固定化トロポミオシンキナーゼ受容体Bと相互作用する特殊な植物代謝産物を同定するための細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラム

植物混合物は、薬理学的に活性な化合物¹に富んでおり、新薬ヒットおよびリード²、^3、4、5の同定のための良好な供給源として役立つ。天然物からの新薬の発見は実り多いアプローチであり、現在承認されている多くの薬は、自然界で最初に同定された化合物に由来しています。天然化合物の化学的多様性は、化学的に合成された分子の人工ライブラリに匹敵することは困難です。多くの天然化合物は、ヒトタンパク質標的と相互作用し、調節し、進化的に最適化された薬物様分子^{と考えることができる6}。これらの天然化合物は、神経学的障害⁶において使用する薬物鉛同定に特に適している。アルツハイマー病(AD)の管理のために現在FDAが承認している2つの薬は、天然アルカロイド、すなわちガランタミンとリバスチグミン(フィゾスチグミンの誘導体)^{に由来しています6}。L-DOPA, 現在、パーキンソン病のための最も一般的に処方薬, 最初にソラマメから同定されました (Vicia faba L.)^ペルゴリドおよびリスリド、ドーパミン作動性受容体アゴニストは、寄生菌クラビセプス・プルプレア由来の天然麦角アルカロイドの誘導体である⁸.レセルピンは、インドのヘビの根(Rauvolfia serpentina(L.ベンス、元クルツ)から単離されたアルカロイドであり、最初の抗精神病薬⁹の1つであった。近年、調節不全の免疫応答および全身性炎症は、大うつ病性障害または神経変性疾患などの多数の神経学的疾患の発症に関連している¹⁰。植物ベースの食事療法と他のライフスタイル介入は、高齢者の認知能力および機能的能力を改善することが見出されている11、12、13、¹⁴、15、16、^17、18、¹⁹、^20、21.トリテルペンおよびポリフェノールに属するある種の求電子性分子は、インビトロおよびインビボモデルの両方において炎症応答を調節することが見出されている¹²。例えば、α,β−不飽和カルボニル(例えば、クルクミン、シンナムアルデヒド)、またはイソチオシアネート基(例えば、スルフォラファン)を含む天然化合物は、マウスインターロイキン−3依存性プロB細胞株における炎症誘発性サイトカインの下流合成を阻害するToll様受容体−4(TLR4)二量体化を妨害する^12、22.疫学的証拠は、複雑な食品マトリックス中に存在する食事性植物化学物質も、新薬リードの実行可能な供給源を構成する可能性があることを強く指摘している⁶。

植物ベースの食品を含む植物抽出物中に存在する生物学的に活性な分子の同定における主要な障害の1つは、調査されたサンプルの複雑さである。伝統的に、個々の化合物は単離され、精製され、続いて生物学的活性について試験される。このアプローチは、通常、最も豊富で十分に特徴付けられた化合物の同定につながる。定義された分子標的を伴わない表現型創薬アプローチは、複雑な混合物のバイオガイド分画に依存する²³。このアプローチでは、抽出物は、より複雑でないサブフラクションに分画され、その後、表現型アッセイで試験される。活性化合物の単離および精製は、アッセイにおいて検証された生物学的活性によって導かれる。特定の薬物標的の同一性の知識は、複雑な混合物中に存在する薬理学的に活性な化合物の同定を有意にスピードアップし得る。これらのアプローチは、通常、分子標的、例えば酵素の固定化に基づいており、固体表面上の、磁気ビーズ²³などが挙げられる。固定化された標的は、その後、スクリーニング実験において使用され、標的と相互作用する化合物の単離をもたらす。このアプローチは、細胞質ゾルタンパク質を標的とする化合物の同定に広く使用されてきたが、膜貫通タンパク質(TMP)と相互作用する化学物質の同定にはあまり一般的に適用されていない²³。TMPsの固定化におけるさらなる課題は、タンパク質の活性が、細胞膜リン脂質およびコレステロール^23,24などの二重層中の他の分子との相互作用に依存するという事実に由来する。膜貫通標的を固定化しようとする場合、タンパク質と天然のリン脂質二重層環境との間のこれらの微妙な相互作用を保存することが重要です。

細胞膜アフィニティークロマトグラフィー(CMAC)では、精製されていないタンパク質と細胞膜断片が、人工膜(IAM)固定相粒子²³に固定化される。IAM固定相は、ホスファチジルコリン類似体をシリカ上に共有結合することによって調製される。最近、遊離アミン基およびシラノール基が末端キャップされているIAM固定相の新規クラスが開発されている(IAM.パソコン。DD2粒子)。CMACカラム調製中、細胞膜断片は吸着によってIAM粒子の表面に固定化されます。

CMACカラムは、イオンチャネル(例えば、ニコチン性受容体)、GPCR(例えば、オピオイド受容体)、タンパク質トランスポーター(例えば、p-糖タンパク質)などを含む、異なるクラスのTMPを固定化するために今日まで使用されてきた²⁴。固定化タンパク質標的は、標的と相互作用する小分子リガンドの薬力学(例えば、解離定数、Kd)の特性評価または結合動態(_kon および_koff)の決定、ならびに複合体マトリックス中に存在する潜在的な新薬リードの同定の過程において使用されてきた²⁴.ここでは、多数の神経系疾患の創薬の実行可能な標的として浮上している固定化トロポミオシンキナーゼ受容体B(TrkB)を用いたCMACカラムの調製法を紹介します。

これまでの研究では、脳由来神経栄養因子(BDNF)/TrkB経路の活性化が、ADや大うつ病性障害などの特定の神経学的疾患の改善と関連していることが示されました^25,26,27,28。ADのBDNFレベルおよびその受容体TrkB発現の減少、および同様の低下が^AD29の動物モデルにおいて海馬機能を損なうことが報告された。BDNFのレベルの低下は、AD患者30^、31、32の血清および脳において報告された。タウ過剰発現または過剰リン酸化は、初代ニューロンおよびAD動物モデルにおけるBDNF発現をダウンレギュレートすることが見出された33、^34、35。さらに、BDNFは、インビトロおよびインビボでβアミロイド誘導神経毒性に対して保護効果を有することが報告された³⁶。ラット脳へのBDNFの直接投与は、認知障害のある動物における学習および記憶を増加させることが示された³⁷。BDNF/TrkBは、AD^28,38を含む神経学的および精神医学的障害を改善するための有効な標的として浮上した。ADにおける治療法の開発のためにBDNF/TrkBシグナル伝達経路を標的にすることは、この疾患の理解を潜在的に強化するであろう³⁹。残念なことに、BDNF自体は、その貧弱な薬物動態学的特性および有害な副作用のために治療として使用することができない⁴⁰。TrkB/BDNF経路の小分子活性化剤が、潜在的なTrkBリガンドとして探索されている⁴¹、^42、43。試験された低分子アゴニストのうち、7,8-ジヒドロキシフラボン(7,8-DHF)はBDNF/TrkB経路^41,44,45,46を活性化することが示されている。7,8-DHFの誘導体(R13;4-オキソ-2-フェニル-4H-クロメン-7,8-ジイルビス(メチルカルバメート))は、^AD47の可能性のある薬物として現在検討されている。最近、いくつかの抗うつ薬がTrkBに直接結合し、BDNFシグナル伝達を促進することによって作用することが示され、様々な神経学的障害を治療するための有効な標的としてTrkBを追求することの重要性をさらに強調する⁴⁸。

このプロトコルは、機能的なTrkBカラムおよびTrkB-NULLネガティブコントロールカラムをアセンブルするプロセスを記述している。カラムは、既知の天然物小分子リガンドである7,8-DHFを使用して特徴付けられます。さらに、TrkBと相互作用する化合物の同定のために、植物抽出物を例に挙げて複雑なマトリックスをスクリーニングするプロセスについて説明する。