Colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular para identificar metabólitos de plantas especializadas interagindo com tropomyosina quinase imobilizada receptor B

As misturas botânicas são ricas em compostos farmacologicamente ativos¹, servindo como uma boa fonte para a identificação de novos hits de drogas e leva 2,3,4,5. A descoberta de novos medicamentos a partir de produtos naturais tem sido uma abordagem frutífera e muitos medicamentos atualmente aprovados originaram-se de compostos identificados pela primeira vez na natureza. A diversidade química de compostos naturais é difícil de ser comparada por bibliotecas feitas pelo homem de moléculas quimicamente sintetizadas. Muitos compostos naturais interagem e modulam alvos de proteína humana e podem ser considerados moléculas evolutivamente otimizadas como drogas⁶. Estes compostos naturais são particularmente adequados para a identificação de chumbo de drogas para uso em distúrbios neurológicos⁶. Dois dos medicamentos atualmente aprovados pela FDA para o manejo da doença de Alzheimer (DA) são derivados de alcaloides naturais, a ver: galantamina e rivastigmina (um derivado da fisstigmina)⁶. L-DOPA, atualmente o medicamento mais comumente prescrito para doença de Parkinson, foi identificado pela primeira vez a partir do feijão largo (Vicia faba L.) ⁷. Pergolida e lisúride, agonistas receptores dopaminérgicos são os derivados de alcaloides naturais do fungo parasita Claviceps purpurea⁸. Reserpine, um alcaloide isolado da raiz de cobra indiana (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) foi uma das primeiras drogas antipsicóticas⁹. Recentemente, a resposta imune disregulada e a inflamação sistêmica têm sido ligadas ao desenvolvimento de inúmeras doenças neurológicas, como transtorno depressivo grave ou doenças neurodegenerativas¹⁰. Uma dieta à base de plantas, juntamente com outras intervenções de estilo de vida, tem sido encontrada para melhorar as habilidades cognitivas e funcionais em idosos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Algumas moléculas eletrofílicas pertencentes a triterpenos e polifenóis foram encontradas para modular respostas inflamatórias nos modelos in vitro e in vivo ¹². Por exemplo, compostos naturais contendo carbonilo α.β insaturados (por exemplo, curcumina, cinnamaldeído), ou grupo isothiocyanato (por exemplo, sulforaphane) interfere com a dimerização do receptor-4 (TLR4) que inibe a síntese a jusante de citocinas pró-inflamatórias em uma linha de células pró-B dependentes^de maça . Evidências epidemiológicas apontam fortemente que fitoquímicos dietéticos, presentes em matrizes alimentares complexas, também podem constituir uma fonte viável de novas drogas leva⁶.

Um dos principais obstáculos na identificação de moléculas biologicamente ativas presentes nos extratos vegetais, incluindo alimentos à base de plantas, é a complexidade das amostras investigadas. Tradicionalmente, os compostos individuais são isolados, purificados e posteriormente testados para atividade biológica. Essa abordagem geralmente leva à identificação dos compostos mais abundantes e bem caracterizados. A descoberta de drogas fenotípicas se aproxima sem um alvo molecular definido, depende do fracionamento bioguisticuto de misturas complexas²³. Nesta abordagem, um extrato é fracionado em sub frações menos complexas que são posteriormente testadas em ensaios fenotípicos. O isolamento e purificação dos compostos ativos são orientados pela atividade biológica verificada no ensaio. O conhecimento da identidade de um alvo de drogas especificado pode acelerar significativamente a identificação de compostos farmacologicamente ativos presentes em misturas complexas. Essas abordagens são geralmente baseadas na imobilização do alvo molecular, por exemplo, uma enzima, em uma superfície sólida, como as contas magnéticas²³. Os alvos imobilizados são posteriormente usados nos experimentos de triagem, resultando no isolamento de compostos interagindo com o alvo. Embora essa abordagem tenha sido amplamente utilizada na identificação de compostos voltados para proteínas citosóicas, tem sido menos comumente aplicada na identificação de produtos químicos interagindo com proteínas transmembranas (TMPs)²³. Um desafio adicional na imobilização dos TMPs decorre do fato de que a atividade da proteína depende de sua interação com fosfolipídios de membrana celular e outras moléculas na bicamada, como o colesterol ^23,24. É importante preservar essas interações sutis entre proteínas e seu ambiente bicamfato fosfolipídico nativo ao tentar imobilizar o alvo transmembrano.

Na membrana celular a cromatografia de afinidade de membrana (CMAC) fragmentos de membrana celular, e não proteínas purificadas, são imobilizados nas partículas de fase estacionárias da membrana artificial (IAM)²³. As fases estacionárias do IAM são preparadas por análogos de fosfatialina em sílica. Recentemente, novas classes de fases estacionárias do IAM foram desenvolvidas nas quais grupos gratuitos de amina e silanol são end-capped (IAM. Computador pessoal. Partículas DD2). Durante as colunas CMAC, fragmentos de membrana celular de preparação são imobilizados na superfície das partículas IAM através de adsorção.

As colunas CMAC têm sido usadas até o momento para imobilizar diferentes classes de TMPs, incluindo canais de íons (por exemplo, receptores nicotínicos), GPCRs (por exemplo, receptores opioides), transportadores de proteínas (por exemplo, p-glicoproteína), ^etc.24. Os alvos de proteína imobilizada têm sido utilizados na caracterização da farmacodinâmica (por exemplo, constante de dissociação, Kd) ou determinando cinética de ligação (k_on e k_off) de ligantes de moléculas pequenas interagindo com o alvo, bem como no processo de identificação de potenciais novos cabos de droga presentes em matrizes complexas²⁴ . Aqui apresentamos a preparação das colunas CMAC com o receptor de tropomyosina quinase B (TrkB) imobilizado, que emergiu como um alvo viável para a descoberta de drogas para numerosos distúrbios do sistema nervoso.

Estudos anteriores mostraram que a ativação do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)/TrkB está associada à melhora de certas doenças neurológicas, como DA ou transtorno depressivo grave 25,26,27,28. Foi relatado que os níveis de BDNF e sua expressão receptor TrkB diminuem em AD, e reduções semelhantes prejudicam a função hipocampal em modelos animais de AD²⁹. A diminuição dos níveis de BDNF foi relatada em soro e cérebro de pacientes com DA 30,31,32. A superexpressão de Tau ou hiperfosforilação foram encontradas para diminuir a expressão BDNF em neurônios primários e modelos animais AD 33,34,35. Além disso, foi relatado que o BDNF tem efeitos protetores na neurotoxicidade induzida por β amiloide in vitro e in vivo³⁶. A administração direta de BDNF no cérebro de rato mostrou-se aumentar o aprendizado e a memória em animais com deficiência cognitiva³⁷. BDNF/TrkB emergiu como um alvo válido para amenização de distúrbios neurológicos e psiquiátricos, incluindo^{28,38 d.C}. Direcionar o caminho de sinalização BDNF/TrkB para o desenvolvimento de terapias em DDa potencialmente melhorará nossa compreensão da doença³⁹. Infelizmente, o BDNF em si não pode ser usado como tratamento devido às suas más propriedades farmacocinéticas e aos efeitos colaterais adversos⁴⁰. Pequenos ativadores de moléculas de vias TrkB/BDNF foram explorados como potenciais ligantes TrkB 41,42,43. Entre os agonistas de pequenas moléculas testados, 7,8-dihidroxyflavone (7,8-DHF), foi mostrado para ativar a via BDNF/TrkB 41,44,45,46. Um derivado de 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromne-7,8-diyl bis (metilcarbamate)) está atualmente em consideração como uma possível droga para AD⁴⁷. Recentemente, foi demonstrado que vários antidepressivos trabalham diretamente ligados ao TrkB e promovendo a sinalização BDNF, enfatizando ainda mais a importância de perseguir o TrkB como um alvo válido para tratar vários distúrbios neurológicos⁴⁸.

O protocolo descreve o processo de montagem da coluna TrkB funcional e da coluna de controle negativo TrkB-NULL. As colunas são caracterizadas por um produto natural conhecido ligante molecular: 7,8-DHF. Além disso, descrevemos o processo de triagem de matrizes complexas, utilizando como exemplo o extrato vegetal, para a identificação de compostos interagindo com trkB.