オープンソースのラボロボットによるショットガンプロテオミクスサンプル処理

質量分析ベースの散弾銃プロテオミクスは、生物学的サンプル中の多くのタンパク質の存在量を同時に測定する強力なツールです。バイオインフォマティクス解析を用いたプロテオミクス実験は、バイオマーカーを同定し、病理学的メカニズムを支える関連する生物学的複合体および経路を発見するために日常的に使用されています。高い分析物特異性と潜在的な定量精度により、ショットガンプロテオミクスは、抗体に頼ることなく臨床サンプル分析のための研究施設や診断ラボで採用される優れた可能性を秘^{めています1,2}。

ショットガンプロテオミクス分析用のタンパク質サンプルを調製するには、通常、生体サンプルから抽出したタンパク質(細胞や組織)は、サンプルタンパク質濃度の測定、タンパク質還元、アルキル化、ペプチドへの酵素消化など、長いプロトコルを使用して処理する必要があります。さらに、洗剤を含む一般的な溶解バッファーで抽出されたタンパク質は、多くの場合、分析の前にバッファー交換または洗剤除去の追加のステップを必要とするため、洗剤はトリプシン消化を妨げ、下流の液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)分析の性能を著しく低下させる可能性があります³.ペプチドは、典型的には、さらに脱塩、乾燥、および酵素消化に続くLC-MS/MS適合溶媒で再構成される。これらのタンパク質の生化学手順は、労働集約的で時間がかかる場合があります。したがって、彼らはプロテオミクスワークフローのスループットを制限し続け、取得したデータ^4,5の変動に貢献^します。人為的ミスとバイアスは、データの分散と再現性に影響を与える重要な要因として認識されてきました ^6,7.質量分析サンプル調製ワークフローにおける人為的ミスを最小限に抑えるために、自動ピペットロボットシステムは、ショットガンプロテオミクスおよび標的質量分析によるタンパク質同定と定量のスループットと再現性を向上させるために利用され、そのような進歩は重要な研究および臨床現場でのプロテオミクス技術の普及を続けるためのインストゥルメンタルとして賞賛されている⁸ 9,10,11,12,13.しかし、ほとんどの既存のプロトコルは、多額の投資とトレーニングを必要とするロボット液体処理プラットフォームを利用しており、学術環境の多くの研究室での有用性を制限したり、予算が限られているりします。

この記事では、低コストのオープンソースのロボット液体処理システムOT-2を利用して、典型的なショットガンプロテオミクスサンプル調製ワークフローを半自動化するプロトコルについて説明します。OT-2は他の多くのロボット液体ハンドリングシステムよりも低コストで、執筆時点では約5,000米ドルの費用がかかります。異なるモジュールやラボウェアの価格を考慮すると、執筆時点でこのプロトコルで実験を設定するための総コストは約$ 10,000であり、より高価なオプションよりもかなり広範なラボセットに手頃な価格になります。OT-2はPythonスクリプトを通したオープンソースプログラミングと互換性があり、ユーザー定義のDIYプロトコル設計に大きな柔軟性を提供します。3つの社内開発スクリプトを使用して、以下のプロトコルは、典型的なショットガンプロテオミクスサンプル調製ワークフローを、典型的なタンパク質標準(ウシ血清アルブミン)でOT-2ステーションで実行することをカバーしています。BSA)と正常なヒト心臓のタンパク質サンプルをライセート(図1)とした。(1)BSAサンプルおよび(2)複雑な心臓ライセートサンプルを処理する手順は、それぞれプロトコルセクション1、2、5、6および4、5、6で詳述されている。Sera-Magカルボキシレート変性磁気ビーズは、タンパク質およびペプチドサンプル中の洗剤および塩を除去するために、単一ポット固相強化サンプル調製(SP3)で利用されます。ウシ血清アルブミンおよびヒト心臓タンパク質からのトリプティック消化は、SP3ビーズによってさらに洗浄され、LC-MS/MS分析のために提出される。質量スペクトルは、ペプチドおよびタンパク質同定のためのMaxQuantソフトウェアを使用して分析されます。我々が行う代表的な結果は、プロトコルがベンチ時間を節約しながら、変動の優れた技術的係数(CV)を達成し、手の消化に劣り、示しています。