Traitement des échantillons protéomiques Shotgun automatisé par un robot de laboratoire open source

La protéomique au fusil de chasse basée sur la spectrométrie de masse est un outil puissant pour mesurer simultanément l’abondance de nombreuses protéines dans des échantillons biologiques. Les expériences protéomiques avec l’analyse bioinformatique sont couramment utilisées pour identifier les biomarqueurs et découvrir les complexes biologiques associés et les voies qui sous-tendent les mécanismes pathologiques. Avec sa grande spécificité d’analyte et sa précision quantitative potentielle, la protéomique des fusils de chasse a également un excellent potentiel pour être adoptée par les installations de recherche et les laboratoires de diagnostic pour l’analyse d’échantillons cliniques sans avoir besoin de s’appuyer sur des ^anticorps1,2.

Pour préparer des échantillons de protéines pour l’analyse protéomique au fusil de chasse, les protéines extraites d’échantillons biologiques (par exemple, les cellules et les tissus) doivent généralement d’abord être traitées à l’aide de longs protocoles, y compris la mesure de la concentration en protéines de l’échantillon, la réduction des protéines et l’alkylation, et la digestion enzymatique en peptides. De plus, les protéines extraites dans des tampons de lyse courants contenant des détergents nécessitent souvent des étapes supplémentaires d’échange de tampon ou d’élimination du détergent avant l’analyse, car le détergent peut interférer avec la digestion de la trypsine et dégrader considérablement les performances de l’analyse en aval par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS)³. Les peptides sont généralement dessalés, séchés et reconstitués dans des solvants compatibles LC-MS/MS après digestion enzymatique. Ces procédures de biochimie des protéines peuvent être laborieuses et prendre beaucoup de temps. Ainsi, ils continuent de limiter le débit des flux de travail protéomiques et contribuent à la variabilité des données ^acquises4,5. Les erreurs et les biais humains ont été reconnus comme des facteurs cruciaux affectant la variance et la reproductibilité des ^données6,7. Pour minimiser les erreurs humaines dans les flux de travail de préparation des échantillons par spectrométrie de masse, des systèmes robotiques de pipetage automatisés ont été utilisés pour améliorer le débit et la reproductibilité de l’identification et de la quantification des protéines à partir de la protéomique au fusil de chasse et de l’analyse ciblée par spectrométrie de masse, où de telles avancées ont été saluées comme essentielles pour poursuivre la poussée en faveur de l’adoption généralisée des technologies protéomiques dans les domaines critiques de la recherche et des milieux ^cliniques8, 9,10,11,12,13. Cependant, la plupart des protocoles existants utilisent des plates-formes robotiques de manipulation de liquides qui nécessitent des investissements et une formation substantiels, ce qui limite leur utilité dans de nombreux laboratoires dans l’environnement universitaire ou autrement avec un budget limité.

Cet article décrit un protocole qui utilise un système de manipulation robotique de liquides à faible coût et open source, l’OT-2, pour semi-automatiser un flux de travail typique de préparation d’échantillons protéomiques de fusil de chasse. L’OT-2 a un coût inférieur à celui de nombreux autres systèmes robotiques de manipulation de liquides et, au moment de la rédaction de cet article, coûte environ 5 000 dollars américains. Si l’on tient compte des prix des différents modules et logiciels de laboratoire, le coût total de la mise en place d’expériences dans ce protocole au moment de la rédaction est d’environ 10 000 $, ce qui le rend plus abordable pour un ensemble considérablement plus large de laboratoires par rapport à des options plus coûteuses. L’OT-2 est compatible avec la programmation open-source via des scripts Python et offre une grande flexibilité dans la conception de protocoles DIY définis par l’utilisateur. À l’aide de trois scripts développés en interne, les protocoles ci-dessous couvrent l’exécution d’un flux de travail typique de préparation d’échantillons protéomiques de fusil de chasse sur la station OT-2 avec un étalon protéique archétypique (albumine sérique bovine; BSA) et un échantillon de protéine complexe d’un lysat cardiaque humain normal (Figure 1). Les procédures de traitement (1) d’un échantillon de BSA et (2) d’un échantillon de lysat cardiaque complexe sont détaillées dans les sections 1, 2, 5, 6 et 3, 4, 5, 6 du Protocole, respectivement. Les billes magnétiques modifiées par le carboxylate sera-Mag sont utilisées dans la préparation d’échantillons améliorés en phase solide (SP3) pour éliminer les détergents et les sels dans les échantillons de protéines et de peptides. Les digestions tryptiques de l’albumine sérique bovine et des protéines cardiaques humaines sont ensuite nettoyées par des billes SP3 et soumises à l’analyse LC-MS/MS. Les spectres de masse sont ensuite analysés à l’aide du logiciel MaxQuant pour l’identification des peptides et des protéines. Les résultats représentatifs que nous avons réalisés montrent que le protocole atteint d’excellents coefficients techniques de variation (CV) tout en économisant du temps de banc et n’est pas inférieur à la digestion à la main.