Colonnes de chromatographie d’affinité de membrane cellulaire pour identifier les métabolites végétaux spécialisés interagissant avec le récepteur B de la tropomyosine kinase immobilisée

Les mélanges botaniques sont riches en composés pharmacologiquement actifs¹, servant de bonne source pour l’identification de nouveaux médicaments et conduit 2,3,4,5. La découverte de nouveaux médicaments à partir de produits naturels a été une approche fructueuse et de nombreux médicaments actuellement approuvés proviennent de composés identifiés pour la première fois dans la nature. La diversité chimique des composés naturels est difficile à égaler par des bibliothèques artificielles de molécules synthétisées chimiquement. De nombreux composés naturels interagissent avec et modulent des cibles protéiques humaines et peuvent être considérés comme des molécules semblables à des médicaments optimisées sur le plan de l’évolution⁶. Ces composés naturels sont particulièrement bien adaptés à l’identification des plombs médicamenteux à utiliser dans les troubles neurologiques⁶. Deux des médicaments actuellement approuvés par la FDA pour la prise en charge de la maladie d’Alzheimer (MA) sont dérivés d’alcaloïdes naturels, à savoir: la galantamine et la rivastigmine (un dérivé de la physostigmine)⁶. La L-DOPA, actuellement le médicament le plus couramment prescrit pour la maladie de Parkinson, a été identifiée pour la première fois à partir de la fève (Vicia faba L.) ⁷. Pergolide et lisuride, agonistes des récepteurs dopaminergiques sont les dérivés des alcaloïdes naturels de l’ergot du champignon parasite Claviceps purpurea⁸. La réserpine, un alcaloïde isolé de la racine de serpent indienne (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) a été l’un des premiers médicaments antipsychotiques⁹. Récemment, la réponse immunitaire dérégulée et l’inflammation systémique ont été liées au développement de nombreuses affections neurologiques, telles que les troubles dépressifs majeurs ou les maladies neurodégénératives¹⁰. Un régime à base de plantes ainsi que d’autres interventions sur le mode de vie ont été trouvés pour améliorer les capacités cognitives et fonctionnelles chez les^{personnes âgées 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . Certaines molécules électrophiles appartenant aux triterpènes et aux polyphénols ont été trouvées pour moduler les réponses inflammatoires dans les modèles in vitro et in vivo ¹². Par exemple, les composés naturels contenant du α β carbonyle insaturé (p. ex., curcumine, cinnamaldéhyde) ou du groupe isothiocyanate (p. ex., sulforaphane) interfèrent avec la dimérisation du récepteur 4 de type Toll (TLR4) inhibant la synthèse en aval de cytokines pro-inflammatoires dans une lignée cellulaire pro-B dépendante de l’interleukine-3 murine^12,22 . Les données épidémiologiques indiquent clairement que les composés phytochimiques alimentaires, présents dans les matrices alimentaires complexes, peuvent également constituer une source viable de nouveaux médicaments⁶.

L’un des principaux obstacles à l’identification des molécules biologiquement actives présentes dans les extraits de plantes, y compris les aliments à base de plantes, est la complexité des échantillons étudiés. Traditionnellement, les composés individuels sont isolés, purifiés et ensuite testés pour leur activité biologique. Cette approche conduit généralement à l’identification des composés les plus abondants et les mieux caractérisés. Les approches phénotypiques de découverte de médicaments sans cible moléculaire définie reposent sur le fractionnement bioguidé de mélanges complexes²³. Dans cette approche, un extrait est fractionné en sous-fractions moins complexes qui sont ensuite testées dans des essais phénotypiques. L’isolement et la purification des composés actifs sont guidés par l’activité biologique vérifiée dans le test. La connaissance de l’identité d’une cible médicamenteuse spécifiée peut accélérer considérablement l’identification des composés pharmacologiquement actifs présents dans les mélanges complexes. Ces approches sont généralement basées sur l’immobilisation de la cible moléculaire, par exemple, une enzyme, sur une surface solide, comme les billes magnétiques²³. Les cibles immobilisées sont ensuite utilisées dans les expériences de criblage, ce qui permet d’isoler les composés interagissant avec la cible. Bien que cette approche ait été largement utilisée dans l’identification de composés ciblant les protéines cytosoliques, elle a été moins couramment appliquée dans l’identification des produits chimiques interagissant avec les protéines transmembranaires (TMP)²³. Un défi supplémentaire dans l’immobilisation des TMP provient du fait que l’activité de la protéine dépend de son interaction avec les phospholipides de la membrane cellulaire et d’autres molécules dans la bicouche telles que le cholestérol^23,24. Il est important de préserver ces interactions subtiles entre les protéines et leur environnement bicouche phospholipidique natif lorsque l’on tente d’immobiliser la cible transmembranaire.

Dans la chromatographie d’affinité sur membrane cellulaire (CMAC), les fragments de membrane cellulaire, et non les protéines purifiées, sont immobilisés sur les particules de phase stationnaire de la membrane artificielle (IAM)²³. Les phases stationnaires IAM sont préparées en liant de manière covalente des analogues de la phosphatidylcholine sur de la silice. Récemment, de nouvelles classes de phases stationnaires IAM ont été développées dans lesquelles les groupes amine et silanol libres sont plafonnés (IAM. PC. Particules DD2). Au cours de la préparation des colonnes CMAC, des fragments de membrane cellulaire sont immobilisés à la surface des particules IAM par adsorption.

Les colonnes de l’ACMC ont été utilisées à ce jour pour immobiliser différentes classes de TMP, y compris les canaux ioniques (p. ex., les récepteurs nicotiniques), les RCPG (p. ex., les récepteurs opioïdes), les transporteurs de protéines (p. ex., p-glycoprotéine), ^etc.24. Les cibles protéiques immobilisées ont été utilisées dans la caractérisation de la pharmacodynamique (p. ex., constante de dissociation, Kd) ou dans la détermination de la cinétique de liaison (k_on et k_off) de ligands de petites molécules interagissant avec la cible ainsi que dans le processus d’identification de nouveaux médicaments potentiels présents dans des matrices complexes²⁴ . Nous présentons ici la préparation de colonnes CMAC avec le récepteur immobilisé de la tropomyosine kinase B (TrkB), qui est devenu une cible viable pour la découverte de médicaments pour de nombreux troubles du système nerveux.

Des études antérieures ont montré que l’activation de la voie du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) / TrkB est associée à l’amélioration de certaines affections neurologiques, telles que la MA ou le trouble dépressif majeur 25,26,27,28. Il a été rapporté que les niveaux de BDNF et son expression de récepteur TrkB diminuent dans la MA, et des réductions similaires altèrent la fonction hippocampique dans les modèles animaux de AD²⁹. Une diminution des taux de BDNF a été rapportée dans le sérum et le cerveau des patients atteints de MA 30,31,32. La surexpression de Tau ou l’hyperphosphorylation régulent à la baisse l’expression du BDNF dans les neurones primaires et les modèles animaux AD 33,34,35. De plus, le BDNF aurait des effets protecteurs sur la neurotoxicité induite par la β-amyloïde in vitro et in vivo³⁶. Il a été démontré que l’administration directe de BDNF dans le cerveau du rat augmentait l’apprentissage et la mémoire chez les animaux atteints de troubles cognitifs³⁷. BdNF /TrkB est apparu comme une cible valide pour améliorer les troubles neurologiques et psychiatriques, y compris AD^28,38. Le ciblage de la voie de signalisation BDNF/TrkB pour le développement de thérapies dans la MA améliorera potentiellement notre compréhension de la maladie³⁹. Malheureusement, le BDNF lui-même ne peut pas être utilisé comme traitement en raison de ses mauvaises propriétés pharmacocinétiques et de ses effets secondaires indésirables⁴⁰. Les activateurs de petites molécules des voies TrkB/BDNF ont été explorés en tant que ligands TrkB potentiels 41,42,43. Parmi les agonistes de petites molécules testés, la 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF), il a été démontré qu’il active la voie BDNF/TrkB 41,44,45,46. Un dérivé du 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phényl-4H-chromene-7,8-diyl bis(méthylcarbamate)) est actuellement à l’étude comme médicament possible pour AD⁴⁷. Récemment, il a été démontré que plusieurs antidépresseurs agissent en se liant directement au TrkB et en favorisant la signalisation du BDNF, soulignant davantage l’importance de poursuivre le TrkB comme cible valide pour traiter divers troubles neurologiques⁴⁸.

Le protocole décrit le processus d’assemblage de la colonne TrkB fonctionnelle et de la colonne de contrôle négatif TrkB-NULL. Les colonnes sont caractérisées à l’aide d’un ligand de petite molécule de produit naturel connu: le 7,8-DHF. En outre, nous décrivons le processus de criblage de matrices complexes, en utilisant l’extrait de plante comme exemple, pour l’identification des composés interagissant avec TrkB.