Procesamiento de muestras de proteómica de escopeta automatizado por un robot de laboratorio de código abierto

La proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas es una herramienta poderosa para medir la abundancia de muchas proteínas en muestras biológicas simultáneamente. Los experimentos de proteómica con análisis bioinformático se emplean rutinariamente para identificar biomarcadores y descubrir complejos biológicos asociados y vías que sustentan los mecanismos patológicos. Con su alta especificidad de analito y su potencial precisión cuantitativa, la proteómica de escopeta también tiene un excelente potencial para ser adoptada por instalaciones de investigación y laboratorios de diagnóstico para el análisis de muestras clínicas sin la necesidad de depender de ^{anticuerpos1,2}.

Para preparar muestras de proteínas para el análisis proteómico de escopeta, las proteínas extraídas de muestras biológicas (por ejemplo, células y tejidos) generalmente primero deben procesarse utilizando protocolos largos, incluida la medición de la concentración de proteínas de la muestra, la reducción y alquilación de proteínas, y la digestión enzimática en péptidos. Además, las proteínas extraídas en tampones de lisis comunes que contienen detergentes a menudo requieren pasos adicionales de intercambio de tampón o eliminación de detergente antes del análisis porque el detergente puede interferir con la digestión de tripsina y degradar significativamente el rendimiento del análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) aguas ^abajo3. Los péptidos generalmente se desalan, se secan y reconstituyen en disolventes compatibles con LC-MS / MS después de la digestión enzimática. Estos procedimientos de bioquímica de proteínas pueden ser laboriosos y llevar mucho tiempo. Por lo tanto, continúan limitando el rendimiento de los flujos de trabajo de proteómica y contribuyen a la variabilidad de los datos ^{adquiridos4,5}. Los errores y sesgos humanos han sido reconocidos como factores cruciales que afectan la varianza y reproducibilidad de los ^datos6,7. Para minimizar los errores humanos en los flujos de trabajo de preparación de muestras de espectrometría de masas, se han utilizado sistemas robóticos de pipeteo automatizados para mejorar el rendimiento y la reproducibilidad de la identificación y cuantificación de proteínas a partir de la proteómica de escopeta y el análisis de espectrometría de masas dirigida, donde tales avances han sido aclamados como instrumentales para continuar el impulso de la adopción generalizada de tecnologías proteómicas en entornos clínicos y de investigación ^críticos8, 9,10,11,12,13. Sin embargo, la mayoría de los protocolos existentes utilizan plataformas robóticas de manejo de líquidos que requieren una inversión y capacitación sustanciales, lo que limita su utilidad en muchos laboratorios en el entorno académico o con un presupuesto limitado.

Este artículo describe un protocolo que utiliza un sistema robótico de manejo de líquidos de bajo costo y código abierto, el OT-2, para semiautomatizar un flujo de trabajo típico de preparación de muestras de proteómica de escopeta. El OT-2 tiene un costo más bajo que muchos otros sistemas robóticos de manejo de líquidos, y en el momento de escribir este artículo, cuesta aproximadamente $ 5,000 dólares estadounidenses. Al tener en cuenta los precios de diferentes módulos y artículos de laboratorio, el costo total para establecer experimentos en este protocolo en el momento de escribir este artículo es de alrededor de $ 10,000, lo que lo hace más asequible para un conjunto considerablemente más amplio de laboratorios sobre opciones más caras. El OT-2 es compatible con la programación de código abierto a través de scripts Python y ofrece grandes flexibilidades en el diseño de protocolos de bricolaje definidos por el usuario. Utilizando tres scripts desarrollados internamente, los protocolos a continuación cubren la ejecución de un flujo de trabajo típico de preparación de muestras de proteómica de escopeta en la estación OT-2 con un estándar de proteína arquetípico (albúmina sérica bovina; BSA) y una muestra de proteína compleja de un lisado normal del corazón humano (Figura 1). Los procedimientos para procesar (1) una muestra de BSA y (2) una muestra de lisado cardíaco complejo se detallan en las secciones 1, 2, 5, 6 y 3, 4, 5, 6 del Protocolo, respectivamente. Las perlas magnéticas modificadas con carboxilato Sera-Mag se utilizan en la preparación de muestras mejoradas en fase sólida (SP3) de una sola olla para eliminar detergentes y sales en las muestras de proteínas y péptidos. Los resúmenes trípticos de la albúmina sérica bovina y las proteínas del corazón humano se limpian aún más con perlas SP3 y se envían para el análisis LC-MS / MS. Los espectros de masas se analizan utilizando el software MaxQuant para la identificación de péptidos y proteínas. Los resultados representativos realizados por nosotros muestran que el protocolo logra excelentes coeficientes técnicos de variación (CV) al tiempo que ahorra tiempo de banco y no es inferior al digesto manual.