dove nring è il numero di pixel nell’anello. L’intensità di fluorescenza I è il risultato della sottrazione dello sfondo dall’intensità non corretta, I = Iuncorr – b × ndisk, dove ndisk è il numero di pixel nel disco. Il raggio del cerchio viene specificato tramite il parametro feat_radius del metodo di tracciamento. La larghezza dell’anello è data dal parametro bg_frame. Se la funzione di diffusione puntuale di un segnale si sovrappone all’anello di sfondo di un altro (pannello inferiore), i pixel interessati (rosso) vengono esclusi dall’analisi dello sfondo locale. Se due funzioni di diffusione puntuale si sovrappongono, le intensità di fluorescenza non possono essere calcolate in modo affidabile e vengono quindi scartate. (B, C) Le simulazioni mostrano che l’applicazione di una sfocatura gaussiana con una deviazione standard di 1 pixel migliora il rapporto segnale-rumore fino a un fattore vicino a 2 a basse intensità di fluorescenza (B) e non introduce quasi alcun errore (leggera sottostima inferiore all’1%, (C))16. Inoltre, l’errore relativo (cioè (Imeas – Itruth)/Itruth, dove Itruth è la verità di base e Imeas è il risultato dell’analisi) è costante su tutto l’intervallo di intensità e quindi annulla per quantità raziometriche come efficienze FRET e stechiometrie. Tutte le trame sono basate su lavori pubblicati in precedenza16. Abbreviazioni: SNR = rapporto segnale-rumore; FRET = Trasferimento di energia di risonanza di Förster. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Scegliete le opzioni appropriate per il trackpy36algorithm utilizzato per collegare le localizzazioni della sonda FRET alle traiettorie. In particolare, impostare la distanza massima di ricerca da un fotogramma all’altro e il numero di fotogrammi consecutivi per i quali un segnale può passare inosservato, cosa che può verificarsi a causa di sbiancamento o mancate localizzazioni.NOTA: questi spazi vuoti vengono riempiti tramite interpolazione tra le posizioni precedenti e successive. Queste posizioni interpolate sono contrassegnate e utilizzate solo in seguito per la lettura dei valori di intensità, ma non per l’analisi della diffusione. Le tracce vengono analizzate nel sistema di coordinate del canale di emissione dell’accettore. Per l’analisi dell’intensità di fluorescenza (fase 6.1.6.2), le tracce vengono ulteriormente trasformate nel sistema di coordinate del canale di emissione del donatore utilizzando la trasformazione inversa T-1 ottenuta tramite registrazione dell’immagine (vedere punto 6.1.4). Selezionare le opzioni per l’algoritmo di calcolo dell’intensità di fluorescenza (vedere la Figura 3A per i dettagli). Specificare i) il raggio di un disco che, quando è centrato sulla posizione di un segnale, contiene tutti i pixel interessati da quel segnale e ii) la larghezza di un anello attorno a ciascun disco utilizzato per determinare lo sfondo locale.NOTA: per ridurre il rumore nelle misurazioni di intensità ottenute, alle immagini viene applicata una sfocatura gaussiana con una deviazione standard di 1 pixel (Figura 3B,C). Utilizzare la funzionalità del software di analisi per elaborare i dati di immagine ausiliari dalle sequenze di immagini. Estrarre ulteriori immagini registrate per facilitare la segmentazione (vedere il punto 2.2.1, contrassegnato da s nella sequenza di eccitazione (vedere Informazioni supplementari, sezione 1.2, passaggio 3). Determinare i profili di luce di eccitazione del donatore e dell’accettore in tutto il campo visivo dalle immagini registrate su un campione densamente etichettato (vedere il passaggio 3.2).NOTA: la media pixel per pixel viene calcolata dalle immagini per calcolare i profili di luce. La linea di base della fotocamera viene sottratta. Le immagini sono sfocate utilizzando un filtro gaussiano per ridurre gli effetti dovuti alle impurità del campione. Infine, le immagini risultanti sono divise pixelalmente per il loro valore massimo per ottenere le coordinate di mappatura p(x,y) del profilo sull’intervallo [0,1]. 7. Visualizzazione delle traiettorie FRET (opzionale) Utilizzare l’applicazione inspector per visualizzare tracce a singola molecola nei dati di immagine grezzi e le corrispondenti intensità di fluorescenza e le apparenti efficienze e stechiometrie FRET.NOTA: questo è uno strumento prezioso per valutare la validità dei parametri scelti e accettare o rifiutare manualmente le singole tracce temporali. Vedere Informazioni supplementari per uno screenshot e informazioni dettagliate sull’utilizzo. 8. Analisi e filtraggio dei dati a singola molecola (02. Analisi.ipynb) Utilizzare il comando 02. Analysis.ipynb Jupyter notebook per l’analisi e il filtraggio dei dati a singola molecola ottenuti tramite il 01. Tracking.ipynb taccuino. Vedere i passaggi seguenti per una pipeline di analisi tipica.NOTA: diverse domande scientifiche e progetti sperimentali possono richiedere regolazioni delle impostazioni. L’uso dei notebook Jupyter consente un facile adattamento omettendo, riorganizzando e modificando le fasi di analisi. Per le schermate di ogni fase di analisi e la descrizione dei parametri di chiamata della funzione, fare riferimento a Informazioni supplementari.Eseguire i passaggi di filtraggio iniziali. Scartare i segnali con funzioni di diffusione del punto sovrapposto in quanto è difficile determinare le loro intensità di fluorescenza in modo affidabile. Nel caso di illuminazione disomogenea, accettare solo segnali situati in regioni ben illuminate all’interno del campo visivo per garantire un buon rapporto segnale-rumore. Se si studia fret intramolecolare, limitare l’analisi a quelle traiettorie presenti dall’inizio della sequenza di immagini per garantire che tutte le fasi di sbiancamento siano registrate e possano essere valutate correttamente in seguito durante l’analisi di fotosbiancamento graduale.NOTA: Quando si eseguono esperimenti con sonde FRET intermolecolari, in cui i fluorofori donatore e accettore non fanno parte di un complesso preformato, potrebbe non essere possibile limitare l’analisi alle traiettorie inizialmente presenti. Eseguire la correzione flatfield, che utilizza i profili della sorgente luminosa di eccitazione ottenuti nel passaggio 6.1.7.2 per invertire le variazioni di intensità di fluorescenza dipendenti dalla posizione causate da un’illuminazione disomogenea.NOTA: L’intensità di fluorescenza I(x,y) di una sonda nella posizione (x,y) viene corretta tramite ; vedere Figura 1C,D. Calcolare l’efficienza FRET apparente Eapp (cioè la frazione di energia trasmessa dal fluoroforo donatore al fluoroforo accettore) e la stechiometria apparente Sapp (cioè il numero di fluorofori donatori diviso per il numero totale di fluorofori all’interno di un punto limitato alla diffrazione).NOTA: Tracciando E vs. S per ciascun punto dati, è possibile distinguere le alterazioni nelle efficienze FRET misurate dovute al cambiamento della distanza donatore-accettore dalle alterazioni dovute a cambiamenti nella stechiometria18. Ciò consente la differenziazione tra E = 0 a causa della separazione del colorante da E = 0 a causa dell’assenza di un accettore attivo. I grafici E-S sono utilizzati durante l’analisi come strumento per la valutazione della qualità; vedere la Figura 4 come esempio. Eseguire analisi graduali del fotosbiancamento per la discriminazione tra sonde monomolecolari e aggregati. Scegliere di accettare una delle seguenti opzioni.NOTA: A tal fine, il software di analisi applica un’implementazione personalizzata32 dell’algoritmo di rilevamento del punto di cambiamento PELT37 separatamente all’intensità di fluorescenza all’eccitazione del donatore (IDD + IDA) e all’eccitazione dell’accettore (IAA). Scegli l’opzione 1, in cui l’accettore fluoroforo sbianca in un unico passaggio mentre il donatore non mostra uno sbiancamento parziale (cioè, non c’è un passaggio di sbiancamento a intensità diversa da zero).NOTA: questa opzione rifiuta ulteriormente le traiettorie in cui il donatore sbianca prima dell’accettore in un unico passaggio. L’opzione 1 è la scelta preferita in caso di alti tassi di fotosbiancamento dell’accettore. Scegli l’opzione 2, in cui il donatore sbianca in un unico passaggio mentre non c’è uno sbiancamento parziale dell’accettore.NOTA: questa opzione rifiuta ulteriormente le traiettorie in cui il donatore sbianca dopo l’accettore in un unico passaggio. L’opzione 2 è la scelta preferita in caso di alti tassi di fotosbiancamento del donatore. Scegli l’opzione 3, in cui uno dei due fluorofori sbianca in un unico passaggio mentre l’altro non sbianca parzialmente.NOTA: l’opzione 3 offre una maggiore flessibilità rispetto alle opzioni 1 e 2 e sarebbe la preferenza suggerita per l’analisi dei dati. Scegli l’opzione 4, in cui i fluorofori donatore e accettore mostrano fotosbiancamento a fase singola o nessuna fotosbiancamento.NOTA: l’opzione 4 è preferita in caso di bassi tassi di fotosbiancamento. Calcolare i fattori di correzione per la perdita di emissioni del donatore nel canale dell’accettore α, il δ di eccitazione diretta dell’accettore, le efficienze di rilevamento γ e le efficienze di eccitazione β 17. Utilizzare i fattori di correzione per calcolare l’efficienza FRET E dall’efficienza apparente Eapp e la stechiometria S dalla stechiometria apparente Sapp. Eseguire ulteriori passaggi di filtraggio. Selezionate solo i punti dati precedenti al primo evento di sbiancamento in ogni traiettoria. Inoltre, accettare solo traiettorie con almeno il 75% dei punti dati che soddisfano 0,35 < S < 0,6 per limitare l'analisi alle sonde a singola molecola (i numeri sono regolabili).NOTA: I limiti superiore e inferiore per dovrebbero essere scelti in base alla diffusione della popolazione di interesse rispetto alle popolazioni da escludere dall’analisi (ad esempio, popolazioni solo donatori e solo accettori). Sulla base dell’esperienza, 0,35 < S < 0,6 si sono rivelati una buona scelta per molte situazioni sperimentali. Eseguire la segmentazione delle immagini tramite metodi di soglia globali o adattivi35 sulle immagini ausiliarie appropriate (vedere i passaggi 2.2.1 e 6.1.7) per limitare l’analisi a regioni distinte all’interno del campo visivo.NOTA: Ciò consente, ad esempio, la valutazione esclusiva di sonde situate in un’interfaccia cella-SLB o su una struttura modellata. 9. Traccia dei risultati e ulteriori analisi (03. Plot.ipynb) NOTA: fare riferimento a Informazioni supplementari per le schermate del notebook Jupyter e la descrizione dei parametri di chiamata della funzione. Creare grafici E-S per verificare che i segnali di stechiometria errata siano stati correttamente identificati e rimossi. Tracciare istogrammi di efficienze FRET per fornire una panoramica consolidata delle distribuzioni di efficienza FRET. Raggruppa gli istogrammi per un comodo confronto dei risultati di diversi esperimenti. Valutare ulteriormente i dati (ad esempio, analisi di diffusione, conversione delle efficienze FRET in forze in esperimenti utilizzando sensori di forza molecolare o analisi di transizione) all’interno del notebook sfruttando le librerie scientifiche Python.NOTA: i dati possono anche essere esportati in molti formati di file come input per altri software di analisi.

Representative Results

Una varietà di informazioni di basso e alto livello può essere estratta dalle tracce smFRET a seconda della questione scientifica dell’esperimento. Qui vengono presentati esempi di pipeline di analisi con sonde analogiche e digitali: un sensore di forza molecolare a base di peptidi16 e una sonda di DNA con commutazione stocastica della sua conformazione38, rispettivamente. Fare riferimento alla Figura 5 per la progettazione e il principio di funzionamento di queste sonde. Dopo che gli algoritmi di localizzazione e tracciamento sono stati eseguiti come descritto nel protocollo, il pacchetto offre più strumenti di visualizzazione dei dati per ottimizzare i parametri iniziali e le successive fasi di filtro: (i) visualizzazione di singoli eventi smFRET, (ii) segmentazione opzionale delle immagini per analizzare i dati in determinate regioni di interesse, (iii) monitoraggio delle fasi del filtro tramite efficienza FRET rispetto ai grafici di stechiometria (E-S). La visualizzazione dei dati a singola molecola è presentata nella Figura 6. Infine, gli eventi FRET filtrati sono rappresentati da un grafico E-S e da un istogramma di efficienza FRET (Figura 4). Il grafico E-S è uno strumento utile per ottimizzare le suddette fasi di filtraggio e indagare il risultato finale. I sensori FRET parzialmente sbiancati o etichettati in modo incompleto possono essere esclusi dal loro valore stechiometrico. I parametri di mobilità possono essere studiati tracciando un singolo percorso di traiettoria in un grafico x-y (Figura 6) o un grafico a spostamento quadrato medio (MSD) (Figura 4). Il primo metodo è particolarmente utile per discriminare gli eventi mobili da quelli immobilizzati, mentre il secondo viene utilizzato per calcolare il coefficiente di diffusione. Figura 4: Output esemplare. (A) L’efficienza FRET è tracciata rispetto alla stechiometria (grafico E-S) per una popolazione del sensore di forza molecolare (pannello di sinistra) che decora un doppio strato lipidico supportato da vetro e filtrato da una cellula T. È visibile un solo cloud di popolazione. Il rispettivo istogramma delle efficienze FRET esemplifica la differenza tra una popolazione di sensori di forza in presenza e l’assenza di cellule (pannello centrale). Non si può osservare alcun passaggio a minori efficienze FRET della popolazione di sensori in presenza di cellule T, indicando un allungamento poco o nulla dipendente dalla forza del modulo sensore. Il grafico MSD di queste condizioni sperimentali conferma che la popolazione di sensori di forza sotto una cellula T si muove considerevolmente più lentamente rispetto alle loro controparti non legate (pannello di destra). (B) La stessa analisi è stata eseguita con il sensore di DNA a giunzione Holliday che decora un doppio strato lipidico fluido supportato dal vetro. Il grafico E-S mostra chiaramente due popolazioni, che sono anche evidenti nell’istogramma dell’efficienza FRET. Il grafico MSD indica la presenza di una popolazione di sensori in rapido movimento. Abbreviazioni: FRET = Förster resonance energy transfer; MSD = spostamento quadrato medio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Progettazione e principio di funzionamento delle sonde FRET intramolecolari. (A) Sensore peptidico analogico per la quantificazione delle forze molecolari meccaniche. I fluorofori donatore e accettore sono attaccati covalentemente a entrambe le estremità della spina dorsale peptidica. Il modulo sensore è attaccato in modo site-specific a un ligando specifico, che a sua volta lega un recettore di superficie residente in cellule di interesse (qui, un frammento di anticorpo che riconosce specificamente la catena beta del recettore delle cellule T). Dopo il legame recettore-ligando, viene esercitata la forza e il modulo sensore si estende e alla fine rincula dopo la scissione del legame. Questo pannello è stato modificato da 16. (B) Sensore digitale di DNA per la quantificazione delle transizioni FRET. Il sensore FRET è composto da quattro filamenti di DNA che formano una giunzione Holliday. Il fluoroforo donatore e accettore sono attaccati covalentemente a due filamenti. Le giunzioni Holliday cambiano spesso la loro conformazione a seconda delle condizioni del buffer circostante. La commutazione stocastica di queste conformazioni può essere monitorata quantificando l’efficienza FRET delle singole sonde. Abbreviazioni: TCR = recettore delle cellule T; FRET = Trasferimento di energia di risonanza di Förster. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Esempi di localizzazione e tracciamento delle sonde FRET. (A) L’efficienza FRET e la stechiometria dei singoli eventi sono calcolate quantificando l’intensità del fluoroforo del donatore all’eccitazione del donatore (D → D), del fluoroforo dell’accettore all’eccitazione del donatore (D → A) e del fluoroforo dell’accettore all’eccitazione dell’accettore (A → A). Il filtraggio del vicino più vicino previene la distorsione sovrapponendo le funzioni di diffusione dei punti degli emettitori vicini. La segmentazione delle immagini consente all’utente di scegliere determinati eventi smFRET localizzati all’interno di un’area di interesse (ad esempio, una cella o un micropattern). Come esempio di segmentazione dell’immagine, le cellule T sono state colorate con Fura-2 (visualizzate a sinistra) e sottoposte a soglia adattiva per identificare i bordi delle celle (linea tratteggiata arancione). Barre di scala = 5 μm. (B) traiettorie smFRET utilizzando il sensore di forza molecolare. Le singole traiettorie possono essere tracciate nel piano x-y , visualizzando il loro comportamento di diffusione e localizzazione (pannello di sinistra). Inoltre, le intensità di ogni traiettoria possono essere tracciate nel tempo per identificare le transizioni FRET o i passaggi di sbiancamento (il pannello centrale mostra la traiettoria rossa dal pannello di sinistra). L’efficienza FRET e la stechiometria risultanti possono essere visualizzate in modo simile (pannello di destra). (C) traiettorie smFRET utilizzando il sensore di DNA di giunzione holliday. HBSS + 12 mM MgCl2 è stato utilizzato come tampone durante le misurazioni. A parte l’apparente fase di sbiancamento dell’accettore vicino alla fine della sequenza di questi esempi, è possibile determinare la frequenza delle transizioni FRET per ciascun sensore. Le giunzioni Holliday commutano la loro conformazione con un’alta frequenza, mentre il sensore di forza molecolare non presenta transizioni FRET. Queste informazioni consentono di regolare le condizioni sperimentali, come il ritardo tra i fotogrammi, per aumentare o ridurre il numero di transizioni osservate. Abbreviazioni: FRET = Förster resonance energy transfer; smFRET = FRET a singola molecola; HBSS = soluzione salina bilanciata di Hank. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Informazioni supplementari: Localizzazione e tracciamento di singole molecole (01. Tracking.ipynb). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Questo articolo descrive in dettaglio una pipeline per le registrazioni automatizzate e l’analisi quantitativa dei dati smFRET provenienti da molecole di sonda mobili ma legate alla superficie. Integra i due approcci predominanti agli esperimenti smFRET, coinvolgendo sonde immobilizzate in superficie o sonde che si diffondono in soluzione dentro e fuori da un volume di eccitazione ^confocale17. Fornisce la corretta efficienza FRET e le posizioni molecolari in funzione del tempo. Può quindi essere utilizzato come input per programmi di analisi specializzati, ad esempio per quantificare la cinetica di ^transizione1, gli istogrammi ^FRET39 o la diffusione ^{bidimensionale22}.

Il software è rilasciato sotto una licenza libera e open source approvata dalla Open Source Initiative che concede all’utente il diritto perpetuo all’utilizzo, alla modifica e alla ridistribuzione gratuiti. Github è stato scelto come piattaforma di sviluppo e distribuzione per rendere il più semplice possibile ottenere il software e partecipare al processo di sviluppo segnalando bug o contribuendo con ^code40. Scritto in Python, il software non dipende da componenti proprietari. La scelta dei notebook Jupyter come interfacce utente facilita l’ispezione dei dati in ogni fase di analisi e consente di personalizzare ed estendere la pipeline in modo specifico per il sistema sperimentale in questione. La libreria sdt-python32 funge da base e implementa funzionalità per valutare i dati della microscopia a fluorescenza, come la localizzazione di singole molecole, l’analisi della diffusione, l’analisi dell’intensità della fluorescenza, la registrazione del canale di colore, l’analisi della colocalizzazione e la gestione del ROI.

In linea di principio, il tracciamento di singole particelle può essere eseguito in sistemi monodimensionali, bidimensionali o tridimensionali. Qui, la pipeline di analisi a singola molecola è stata adattata allo studio di sistemi mobili 2D. Questa scelta rispecchia la disponibilità di sistemi semplici, come i doppi strati lipidici (SLB) supportati da planari, per presentare sonde fluorescenti mobili. Tali sistemi a doppio strato lipidico sono tipicamente composti da due o più porzioni di fosfolipidi, in cui la frazione di massa determina i parametri fisico-chimici chiave dell’SLB (come fase e viscosità) e la frazione minore fornisce siti di attacco per le biomolecole. Questi siti di attacco possono essere fosfolipidi biotinilati per piattaforme proteiche a base di avidina o streptavidina o fosfolipidi coniugati nichel-NTA per piattaforme proteiche con tag ^istidina41. La scelta della piattaforma appropriata per collegare le proteine all’SLB dipende dalla questione scientifica. I lettori possono fare riferimento alla ^{letteratura16,38,42} per esempi di strategie impiegate con successo. La densità delle sonde nel campione deve essere sufficientemente bassa da evitare la sovrapposizione delle funzioni di diffusione del punto; in genere, si raccomandano meno di 0,1 molecole per ^μm2. Vedere la sezione dei risultati rappresentativi (in particolare, Figura 6) per un esempio che mostra una densità di sonda adatta. Il metodo di analisi è applicabile anche a singole molecole proteiche marcate fluorescentemente che si diffondono nella membrana plasmatica di cellule vive.

Un aspetto critico degli esperimenti smFRET è la produzione e la caratterizzazione delle sonde FRET stesse. Quando si scelgono i fluorofori per una coppia FRET, il loro raggio di Förster deve corrispondere alle distanze di inter-colorante ^previste43. I coloranti resistenti alla fotosbiancamento sono preferiti in quanto producono tracce a lungo termine. Tuttavia, per tassi di sbiancamento elevati, una specie di fluoroforo può essere utilizzata per riconoscere eventi multiemettitori originati da molecole colocalizzate tramite analisi di fotosbiancamento graduale; vedere il passaggio 8.1.4 nella sezione protocollo. Le coppie di fluorofori devono essere attaccate in modo sito specifico e covalente alle molecole di interesse, formando coppie FRET intra o intermolecolari.

La combinazione di smFRET con altre tecniche prontamente disponibili può aumentare la sua risoluzione spaziale oltre il limite di diffrazione (tramite ^STED44). L’algoritmo di tracciamento smFRET qui presentato amplia l’applicabilità dell’approccio a nuove impostazioni sperimentali e sistemi di modelli. Ciò include studi di (i) cambiamenti cinetici nella stechiometria di biomolecole mobili, (ii) associazione dinamica di biomolecole mobili, (iii) il tasso di reazioni enzimatiche di reagenti liberamente diffusivi e (iv) la cinetica dei cambiamenti conformazionali di biomolecole mobili. I primi due esempi richiedono sistemi modello che mostrino FRET intermolecolare, cioè donatore e accettore sono coniugati a entità biomolecolari separate di interesse. Questi ultimi esempi possono fare uso di biosensori che trasportano donatore e accettore all’interno della stessa entità molecolare (FRET intramolecolare).

I sensori intramolecolari basati su FRET possono fornire informazioni sui cambiamenti conformazionali intrinseci delle biomolecole1,2,3,4, sui cambiamenti conformazionali causati dal carico di forza endogeno o esterno (sensori di forza ^molecolare16) o sulle concentrazioni di ioni nel nanoambiente come il ^calcio45 e il ^pH46 . A seconda del sistema modello e della piattaforma di ancoraggio preferita, tali eventi smFRET possono essere monitorati in 2D o 3D: (i) il tracciamento planare degli eventi smFRET può essere impiegato per la quantificazione dei tempi di interazione recettore-ligando all’interno di una membrana plasmatica, l’associazione di cascate di amplificazione del segnale ancorate alla membrana e i cambiamenti stechiometrici dei recettori di superficie; (ii) il monitoraggio del volume degli eventi smFRET può essere utilizzato per qualsiasi sonda FRET intra- o intermolecolare in cellule viventi o in sistemi ricostituiti in vitro.

Il metodo di tracciamento smFRET è stato sviluppato principalmente pensando alle sonde FRET intramolecolari. Queste sonde presentano un numero fisso e ben noto di etichette fluorescenti, un fatto che è stato sfruttato per rifiutare i dati da molecole agglomerate e sintetizzate in modo errato (ad esempio, etichettate in modo incompleto), nonché da sonde in cui uno dei fluorofori è stato fotosbiancato. Tuttavia, regolando le fasi di filtraggio, il metodo può essere applicato anche alle sonde FRET intermolecolari. Ad esempio, invece di accettare solo molecole con un singolo donatore e un singolo accettore fluoroforo, si potrebbero esaminare le traiettorie spaziali dei coloranti donatore e accettore e selezionare, ad esempio, per la co-diffusione delle traiettorie donatore-accettore.

Poiché l’algoritmo 3D-DAOSTORM ha il supporto per determinare la posizione di un segnale lungo l’asse ottico tramite l’astigmatismo dovuto a una lente cilindrica nel percorso del fascio di emissione, gli esperimenti 3D potrebbero essere facilmente integrati nella pipeline di analisi. In questo caso, il segnale dell’accettore all’eccitazione dell’accettore servirebbe a determinare la stechiometria e la posizione assiale. Il software di analisi può anche essere impiegato per valutare i dati degli esperimenti con sonde immobilizzate utilizzando il suo ampio grado di automazione e schemi di filtraggio. In effetti, i set di dati di efficienza smFRET delle giunzioni Holliday immobilizzate su doppi strati in fase ^gel38 sono stati analizzati utilizzando una versione iniziale del software.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dai progetti dell’Austrian Science Fund (FWF) P30214-N36, P32307-B e dal Vienna Science and Technology Fund (WWTF) LS13-030.

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)	Avanti Polar Lipids	790404P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375P
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457P
α Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective	Zeiss	000000-1084-514
Axio Observer microscope body	Zeiss
Bandpass filter	Chroma Technology Corp	ET570/60m	donor emission filter
Bandpass filter	Chroma Technology Corp	ET675/50m	acceptor emission filter
conda-forge	conda-forge community		community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda
Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5	MENZEL
Dichroic mirror	Semrock Inc	FF640-FDi01-25×36	separation of donor and acceptor emission
Dichroic mirror (quad band)	Semrock Inc	Di01-R405/488/532/635-25×36	separation of excitation and emission light
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
FCS	Sigma-Aldrich	F7524	for imaging buffer
fret-analysis	Schütz group at TU Wien		Python package for smFRET data analysis; version 3
Fura-2 AM	Thermo Fisher Scientific	11524766
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	for imaging buffer
iBeam Smart 405-S 405 nm laser	Toptica Photonics AG
iXon Ultra 897 EMCCD camera	Andor Technology Ltd
Lab-Tek chambers (8 wells)	Thermo Fisher Scientific	177402PK	for sample preparation and imaging
Millenia Prime 532 nm laser	Spectra Physics
miniconda	Anaconda Inc.		Python 3 distribution. Min. version: 3.7
Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)	Addgene	20860 & 20859
OBIS 640 nm laser	Coherent Inc	1185055
Optosplit II	Cairn Research
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5253	for imaging buffer
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
sdt-python	Schütz group at TU Wien		Python library for data analysis; version 17
TetraSpek bead size kit	Thermo Fisher Scientific	T14792	Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration
USC500TH Ultrasound bath	VWR		for SUV formation

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Schrangl, L., Göhring, J., Kellner, F., Huppa, J. B., Schütz, G. J. Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes. J. Vis. Exp. (177), e63124, doi:10.3791/63124 (2021).

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