Processamento de amostras de proteômica de espingarda automatizada por um robô de laboratório de código aberto

A proteômica da espingarda baseada em espectrometria em massa é uma ferramenta poderosa para medir a abundância de muitas proteínas em amostras biológicas simultaneamente. Experimentos proteômicos com análise bioinformática são rotineiramente empregados para identificar biomarcadores e descobrir complexos biológicos associados e caminhos que sustentam mecanismos patológicos. Com sua alta especificidade de analito e potencial precisão quantitativa, a proteômica da espingarda também tem excelente potencial para ser adotada por instalações de pesquisa e laboratórios de diagnóstico para análise de amostras clínicas sem a necessidade de contar com ^{anticorpos1,2}.

Para preparar amostras proteicas para análise de proteômica de espingarda, proteínas extraídas de amostras biológicas (por exemplo, células e tecidos) normalmente precisam ser processadas usando protocolos longos, incluindo medir a concentração de proteínas amostrais, redução de proteínas e alquilação, e digestão enzimática em peptídeos. Além disso, proteínas extraídas em tampões de lise comuns contendo detergentes muitas vezes requerem etapas adicionais de troca de buffer ou remoção de detergente antes da análise, pois o detergente pode interferir na digestão de trippsina e degradar significativamente o desempenho ^{da análise de} espectrometria de massa líquida a jusante (LC-MS/MS). Os peptídeos são tipicamente mais dessacados, secos e reconstituídos em solventes compatíveis com LC-MS/MS após a digestão enzimática. Esses procedimentos de bioquímica proteica podem ser intensivos em mão-de-obra e demorados. Assim, continuam a limitar o throughput de fluxos de trabalho proteômicos e contribuem para a variabilidade dos dados ^{adquiridos4,5}. Erros e vieses humanos têm sido reconhecidos como fatores cruciais que afetam a variância e a reprodutibilidade ^{dos dados6,7}. Para minimizar os erros humanos nos fluxos de trabalho de preparação de amostras de espectrometria de massa, sistemas robóticos automatizados de pipetação têm sido utilizados para melhorar o throughput e a reprodutibilidade da identificação e quantificação de proteínas a partir de proteômica de espingarda e análise de espectrometria de massa direcionada, onde tais avanços têm sido saudados como instrumentais para a continuação da adoção generalizada de tecnologias de proteômica em pesquisas críticas e configurações ^clínicas8, 9,10,11,12,13. No entanto, a maioria dos protocolos existentes utiliza plataformas robóticas de manuseio de líquidos que requerem investimento e treinamento substanciais, limitando sua utilidade em muitos laboratórios no ambiente acadêmico ou de outra forma com um orçamento limitado.

Este artigo descreve um protocolo que utiliza um sistema de manuseio líquido robótico de baixo custo e de código aberto, o OT-2, para semi-automatizar um típico fluxo de trabalho de preparação de amostras de proteômica de espingarda. O OT-2 tem um custo menor do que muitos outros sistemas robóticos de manuseio líquido, e no momento da escrita, custa aproximadamente US $ 5.000 dólares americanos. Ao considerar os preços de diferentes módulos e labware, o custo total para configurar experimentos neste protocolo no momento da escrita é de cerca de US $ 10.000, o que o torna mais acessível a um conjunto consideravelmente mais amplo de laboratórios sobre opções mais caras. O OT-2 é compatível com a programação de código aberto através de scripts Python e oferece grandes flexibilidades no design do protocolo DIY definido pelo usuário. Usando três scripts desenvolvidos internamente, os protocolos abaixo cobrem a execução de um fluxo de trabalho típico de preparação de amostras de proteômica de espingarda na estação OT-2 com um padrão de proteína arquetípico (albumina de soro bovino; BSA) e uma amostra de proteína complexa de um liseto cardíaco humano normal (Figura 1). Os procedimentos de processamento (1) uma amostra de BSA e (2) uma amostra complexa de liseto cardíaco estão detalhados nas seções de Protocolo 1, 2, 5, 6 e 3, 4, 5, 6, respectivamente. As contas magnéticas modificadas por carboxilato sera-mag são utilizadas na preparação de amostras aprimoradas em fase sólida (SP3) para remover detergentes e sais nas amostras de proteína e peptídeo. Digestões trippticas da albumina de soro bovino e proteínas cardíacas humanas são ainda mais limpas por contas SP3 e submetidas à análise LC-MS/MS. Os espectros de massa são então analisados usando o software MaxQuant para identificação de peptídeos e proteínas. Os resultados representativos realizados por nós mostram que o protocolo alcança excelentes coeficientes técnicos de variação (CV) enquanto economiza tempo de bancada e não é inferior ao digestor manual.