Intracerebrale Transplantation und In Vivo Biolumineszenz-Tracking von menschlichen neuralen Vorläuferzellen im Gehirn der Maus

HINWEIS: Alle Experimente mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit den staatlichen, institutionellen und ARRIVE-Richtlinien durchgeführt und vom kantonalen Veterinäramt Zürich genehmigt. Erwachsene männliche und weibliche nicht-fettleibige diabetische SCID gamma (NSG) Mäuse (10-14 Wochen, 25-35 g) wurden verwendet. Die Mäuse wurden in regulären Käfigen des Typs II/III in Gruppen von mindestens zwei Tieren pro Käfig in einem feuchtigkeits- und temperaturkontrollierten Raum mit einem konstanten Hell/Dunkel-Zyklus von 12/12 h untergebracht. .). 1. Zellkultur und Virustransduktion Differenzieren Sie neuronale Vorläuferzellen (NPCs) von iPS-Zellen unter Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren, wie zuvor beschrieben14. Kultur-NPCs15 ab Passage 2 in Neural Stem cell Maintenance Medium (NSMM; Tabelle 1) ergänzt mit kleinen Molekülen (Tabelle 1) in 6-Well-Platten (2 ml Medium pro Well), die mit Poly-Ornithin/Laminin521 (pLO/L521) beschichtet sind. Wechseln Sie das Medium täglich.HINWEIS: Um NPCs zu passieren, fügen Sie 1 ml Zelldissoziationsreagenz pro Vertiefung hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie bei 37 ° C für 1 Minute, bis sich die meisten Zellen lösen. Für die Beschichtung 150 μL pLO in 1 ml 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pro Vertiefung für 2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Nach drei Wäschen mit PBS 10 μg L521 in 1 ml PBS pro Bohrung für 2 h bei RT inkubieren. Für die virale Transduktion werden 50.000 Zellen pro Vertiefung in einer mit pLO/L521 beschichteten 24-Well-Platte plattiert und vorverpackte virale Vektoren (pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro, LL410PA-1) zu jeder Vertiefung hinzugefügt.HINWEIS: Die Gesamtzahl der bereitgestellten infektiösen Einheiten (IFU) beträgt >2 × 106 IFU und reicht aus, um 100.000 Zellen bei einer Multiplizität von Infektionen (MOI) von 20 zu infizieren. Die Zellzählung wurde mit einem automatisierten Zellzähler durchgeführt. Die Transduktionseffizienz hängt stark von der verwendeten Zelllinie ab. Die Arbeit mit dem Lentivirus erfordert die Einhaltung der lokalen Richtlinien für Produkte der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 72 h, während Sie die täglichen Mediumswechsel fortsetzen. Bestätigen Sie die erfolgreiche Transduktion, indem Sie die Zellen in einem Fluoreszenzmikroskop auf GFP-Expression überprüfen. Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops auf 10x oder 20x ein und verwenden Sie den entsprechenden Anregungs- (460-480 nm) und Emissionsbereich (490-520 nm), um transduzierte GFP-exprimierende Zellen zu erkennen. Quantifizieren Sie das Verhältnis von GFP-transduzierten zu Gesamtzellen, um die allgemeine Transduktionswirksamkeit abzuschätzen.HINWEIS: Mit diesem Protokoll wurden Transduktionsraten von 65-95% erreicht. Eine Transduktionswirksamkeit von >50% wird als Go/No-Go-Kriterium vor der Transplantation empfohlen. Wenn eine Transduktionseffizienz von 50% nicht erreicht werden kann, führen Sie eine Puromycin-Selektion durch oder sortieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie, um die Ausbeute der transduzierten Zellen zu erhöhen. Optional: Einfrieren von Zellen Drehen Sie die Zellen nach unten (300 × g, 5 min) und verwerfen Sie den Überstand. Resuspendiert das Pellet in 1 ml Gefriermedium (siehe Materialtabelle) und überträgt die Suspension in Durchstechflaschen, um 106 Zellen/Durchstechflasche zu erhalten. Die Zellen für 24 h bei -80 °C in Gefrierboxen und dann zur Langzeitlagerung auf -150 °C überführen. 2. Zellvorbereitung für die Transplantation Sammeln Sie eine Durchstechflasche mit Zellen aus der Lagerung von -150 °C und bringen Sie sie ins Labor. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines automatisierten Zellzählers.HINWEIS: Die Durchstechflasche enthält 1,5-2 × 106 Zellen. Überführen Sie das Fläschchen schnell in ein 37 ° C warmes Wasserbad, bis keine Eiskristalle mehr vorhanden sind (2-3 min).HINWEIS: Es ist wichtig, schnell aufzutauen, um Schäden an Zellmembranen zu minimieren. Tauchen Sie die Durchstechflasche nicht vollständig in das Wasserbad, da dies das Risiko einer Kontamination erhöhen kann. Die Durchstechflasche in die Biosicherheitskabine geben und den gesamten Inhalt (~1 ml) in ein steriles 15 mL konisches Röhrchen pipettieren.HINWEIS: Die Arbeit mit lentiviral transduzierten Zellen erfordert BSL-2. Wasch- und Passierzellen entfernen jedoch virale Partikel aus dem Medium. Informationen darüber, wann ein Transfer von BSL-2 zu BSL-1 zulässig ist, sollten von den lokalen Behörden eingeholt werden. Fügen Sie 9 ml steriles 1x PBS hinzu und zentrifugieren Sie für 5 min bei 300 × g, RT. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration mit einer Pipette (1-10 ml); Neigen Sie die Aufhängung vorsichtig zur Pipettenspitze und beginnen Sie mit dem Absaugen. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Waschen Sie die Zellen, indem Sie in 10 ml sterilem 1x PBS resuspendieren.HINWEIS: Halten Sie die Röhre vorsichtig fest, um die Zellen im Restvolumen zu resuspendieren. Triturate die Zellsuspension langsam mit einer 1 ml Pipette, bis sie keine Klumpen oder Aggregate mehr enthält. Zählen Sie die Zellen vor dem letzten Spin mit einem automatisierten Zellzähler. Zentrifuge für 5 min bei 300 × g, RT. Entfernen Sie den Überstand (Schritt 2.5) und suspendieren Sie das Zellpellet im erforderlichen Volumen sterilen PBS auf eine Konzentration von 8 × 104 Zellen/μL. Legen Sie die Zellen auf Eis und verwenden Sie sie für die Transplantation innerhalb der nächsten 5h.HINWEIS: In diesem Protokoll wurde ein Volumen von 1,6 × 105 Zellen/2 μL PBS verwendet. 3. Transplantationsverfahren Vorbereitung auf die Operation Reinigen und sterilisieren Sie die chirurgischen Geräte. Bereiten Sie das stereotaktische Gerät und das Mikroinjektionspumpensystem vor.HINWEIS: Es ist wichtig, die Hamilton-Spritze und die 30 G, 2-Zoll-Nadel vor dem Start zu testen. Führen Sie die Nadel in ein Röhrchen mit sterilem 0,9% NaCl ein und ziehen Sie die Lösung langsam ein und aus. Richten Sie das Anästhesiegerät ein. Testen Sie die Maschine, bevor Sie Tiere einbeziehen. Reinigen Sie die Induktionskammer mit 70% Ethanol. Vorbereitung von Tieren Halten Sie die Mäuse mindestens 7 Tage vor den Experimenten unter Standardbedingungen, um sie zu akklimatisieren.HINWEIS: Die folgenden Tiere wurden für dieses Protokoll verwendet: weibliches NOD/SCID/IL2rγnull (30-35 g, auch bekannt als NSG) und weibliches C57BL/6J (20-25 g, auch bekannt als B6). Das Verfahren kann auch mit männlichen Mäusen durchgeführt werden. Messen Sie das Körpergewicht der Maus und passen Sie die Dosis des zu injizierenden Schmerzmittels an. Carprofen (5 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal verabreichen, um Schmerzen zu lindern und/oder eine Entzündungsreaktion zu verhindern. Anästhesieren Sie die Tiere mit Isofluran (3% in der Induktionsphase und 1,5-2% in der Erhaltungsphase während der Operation), das in Sauerstoff verdampft ist.HINWEIS: Die Gasanästhesie wird aufgrund eines schnellen Aufwachens nach dem chirurgischen Eingriff und der einfachen Einstellung des Anästhesiegasgehalts bevorzugt. Verwenden Sie nozizeptive Reflexe, um sicherzustellen, dass das Tier tief betäubt ist (z. B. Zehenkneifen). Wenn die Tiefenanästhesie erreicht ist, transportieren Sie das Tier von der Induktionskammer in den stereotaktischen Rahmen. Halten Sie die Anästhesie mit einer Gesichtsmaske aufrecht.HINWEIS: Die Atemfrequenz muss während des gesamten Eingriffs visuell überwacht werden (40-60 Atemzüge pro Minute). Verwenden Sie ein Wärmekissen, um Unterkühlung während des Eingriffs zu vermeiden. Tragen Sie ophthalmisches Gleitmittel auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern. Rasieren Sie die Kopfhaut der Maus mit einem elektrischen Rasierer und desinfizieren Sie die Haut mit 5% iger Betadinlösung mit Wattestäbchen. Befestigen Sie den Mauskopf und setzen Sie die Ohrstangen in den äußeren Meatus ein.HINWEIS: Achten Sie darauf, das Trommelfell nicht zu beschädigen. Tragen Sie Lidocain-Salbe auf beide Gehörgänge auf, bevor Sie die Ohrstangen einsetzen. Um zu überprüfen, ob sich der Kopf des Tieres in einer stabilen Position befindet, drücken Sie vorsichtig auf den Kopf, um zu sehen, ob sich Bewegung befindet. Wenn Bewegung bemerkt wird, sind entweder die Ohrstange, die Platzierung des Nasenstücks oder beides falsch und müssen neu eingestellt werden. Kraniotomie Verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um einen Schnitt entlang der Mittellinie zu machen, der groß genug ist, um die Lambda- und Bregma-Wahrzeichen zu enthüllen.HINWEIS: Hautretraktoren können angewendet werden, um den Schädel freizulegen. Ziehen Sie das Periost und die Faszie mit einem Skalpell zurück und verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um die Schädeloberfläche zu trocknen. Passen Sie die Ohr- und Mundstangen an, um die Kopfposition zu standardisieren.HINWEIS: Die vertikalen Koordinaten für Bregma und Lambda müssen für die anteroposteriore Positionierung identisch sein. Legen Sie die Nadel an die Bregma und berechnen Sie die Koordinaten der gewünschten Injektionspunkte (die für dieses Protokoll ausgewählten Koordinaten: anterior-posterior (AP): + 0,5 mm, medial-lateral (ML): + 1,5 mm). Bewegen Sie die Nadel an diesen Punkt und markieren Sie sie mit Tinte.HINWEIS: Die Koordinaten wurden basierend auf dem Franklin und Paxinos Mouse Brain Atlas 16 ausgewählt. Die Abstände vom Bregma betragen mm. Tragen Sie sterile 0,9% NaCl auf den Schädel auf und bohren Sie mit einem chirurgischen Zahnbohrer ein Loch mit einem Durchmesser von 2-3 mm durch den Schädel. Bewegen Sie die Nadel an die Oberfläche der Dura und berechnen Sie die Tiefenkoordinaten. Transplantationsverfahren Resuspendieren Sie die Zellen im Röhrchen (Schritt 2.9) und ziehen Sie 2 μL Zellsuspension in eine Spritze (5 μL oder 10 μL).HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Zellsuspension vorhanden sind. Die Spritze muss in einer horizontalen Position gehalten werden, bis sie in der stereotaktischen Vorrichtung montiert ist, um eine Zellsedimentation zu vermeiden. Platzieren Sie die Spritze über der Zielstelle (berechnete Koordinaten: AP: + 0,5 mm, ML: + 1,5 mm) und bewegen Sie die Nadel langsam an die Oberfläche der Dura.HINWEIS: Wenn Sie sich über die richtigen Koordinaten nicht sicher sind, führen Sie vor der Transplantation der Zellen Injektionen mit einem Farbstoff und einer histologischen Bewertung der Injektionsstelle durch (weitere Einzelheiten siehe 17). Führen Sie die Nadel mit einer Geschwindigkeit von 0,02 mm/s bis zur richtigen Tiefe in das Gehirn (die für dieses Protokoll gewählte Koordinate ist dorsal-ventral (DV) – 0,8 mm). Überschreiten Sie die Tiefe um 0,1 mm und ziehen Sie die Nadel über die gleiche Entfernung zurück, um eine Tasche für die injizierten Zellen zu schaffen. Tragen Sie Gewebekleber mit einer Pinzette um die Nadel auf, um ein Auslaufen von Zellen zu verhindern. Injizieren Sie 2 μL der vorbereiteten Zellsuspension mit einer konstanten Rate von 3-5 nL/s.HINWEIS: Der Injektionsvorgang dauert zwischen 7 und 12 Minuten. Lassen Sie die Nadel nach der Injektion mindestens 5 Minuten an Ort und Stelle, bevor Sie sie langsam zurückziehen. Tragen Sie Gewebekleber auf, um das Loch im Schädel zu versiegeln, und warten Sie weitere 2 Minuten. Nähte und Nachsorge Tragen Sie sterile 0,9% ige NaCl-Lösung auf den exponierten Schädel auf, um Austrocknung zu vermeiden. Schließen Sie die Wunde mit einem 5/0 Seidennahtfaden. Hydratisieren Sie das Tier mit 0,5 ml Ringerlaktatlösung, die subkutan in den unteren Rücken injiziert wird. Unterbrechen Sie die Anästhesieabgabe und entfernen Sie die Maus vorsichtig aus dem stereotaktischen Gerät und legen Sie sie wieder in einen Käfig, der auf einem Heizkissen gehalten wird. Überwachen Sie die Tiere während der akuten Phase nach der Verletzung. Überprüfen Sie die Naht, das Tiergewicht und die allgemeine Gesundheit mindestens zweimal täglich. 4. In-vivo-Bildgebung Herstellung von Luciferin Auftauen Sie D-Luciferin-Kaliumsalz bei RT auf und bereiten Sie eine frische Stammlösung von D-Luciferin bei 30 mg/ml in PBS vor. Sterilisieren Sie die Stammlösung durch einen 0,22 μm Spritzenfilter.HINWEIS: Die sofortige Verwendung der Arbeitslösung wird empfohlen. Bei Bedarf kann gelöstes Luciferin bei -20 °C gelagert werden. Eine längere Lagerung kann jedoch zu einer Verschlechterung des Signals führen. Luciferin ist ein lichtempfindliches Reagenz; Halten Sie es nach Möglichkeit aus direktem Licht heraus. Alternative Substrate, z. B. Cycluc, können ebenfalls in Betracht gezogen werden, um die Auflösungsgrenze18 zu verbessern. Bildgebung ErsteinrichtungHINWEIS: Die Biolumineszenzbildgebung wurde mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle) durchgeführt, das aus einer dunklen Kammer und einer gekühlten CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) bestand. Doppelklicken Sie auf das Symbol Living Image-Software und wählen Sie eine Benutzer-ID aus der Dropdown-Liste aus. Klicken Sie im angezeigten Bedienfeld auf Initialisieren. Sobald der Initialisierungsprozess abgeschlossen ist, wird die Temperaturbox im Bedienfeld grün. Aktivieren Sie im Bedienfeld die Kontrollkästchen Lumineszierend und Fotografieren und wählen Sie Automatische Belichtung (~60 s). Wählen Sie ein Sichtfeld aus (D/12,5cm wurde für dieses Protokoll ausgewählt). Geben Sie die Betreffhöhe (1,5 cm) ein und wählen Sie die Option Motivhöhe verwenden Fokusoption aus. Stellen Sie die folgenden Parameter manuell ein: großes Binning, f/2, blockierter Anregungsfilter und offener Emissionsfilter. Bestimmen Sie die Injektionsmenge von D-Luciferin bei 300 mg/kg Körpergewicht. HINWEIS: Die empfohlene Standarddosis beträgt 150 mg/kg D-Luciferin. Dieses Verfahren wurde gemäß einem Protokoll angepasst, das eine höhere Empfindlichkeit mit 300 mg/kg18 meldet. Injizieren Sie das Luciferin intraperitoneal (i.p.).HINWEIS: Wenn das Tier vor der Injektion sediert werden muss, beachten Sie, dass es die maximale Luciferase-Expressionszeit verlängern kann. Warten Sie 5 min, dann betäuben Sie die Tiere mit einer kontinuierlichen Zufuhr von Isofluran (4,5% in der Induktionsphase und 1,5-2% in der Erhaltungsphase während des bildgebenden Verfahrens). Tragen Sie Augenleitmittel auf die Augen auf und rasieren Sie dann die sedierten Tiere mit einem herkömmlichen Haarrasierer auf der Kopfregion. Legen Sie die Tiere in die Bildgebungskammer und beginnen Sie 15 Minuten nach der Luciferin-Injektion mit der Bildgebung, indem Sie im Bedienfeld auf Erfassen klicken. 5. Perfusion Betäuben Sie die Tiere durch eine i.p. Injektion von Natriumpentobarbital (150 mg/kg Körpergewicht). Warten Sie, bis die Maus nicht mehr auf schmerzhafte Reize wie Zehenkneifen reagiert. Legen Sie die Maus auf den Rücken und öffnen Sie mit einer Pinzette und einer Schere die Brusthöhle. Verwenden Sie eine Standardschere, um die Membran zu öffnen. Legen Sie das Herz frei und führen Sie eine Nadel (aus dem Schlauch mit Ringer/4% Paraformaldehydlösung (PFA)) in die Spitze des linken Ventrikels ein.HINWEIS: Achten Sie darauf, die Nadelspitze im Lumen des Ventrikels zu halten. Schneiden Sie den rechten Ventrikel mit einer Schere ab. Perfuse mit Ringerlösung (kann bei RT gehalten werden) für 3-4 min (Durchflussrate: 17 ml/min). Fahren Sie fort, bis das Herz rein ist. Schalten Sie den Absperrhahn um, um den PFA-Fluss zu ermöglichen (bei 4 ° C lagern; während des Eingriffs auf Eis halten) und für weitere 5 Minuten (~ 100 ml) perfundieren. Stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie die Nadel aus dem linken Ventrikel.HINWEIS: Die Perfusion mit PFA bewahrt die Gewebeintegrität gleichmäßig. Es erleichtert auch die Erhaltung des GFP-Signals in den Transplantaten, die sonst aufgrund der Diffusion verloren gehen könnten. 6. Verarbeitung Gewebeentnahme Entfernen Sie den Kopf mit einer Standardschere und machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Haut. Drehen Sie die Haut über die Augen, um den Schädel freizulegen. Beginnen Sie mit dem Schwanzteil an der Spitze des Parietalknochens und machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer Federschere. Bewegen Sie die Schere rostral entlang der mittelsagittalen Naht bis zu einem Punkt zwischen den Augen. Beginnen Sie erneut mit dem Schwanzteil und machen Sie zwei Schnitte parallel und ~4 mm voneinander entfernt in der Sagittalebene.HINWEIS: Achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu schädigen, indem Sie die Schere gegen die innere Oberfläche des Schädels drücken. Verwenden Sie eine Pinzette, um vorsichtig eine Seite des Parietalknochens zu neigen und abzubrechen. Machen Sie dasselbe mit der anderen Seite.HINWEIS: Verwenden Sie einen Mikrospatel, um den Knochen von den Hirnhäuten zu befreien. Andernfalls können sie das Gehirn schädigen, während sie den Schädel abbrechen. Wenn Teile des Frontalknochens verbleiben, machen Sie einen kleinen Schnitt, um die Knochenplatte zu kippen und abzubrechen. Um das Gehirn freizusetzen, schieben Sie den Mikrospatel vorsichtig unter das Gehirn (Riechkolben) und neigen Sie ihn sanft nach oben. Nach dem Sammeln das Gehirn in 4% iger PFA-Lösung für 4-6 h bei 4 ° C aufbewahren. Anschließend auf steriles 1x PBS übertragen. Immunhistochemie Übertragen Sie das Gehirn für mindestens 48 h bei 4 ° C auf eine 30% ige Saccharoselösung, um die Bildung von Kristallen während des Einfrierens zu verhindern. Verwenden Sie ein Gleitmikrotom, um koronale Abschnitte mit einer Dicke von 40 μm zu schneiden. Die Abschnitte werden als frei schwebende Abschnitte (in einer 24-Well-Platte) in einer kryoprotektiven Lösung (Tabelle 1) bei -20 °C bis zur Weiterverarbeitung gesammelt und gelagert. Spülen Sie die Abschnitte mit 450 μL von 1x PBS für jede Vertiefung (3 mal, jeweils 5 min, RT). Blockieren Sie unspezifische Stellen mit 450 μL Blockierlösung für jede Vertiefung (Tabelle 1) für 1 h bei RT. Inkubieren Sie jede Vertiefung mit 450 μL primärer Antikörper bei 4 °C über Nacht. Verdünnen Sie die Antikörper 1:200 in 3% Eselserum; 0,1 % Triton-X-100 in PBS. Um Spendermaterial in der Wirtsumgebung zu identifizieren, verwenden Sie einen Antikörper gegen humanspezifische Kerne (Anti-Human Nuclei Antibody, Klon 235-1). Waschen Sie die Abschnitte mit 450 μL 1x PBS für jede Vertiefung (3 mal, jeweils 5 min, RT). Inkubieren Sie jede Vertiefung mit 450 μL entsprechender fluoreszierender sekundärer Antikörper für 2-3 h (RT). Verdünnen Sie die Antikörper in 3% Eselserum; 0,1% Triton-X-100 in 1x PBS. Waschen Sie die Abschnitte mit 450 μL 1x PBS für jede Vertiefung (3 mal, jeweils 5 min, RT). Die Kerne werden mit 450 μL 0,1 μg/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) gefärbt.