Trapianto intracerebrale e monitoraggio della bioluminescenza in vivo delle cellule progenitrici neurali umane nel cervello del topo

NOTA: Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti in conformità con le linee guida governative, istituzionali e ARRIVE e sono stati approvati dall’Ufficio veterinario cantonale di Zurigo. Sono stati utilizzati topi adulti maschi e femmine diabetici non obesi SCID gamma (NSG) (10-14 settimane, 25-35 g). I topi sono stati alloggiati in gabbie regolari di tipo II/ III in gruppi di almeno due animali per gabbia in una stanza a umidità e temperatura controllata con un ciclo luce/buio costante di 12/12 ore. .). 1. Coltura cellulare e trasduzione virale Differenziare le cellule progenitrici neurali (NPC) dalle iPSC utilizzando inibitori di piccole molecole come descritto in precedenza14. Coltura NPC15 dal passaggio 2 in poi in Neural Stem cell Maintenance Medium (NSMM; Tabella 1) integrato con piccole molecole (Tabella 1) in piastre a 6 pozzetti (2 mL di mezzo per pozzetto) rivestite con poli-ornitina/laminina521 (pLO/L521). Cambia il mezzo ogni giorno.NOTA: Per passare gli NPC, aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare per pozzetto (vedere la Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 1 minuto fino a quando la maggior parte delle cellule si stacca. Per il rivestimento, incubare 150 μL di pLO in 1 mL di 0,1 M di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per pozzetto per 2 ore a temperatura ambiente (RT). Dopo tre lavaggi con PBS, incubare 10 μg di L521 in 1 mL di PBS per pozzetto per 2 ore a RT. Per la trasduzione virale, placcare 50.000 cellule per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti rivestita con pLO/L521 e aggiungere vettori virali preconfezionati (pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro, LL410PA-1) a ciascun pozzetto.NOTA: Le unità infettive totali (IFU) fornite sono >2 × 106 IFU e sono sufficienti per infettare 100.000 cellule a una molteplicità di infezione (MOI) di 20. Il conteggio delle celle è stato eseguito con un contatore di celle automatizzato. L’efficienza di trasduzione dipende fortemente dalla linea cellulare utilizzata. Il lavoro con lentivirus richiede il rispetto delle linee guida locali per i prodotti di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Incubare le cellule a 37 °C per 72 ore, continuando i cambi giornalieri del mezzo. Confermare la trasduzione di successo controllando le cellule per l’espressione GFP in un microscopio a fluorescenza. Impostare l’ingrandimento del microscopio su 10x o 20x e utilizzare l’intervallo di eccitazione (460-480 nm) e di emissione (490-520 nm) appropriati per rilevare le cellule che esprimono GFP trasdotte. Quantificare il rapporto trasdotto GFP e cellule totali per stimare l’efficacia generale della trasduzione.NOTA: con questo protocollo sono stati raggiunti tassi di trasduzione del 65-95%. Un’efficacia di trasduzione del >50% è raccomandata come criterio go/no-go prima del trapianto. Se non è possibile ottenere un’efficacia di trasduzione del 50%, eseguire la selezione della puromicina o ordinare le cellule utilizzando la citometria a flusso per aumentare la resa delle cellule trasdotte. Facoltativo: congelamento delle cellule Ruotare le cellule verso il basso (300 × g, 5 min) ed eliminare il surnatante. Risospesare il pellet in 1 mL di mezzo di congelamento (vedere la tabella dei materiali) e trasferire la sospensione in flaconcini per ottenere 106 celle/flaconcino. Trasferire le celle in scatole di congelamento per 24 ore a -80 °C e poi a -150 °C per la conservazione a lungo termine. 2. Preparazione cellulare per il trapianto Raccogliere una fiala di cellule da -150 °C di conservazione e trasferirla in laboratorio. Contare le celle utilizzando un contatore di celle automatizzato.NOTA: il flaconcino contiene 1,5-2 × 106 cellule. Trasferire rapidamente il flaconcino a bagnomaria a 37 °C fino a quando non rimangono cristalli di ghiaccio (2-3 min).NOTA: È importante scongelare rapidamente per ridurre al minimo qualsiasi danno alle membrane cellulari. Non immergere completamente il flaconcino nel bagno d’acqua in quanto può aumentare il rischio di contaminazione. Trasferire il flaconcino nell’armadio di biosicurezza e pipettare l’intero contenuto (~1 mL) in un tubo conico sterile da 15 mL.NOTA: Il lavoro con cellule trasdotte lentiviralmente richiede BSL-2. Tuttavia, le cellule di lavaggio e passaggio rimuovono le particelle virali dal mezzo. Le informazioni su quando è consentito un trasferimento da BSL-2 a BSL-1 devono essere ottenute dalle autorità locali. Aggiungere 9 mL di PBS sterile 1x e centrifugare per 5 minuti a 300 × g, RT. Rimuovere il surnatante mediante aspirazione utilizzando una pipetta (1-10 ml); inclinare delicatamente la sospensione verso la punta della pipetta e iniziare ad aspirare. Fare attenzione a non disturbare il pellet. Lavare le cellule riesempendo in 10 ml di PBS sterile 1x.NOTA: sbattere delicatamente il tubo per risospese le celle nel volume residuo. Triturare lentamente la sospensione cellulare utilizzando una pipetta da 1 mL fino a quando non contiene grumi o aggregati. Contare le celle prima dello spin finale utilizzando un contatore di celle automatizzato. Centrifuga per 5 min a 300 × g, RT. Rimuovere il surnatante (fase 2.5) e risospese il pellet cellulare nel volume richiesto di PBS sterile ad una concentrazione di 8 × 104 cellule/μL. Posizionare le cellule sul ghiaccio e utilizzarle per il trapianto entro le successive 5 ore.NOTA: in questo protocollo è stato utilizzato un volume di 1,6 × 105 celle/2 μL di PBS. 3. Procedura di trapianto Preparazione per la chirurgia Pulire e sterilizzare l’attrezzatura chirurgica. Preparare il dispositivo stereotassico e il sistema di pompe di microiniezione.NOTA: è fondamentale testare la siringa Hamilton e l’ago da 30 G e 2 pollici prima di iniziare. Inserire l’ago in un tubo contenente NaCl sterile allo 0,9% e aspirare lentamente la soluzione dentro e fuori. Impostare la macchina per anestesia. Testare la macchina prima di coinvolgere qualsiasi animale. Pulire la camera di induzione con il 70% di etanolo. Preparazione di animali Tenere i topi per almeno 7 giorni prima degli esperimenti in condizioni standard per acclimatarli.NOTA: per questo protocollo sono stati utilizzati i seguenti animali: femmina NOD/SCID/IL2rγnull (30-35 g, noto anche come NSG) e femmina C57BL/6J (20-25 g, nota anche come B6). La procedura può essere eseguita anche con topi maschi. Misurare il peso corporeo del topo e regolare la dose dell’antidolorifico da iniettare. Somministrare carprofene (5 mg/kg di peso corporeo) per via intraperitoneale per ridurre il dolore e/o prevenire una risposta infiammatoria. Anestetizzare gli animali utilizzando isoflurano (3% in fase di induzione e 1,5-2% in fase di mantenimento durante l’intervento chirurgico) vaporizzato in ossigeno.NOTA: L’anestesia gassosa è preferita a causa di un rapido risveglio dopo la procedura chirurgica e perché i livelli di gas anestetico possono essere facilmente regolati. Utilizzare riflessi nocicettivi per assicurarsi che l’animale sia profondamente anestetizzato (ad esempio, pizzichi delle dita dei piedi). Quando viene raggiunta l’anestesia profonda, trasportare l’animale dalla camera di induzione al telaio stereotassico. Mantenere l’anestesia usando una maschera per il viso.NOTA: La frequenza respiratoria deve essere monitorata visivamente durante la procedura (40-60 respiri al minuto). Utilizzare un tampone riscaldante per evitare l’ipotermia durante la procedura. Applicare lubrificante oftalmico per evitare che gli occhi si secchino. Rasare il cuoio capelluto del topo con un rasoio elettrico e disinfettare la pelle con una soluzione di betadina al 5% utilizzando tamponi di cotone. Fissare la testa del mouse e inserire le barre auricolari nel meato esterno.NOTA: Fare attenzione a non danneggiare i timpani. Applicare l’unguento alla lidocaina su entrambi i canali uditivi prima di inserire le barre auricolari. Per verificare se la testa dell’animale è in una posizione stabile, spingere con attenzione verso il basso sulla testa per vedere se c’è movimento. Se si nota un movimento, la barra dell’orecchio, il posizionamento del nasello o entrambi non sono corretti e devono essere regolati. Craniotomia Usa una lama chirurgica per fare un taglio lungo la linea mediana abbastanza grande da rivelare i punti di riferimento lambda e bregma.NOTA: i riavvolgitori cutanei possono essere applicati per mantenere esposto il cranio. Ritrarre il periostio e la fascia con un bisturi e utilizzare tamponi di cotone sterili per asciugare la superficie del cranio. Regolare le barre dell’orecchio e della bocca per standardizzare la posizione della testa.NOTA: le coordinate verticali per bregma e lambda devono essere identiche per il posizionamento anteroposteriore. Posizionare l’ago in corrispondenza del bregma e calcolare le coordinate dei punti di iniezione desiderati (le coordinate di interesse scelte per questo protocollo: anteriore-posteriore (AP): + 0,5 mm, mediale-laterale (ML): + 1,5 mm). Spostare l’ago in quel punto e contrassegnarlo con inchiostro.NOTA: Le coordinate sono state scelte in base al Franklin and Paxinos Mouse Brain Atlas 16. Le distanze sono mm dal bregma. Applicare NaCl sterile allo 0,9% sul cranio e praticare un foro con un diametro di 2-3 mm attraverso il cranio con un trapano chirurgico dentale. Spostare l’ago sulla superficie della dura e calcolare le coordinate di profondità. Procedura di trapianto Risospesso le cellule del tubo (fase 2.9) e aspirare 2 μL di sospensione cellulare in una siringa (5 μL o 10 μL).NOTA: Assicurarsi che non siano presenti bolle d’aria nella sospensione cellulare. La siringa deve essere mantenuta in posizione orizzontale fino a quando non viene montata nel dispositivo stereotassico per evitare la sedimentazione cellulare. Posizionare la siringa sopra il sito target (coordinate calcolate: AP: + 0,5 mm, ML: + 1,5 mm) e spostare lentamente l’ago sulla superficie della dura.NOTA: Se non si è sicuri delle coordinate corrette, eseguire iniezioni con un colorante e una valutazione istologica del sito di iniezione prima di trapiantare le cellule (per maggiori dettagli, vedere 17). Guidare l’ago ad una velocità di 0,02 mm/s nel cervello fino alla profondità corretta (la coordinata scelta per questo protocollo è dorsale-ventrale (DV) – 0,8 mm). Superare la profondità di 0,1 mm e prelevare l’ago sulla stessa distanza per creare una tasca per le cellule iniettate. Applicare l’adesivo tissutale intorno all’ago usando una pinza per prevenire la fuoriuscita di cellule. Iniettare 2 μL della sospensione cellulare preparata ad una velocità costante di 3-5 nL/s.NOTA: La procedura di iniezione durerà tra 7 e 12 min. Dopo l’iniezione, lasciare l’ago in posizione per almeno 5 minuti prima di ritirarlo lentamente. Applicare l’adesivo per tessuti per sigillare il foro nel cranio e attendere altri 2 minuti. Suture e post-cura Applicare una soluzione sterile di NaCl allo 0,9% sul cranio esposto per evitare la disidratazione. Chiudi la ferita con un filo di sutura di seta 5/0. Idratare l’animale con 0,5 ml di soluzione di lattato di suoneria iniettata per via sottocutanea nella parte bassa della schiena. Interrompere la somministrazione dell’anestesia e rimuovere con cura il mouse dall’apparato stereotassico e rimetterlo in una gabbia tenuta su una piastra riscaldante. Monitorare gli animali durante la fase acuta post-infortunio. Controlla la sutura, il peso dell’animale e la salute generale almeno due volte al giorno. 4. Imaging in vivo Preparazione di luciferina Scongelare il sale di potassio D-luciferina a RT e preparare una soluzione madre fresca di D-luciferina a 30 mg/ml in PBS. Sterilizzare la soluzione madre attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm.NOTA: si consiglia l’uso immediato della soluzione di lavoro. Se necessario, la luciferina disciolta può essere conservata a -20 °C. Tuttavia, la memorizzazione prolungata può causare la degradazione del segnale. La luciferina è un reagente sensibile alla luce; tenerlo lontano dalla luce diretta quando possibile. Possono anche essere presi in considerazione substrati alternativi, ad esempio ciclici, per migliorare il limite di risoluzione18. Imaging Configurazione inizialeNOTA: l’imaging a bioluminescenza è stato eseguito utilizzando un sistema di imaging in vivo (vedere la Tabella dei materiali) costituito da una camera scura e una telecamera CCD (Charge-Coupled Device) raffreddata. Fare doppio clic sull’icona del software Living Image e selezionare un ID utente dall’elenco a discesa. Fare clic su Inizializza nel pannello di controllo visualizzato. Una volta completato il processo di inizializzazione, la casella della temperatura nel pannello di controllo diventerà verde. Nel pannello di controllo , selezionare le caselle Luminescente e Fotografia e selezionare Esposizione automatica (~ 60 s). Selezionare un campo visivo (D/12,5 cm è stato scelto per questo protocollo). Immettere l’altezza del soggetto (1,5 cm) e selezionare l’opzione Usa messa a fuoco altezza soggetto . Impostare manualmente i seguenti parametri: binning di grandi dimensioni, f/2, filtro di eccitazione bloccato e filtro di emissione aperto. Determinare la quantità di iniezione di D-luciferina a 300 mg/kg di peso corporeo. NOTA: La dose standard raccomandata è di 150 mg/kg di D-luciferina. Questa procedura è stata regolata secondo un protocollo che riportava una maggiore sensibilità utilizzando 300 mg/kg18. Iniettare la luciferina per via intraperitoneale (i.p.).NOTA: Se l’animale deve essere sedato prima dell’iniezione, tenere presente che può prolungare il tempo di massima espressione della luciferasi. Attendere 5 minuti, quindi anestetizzare gli animali con un apporto continuo di isoflurano (4,5% in fase di induzione e 1,5-2% in fase di mantenimento durante la procedura di imaging). Applicare lubrificante oftalmico sugli occhi, quindi radere gli animali sedati sulla regione della testa usando un rasoio per capelli convenzionale. Posizionare gli animali nella camera di imaging e iniziare l’imaging 15 minuti dopo l’iniezione di luciferina facendo clic su Acquisisci nel pannello di controllo . 5. Perfusione Anestetizzare gli animali mediante iniezione i.p. di pentobarbital di sodio (150 mg/kg di peso corporeo). Attendere che il mouse non risponda più a stimoli dolorosi, come i pizzichi delle dita dei piedi. Appoggia il mouse sulla schiena e usa una pinzetta e le forbici per aprire la cavità toracica. Utilizzare forbici standard per aprire il diaframma. Esporre il cuore e inserire un ago (dal tubo con ringer/soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA)) nell’apice del ventricolo sinistro.NOTA: Fare attenzione a mantenere la punta dell’ago nel lume del ventricolo. Tagliare il ventricolo destro usando le forbici. Perfusare con soluzione di suoneria (può essere mantenuta a RT) per 3-4 min (portata: 17 mL/min). Continua fino a quando il cuore è pulito. Commutare il rubinetto per consentire il flusso di PFA (conservare a 4 °C; tenere sul ghiaccio durante la procedura) e perfusare per altri 5 minuti (~ 100 ml). Arrestare la pompa e rimuovere l’ago dal ventricolo sinistro.NOTA: La perfusione con PFA preserva uniformemente l’integrità dei tessuti. Facilita anche la conservazione del segnale GFP nei trapianti che altrimenti potrebbero andare persi a causa della diffusione. 6. Trattamento Raccolta del tessuto Rimuovere la testa usando le forbici standard e fare un’incisione della linea mediana nella pelle. Gira la pelle sopra gli occhi per esporre il cranio. Iniziare dalla parte caudale nel punto dell’osso parietale e fare una piccola incisione usando le forbici a molla. Far avanzare le forbici rostralmente lungo la sutura medio-gittale fino a un punto tra gli occhi. Ricominciare dalla parte caudale ed effettuare due tagli paralleli e a ~4 mm di distanza nel piano sagittale.NOTA: Fare attenzione a non danneggiare il cervello premendo le forbici contro la superficie interna del cranio. Utilizzare una pinza per inclinare attentamente un lato dell’osso parietale e romperlo. Fai lo stesso con l’altra parte.NOTA: Utilizzare una microspatula per liberare l’osso dalle meningi; altrimenti, possono danneggiare il cervello mentre rompono il cranio. Se rimangono parti dell’osso frontale, fare un piccolo taglio per inclinare e rompere la piastra ossea. Per rilasciare il cervello, far scorrere con attenzione la microspatula sotto il cervello (bulbi olfattivi) e inclinarla delicatamente verso l’alto. Dopo la raccolta, mantenere il cervello in soluzione di PFA al 4% per 4-6 ore a 4 °C. Trasferirlo su PBS sterile 1x in seguito. Immunoistochimica Trasferire il cervello in una soluzione di saccarosio al 30% per almeno 48 ore a 4 °C per prevenire la formazione di cristalli durante il congelamento. Utilizzare un microtomo scorrevole per tagliare sezioni coronali con uno spessore di 40 μm. Raccogliere e conservare le sezioni come sezioni flottanti (in una piastra a 24 pozzetti) in una soluzione crioprotettiva (Tabella 1) a -20 °C fino a ulteriore lavorazione. Risciacquare le sezioni con 450 μL di 1x PBS per ogni pozzetto (3 volte, 5 min ciascuna, RT). Bloccare siti non specifici con 450 μL di soluzione di blocco per ciascun pozzo (Tabella 1) per 1 ora a RT. Incubare ogni pozzetto con 450 μL di anticorpi primari a 4 °C durante la notte. Diluire gli anticorpi 1:200 in siero d’asino al 3%; 0,1% Triton-X-100 in PBS. Per identificare il materiale del donatore nell’ambiente ospite, utilizzare un anticorpo ai nuclei specifici dell’uomo (Anticorpo anti-nuclei umani, clone 235-1). Lavare le sezioni con 450 μL di 1x PBS per ogni pozzetto (3 volte, 5 minuti ciascuna, RT). Incubare ogni pozzetto con 450 μL di corrispondenti anticorpi secondari fluorescenti per 2-3 ore (RT). Diluire gli anticorpi nel siero d’asino al 3%; 0,1% Triton-X-100 in 1x PBS. Lavare le sezioni con 450 μL di 1x PBS per ogni pozzetto (3 volte, 5 minuti ciascuna, RT). Colorare i nuclei con 450 μL di 0,1 μg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).