Shotgun Proteomics Probenverarbeitung automatisiert durch einen Open-Source-Laborroboter

Die auf Massenspektrometrie basierende Shotgun-Proteomik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Häufigkeit vieler Proteine in biologischen Proben gleichzeitig zu messen. Proteomik-Experimente mit bioinformatischer Analyse werden routinemäßig eingesetzt, um Biomarker zu identifizieren und assoziierte biologische Komplexe und Signalwege zu entdecken, die pathologischen Mechanismen zugrunde liegen. Mit ihrer hohen Analytspezifität und potenziellen quantitativen Genauigkeit hat die Shotgun-Proteomik auch ein hervorragendes Potenzial, von Forschungseinrichtungen und diagnostischen Labors für die klinische Probenanalyse übernommen zu werden, ohne sich auf Antikörper verlassen zu ^müssen1,2.

Um Proteinproben für die Shotgun-Proteomik-Analyse vorzubereiten, müssen Proteine, die aus biologischen Proben (z. B. Zellen und Geweben) extrahiert werden, typischerweise zuerst unter Verwendung langwieriger Protokolle verarbeitet werden, einschließlich der Messung der Probenproteinkonzentration, der Proteinreduktion und -alkylierung sowie des enzymatischen Aufschlusses in Peptide. Darüber hinaus erfordern Proteine, die in herkömmlichen Lysepuffern extrahiert werden, die Detergenzien enthalten, vor der Analyse häufig zusätzliche Schritte des Pufferaustauschs oder der Reinigungsmittelentfernung, da Detergenzien die Trypsinaufschluss stören und die Leistung der nachgeschalteten Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) -Analyse erheblich beeinträchtigen ^können3. Peptide werden typischerweise nach enzymatischem Aufschluss weiter entsalzt, getrocknet und in LC-MS/MS-kompatiblen Lösungsmitteln rekonstituiert. Diese proteinbiochemischen Verfahren können arbeitsintensiv und zeitaufwendig sein. Somit begrenzen sie weiterhin den Durchsatz von Proteomik-Workflows und tragen zur Variabilität der erfassten Daten ^bei4,5. Menschliche Fehler und Verzerrungen wurden als entscheidende Faktoren erkannt, die die Datenvarianz und Reproduzierbarkeit ^{beeinflussen6,7}. Um menschliche Fehler bei der Massenspektrometrie-Probenvorbereitung zu minimieren, wurden automatisierte Pipettierrobotersysteme eingesetzt, um den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit der Proteinidentifizierung und -quantifizierung aus der Schrotflintenproteomik und der gezielten Massenspektrometrieanalyse zu verbessern, wo solche Fortschritte als entscheidend für die Fortsetzung des Vorstoßes für eine weit verbreitete Einführung von Proteomik-Technologien in kritischen Forschungs- und klinischen Umgebungen gefeiert ^wurden8. 9,10,11,12,13. Die meisten bestehenden Protokolle verwenden jedoch robotergestützte Liquid-Handling-Plattformen, die erhebliche Investitionen und Schulungen erfordern, was ihren Nutzen in vielen Labors im akademischen Umfeld oder anderweitig mit einem begrenzten Budget einschränkt.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, das ein kostengünstiges Open-Source-Roboter-Liquid-Handling-System, das OT-2, verwendet, um einen typischen Shotgun-Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflow zu halbautomatisieren. Das OT-2 hat niedrigere Kosten als viele andere Roboter-Liquid-Handling-Systeme und kostet zum Zeitpunkt des Schreibens etwa 5.000 US-Dollar. Wenn man die Preise verschiedener Module und Laborgeräte berücksichtigt, betragen die Gesamtkosten für die Einrichtung von Experimenten in diesem Protokoll zum Zeitpunkt des Schreibens etwa 10.000 US-Dollar, was es für eine wesentlich breitere Gruppe von Labors erschwinglicher macht als teurere Optionen. Der OT-2 ist kompatibel mit Open-Source-Programmierung durch Python-Skripte und bietet große Flexibilitäten im benutzerdefinierten DIY-Protokolldesign. Unter Verwendung von drei intern entwickelten Skripten decken die folgenden Protokolle die Ausführung eines typischen Shotgun-Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflows auf der OT-2-Station mit einem archetypischen Proteinstandard (Rinderserumalbumin; BSA) und eine komplexe Proteinprobe eines normalen menschlichen Herzlysat (Abbildung 1). Die Verfahren zur Verarbeitung (1) einer BSA-Probe und (2) einer komplexen Herzlysatprobe sind in den Protokollabschnitten 1, 2, 5, 6 und 3, 4, 5, 6 beschrieben. Sera-Mag-Carboxylat-modifizierte Magnetperlen werden in der Eintopf-Festphasen-verstärkten Probenvorbereitung (SP3) verwendet, um Reinigungsmittel und Salze in den Protein- und Peptidproben zu entfernen. Tryptische Digests aus Rinderserumalbumin und menschlichen Herzproteinen werden durch SP3-Kügelchen weiter gereinigt und zur LC-MS/MS-Analyse eingereicht. Massenspektren werden dann mit der MaxQuant-Software zur Peptid- und Proteinidentifizierung analysiert. Repräsentative Ergebnisse, die von uns durchgeführt wurden, zeigen, dass das Protokoll hervorragende technische Variationskoeffizienten (CV) erreicht, gleichzeitig Bankzeit spart und der Handverdauung nicht unterlegen ist.