Обработка образцов протеомики дробовика автоматизирована лабораторным роботом с открытым исходным кодом

Протеомика дробовика на основе масс-спектрометрии является мощным инструментом для измерения обилия многих белков в биологических образцах одновременно. Эксперименты по протеомике с анализом биоинформатики обычно используются для выявления биомаркеров и обнаружения связанных биологических комплексов и путей, лежащих в основе патологических механизмов. Обладая высокой аналитной специфичностью и потенциальной количественной точностью, протеомика дробовика также имеет отличный потенциал для принятия исследовательскими учреждениями и диагностическими лабораториями для анализа клинических образцов без необходимости полагаться на ^{антитела1,2}.

Чтобы подготовить образцы белка для анализа протеомики дробовика, белки, извлеченные из биологических образцов (например, клеток и тканей), обычно сначала должны быть обработаны с использованием длительных протоколов, включая измерение концентрации белка в образце, снижение белка и алкилирование, а также ферментативное переваривание в пептиды. Кроме того, белки, извлеченные в общих буферах лизиса, содержащих моющие средства, часто требуют дополнительных этапов буферного обмена или удаления моющего средства перед анализом, поскольку моющее средство может мешать пищеварению трипсина и значительно ухудшать производительность последующего анализа жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS)³. Пептиды обычно дополнительно обессолены, высушены и восстановлены в LC-MS/MS совместимых растворителях после ферментативного сбраживания. Эти процедуры биохимии белка могут быть трудоемкими и трудоемкими. Таким образом, они продолжают ограничивать пропускную способность рабочих процессов протеомики и способствуют изменчивости получаемых ^{данных4,5}. Человеческие ошибки и предубеждения были признаны в качестве решающих факторов, влияющих на дисперсию и воспроизводимость ^{данных6,7}. Чтобы свести к минимуму человеческие ошибки в рабочих процессах масс-спектрометрической пробоподготовки, автоматизированные роботизированные системы пипетирования были использованы для повышения пропускной способности и воспроизводимости идентификации и количественной оценки белка с помощью протеомики дробовика и целевого масс-спектрометрического анализа, где такие достижения были высоко оценены как инструменты для продолжения стремления к широкому внедрению технологий протеомики в критических исследованиях и клинических ^{условиях8,} 9,10,11,12,13. Тем не менее, большинство существующих протоколов используют роботизированные платформы обработки жидкостей, которые требуют значительных инвестиций и обучения, ограничивая их полезность во многих лабораториях в академической среде или иным образом с ограниченным бюджетом.

В этой статье описывается протокол, который использует недорогую роботизированную систему обработки жидкостей с открытым исходным кодом, OT-2, для полуавтоматизации типичного рабочего процесса пробоподготовки протеомики дробовика. OT-2 имеет более низкую стоимость, чем многие другие роботизированные системы обработки жидкостей, и на момент написания статьи стоил примерно 5000 долларов США. Если учесть цены на различные модули и лабораторное полотно, общая стоимость проведения экспериментов по этому протоколу на момент написания статьи составляет около 10 000 долларов США, что делает его более доступным для значительно более широкого круга лабораторий по сравнению с более дорогими вариантами. OT-2 совместим с программированием с открытым исходным кодом с помощью скриптов Python и предлагает большую гибкость в разработке пользовательского протокола DIY. Используя три собственных сценария, приведенные ниже протоколы охватывают выполнение типичного рабочего процесса пробоподготовки протеомики дробовика на станции OT-2 с архетипичным стандартом белка (бычий сывороточный альбумин; BSA) и сложный образец белка нормального лизата сердца человека (рисунок 1). Процедуры обработки (1) образца BSA и (2) сложного образца лизата сердца подробно описаны в разделах Протокола 1, 2, 5, 6 и 3, 4, 5, 6 соответственно. Модифицированные карбоксилатом магнитные шарики Sera-Mag используются в однофазной твердофазной пробоподготовке (SP3) для удаления моющих средств и солей из белковых и пептидных образцов. Триптические дигесты из бычьего сывороточного альбумина и сердечных белков человека дополнительно очищаются шариками SP3 и представляются для анализа LC-MS / MS. Затем масс-спектры анализируются с использованием программного обеспечения MaxQuant для идентификации пептидов и белков. Репрезентативные результаты, выполненные нами, показывают, что протокол достигает отличных технических коэффициентов вариации (CV) при экономии времени стенда и не уступает ручному дайджесту.