معالجة عينات البروتينات البندقية آلية بواسطة روبوت مختبر مفتوح المصدر
Summary
يتم توفير بروتوكول مفصل وثلاثة نصوص بايثون لتشغيل نظام مناولة سائل روبوتي مفتوح المصدر لإجراء إعداد عينة بروتين شبه آلية لتجارب قياس الطيف الكتلي ، والتي تغطي إزالة المنظفات ، وهضم البروتين ، وخطوات تحلية الببتيد.
Abstract
تتطلب تجارب بروتينات البندقية القائمة على قياس الطيف الكتلي خطوات متعددة لإعداد العينات، بما في ذلك هضم البروتين الأنزيمي وتنظيفه، والتي يمكن أن تستغرق ساعات كبيرة من العمل على مقاعد البدلاء وتمثل مصدرا للتباين من دفعة إلى أخرى. يمكن أن تؤدي أتمتة المختبرات باستخدام روبوتات السحب إلى تقليل العمل اليدوي وزيادة الإنتاجية وزيادة قابلية إعادة إنتاج البحوث. ومع ذلك ، فإن الأسعار الأولية الباهظة لمحطات الأتمتة القياسية تجعلها غير ميسورة التكلفة للعديد من المختبرات الأكاديمية. توضح هذه المقالة سير عمل إعداد عينات البروتينات باستخدام نظام أتمتة مفتوح المصدر ميسور التكلفة (The Opentrons OT-2)، بما في ذلك إرشادات لإعداد خطوات تقليل البروتين والألكلة والهضم والتنظيف شبه الآلية؛ بالإضافة إلى مرافقة نصوص بايثون مفتوحة المصدر لبرمجة نظام OT-2 من خلال واجهة برمجة التطبيقات الخاصة به.
Introduction
تعد بروتينات البندقية القائمة على قياس الطيف الكتلي أداة قوية لقياس وفرة العديد من البروتينات في العينات البيولوجية في وقت واحد. يتم استخدام تجارب البروتينات مع تحليل المعلوماتية الحيوية بشكل روتيني لتحديد المؤشرات الحيوية واكتشاف المجمعات والمسارات البيولوجية المرتبطة بها التي تدعم الآليات المرضية. بفضل خصوصيتها التحليلية العالية ودقتها الكمية المحتملة ، تتمتع بروتينات البندقية أيضا بإمكانات ممتازة لاعتمادها من قبل مرافق البحوث ومختبرات التشخيص لتحليل العينات السريرية دون الحاجة إلى الاعتماد على الأجسام المضادة1,2.
لإعداد عينات البروتين لتحليل البروتينات البندقية ، عادة ما تحتاج البروتينات المستخرجة من العينات البيولوجية (مثل الخلايا والأنسجة) أولا إلى معالجتها باستخدام بروتوكولات طويلة ، بما في ذلك قياس تركيز بروتين العينة ، وتقليل البروتين ، والألكلة ، والهضم الأنزيمي إلى ببتيدات. وعلاوة على ذلك، فإن البروتينات المستخرجة في مخازن التحلل الشائعة التي تحتوي على منظفات غالبا ما تتطلب خطوات إضافية لتبادل المخزن المؤقت أو إزالة المنظفات قبل التحليل لأن المنظفات يمكن أن تتداخل مع هضم التربسين وتؤدي إلى تدهور كبير في أداء تحليل مطياف الكتلة الترادفية للكروماتوغرافيا السائلة في اتجاه المصب (LC-MS/MS) 3. عادة ما يتم تحلية الببتيدات وتجفيفها وإعادة تشكيلها في المذيبات المتوافقة مع LC-MS / MS بعد الهضم الأنزيمي. يمكن أن تكون إجراءات الكيمياء الحيوية للبروتين هذه كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا. وبالتالي ، فإنها تستمر في الحد من إنتاجية سير عمل البروتينات والمساهمة في تباين البيانات المكتسبة4,5. تم الاعتراف بالأخطاء والتحيزات البشرية كعوامل حاسمة تؤثر على تباين البيانات وقابليتها للتكرار6،7. وللتقليل إلى أدنى حد من الأخطاء البشرية في سير عمل إعداد عينات قياس الطيف الكتلي، استخدمت النظم الروبوتية للسحب الآلي لتحسين إنتاجية وقابلية تكرار تحديد البروتين وقياسه كميا من بروتينات البندقية وتحليل الطيف الكتلي المستهدف، حيث تم الإشادة بهذه التطورات باعتبارها مفيدة لمواصلة الدفع نحو اعتماد تكنولوجيات البروتيوميات على نطاق واسع في البحوث الحرجة والإعدادات السريرية8، 9,10,11,12,13. ومع ذلك ، تستخدم معظم البروتوكولات الحالية منصات مناولة السوائل الروبوتية التي تتطلب استثمارا وتدريبا كبيرين ، مما يحد من فائدتها في العديد من المختبرات في البيئة الأكاديمية أو بميزانية محدودة.
توضح هذه المقالة بروتوكولا يستخدم نظام معالجة سائل روبوتي منخفض التكلفة ومفتوح المصدر، وهو OT-2، لأتمتة سير عمل نموذجي لإعداد عينات البروتينات البندقية. تتميز OT-2 بتكلفة أقل من العديد من أنظمة مناولة السوائل الروبوتية الأخرى ، وفي وقت كتابة هذا التقرير ، تكلف حوالي 5000 دولار أمريكي. عند الأخذ في الاعتبار أسعار الوحدات والبرامج المخبرية المختلفة ، تبلغ التكلفة الإجمالية لإعداد التجارب في هذا البروتوكول في وقت كتابة هذا التقرير حوالي 10000 دولار ، مما يجعلها أكثر بأسعار معقولة لمجموعة أوسع بكثير من المختبرات على خيارات أكثر تكلفة. يتوافق OT-2 مع البرمجة مفتوحة المصدر من خلال برامج Python النصية ويوفر مرونة كبيرة في تصميم بروتوكول DIY المحدد من قبل المستخدم. باستخدام ثلاثة نصوص مطورة داخليا ، تغطي البروتوكولات أدناه تنفيذ سير عمل نموذجي لإعداد عينات البروتينات البندقية على محطة OT-2 مع معيار بروتين نموذجي (ألبومين مصل البقر; BSA) وعينة بروتين معقدة من غسول قلب الإنسان الطبيعي (الشكل 1). وترد تفاصيل إجراءات معالجة (1) عينة BSA و (2) عينة معقدة من ليزات القلب في أقسام البروتوكول 1 و 2 و 5 و 6 و 3 و 4 و 5 و 6 على التوالي. تستخدم الخرز المغناطيسي المعدل بكربوكسيلات Sera-Mag في إعداد العينات المعززة بالطور الصلب أحادي الوعاء (SP3) لإزالة المنظفات والأملاح في عينات البروتين والببتيد. يتم تنظيف الهضم التربتي من ألبومين مصل البقر وبروتينات القلب البشري بواسطة حبات SP3 وتقديمها لتحليل LC-MS / MS. ثم يتم تحليل أطياف الكتلة باستخدام برنامج MaxQuant لتحديد الببتيد والبروتين. تظهر النتائج التمثيلية التي أجريناها أن البروتوكول يحقق معاملات تقنية ممتازة للاختلاف (CV) مع توفير وقت مقاعد البدلاء وهو غير أدنى من الهضم اليدوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول
للحصول على أفضل أداء، يجب استخدام البرامج المخبرية والوحدات والمواد الاستهلاكية المتوافقة مع OT-2 التي تم التحقق منها من Opentrons. يمكن إنشاء برامج مختبرية مخصصة باتباع تعليمات Opentrons في Reference14. تأكد من معايرة سطح OT-2 والماصات وأدوات ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال جوائز المعاهد الوطنية للصحة F32-HL149191 إلى YH. R00-HL144829 إلى EL ؛ R21-HL150456، R00-HL127302، R01-HL141278 إلى MPL. يتم إنشاء الشكل 1 ، الشكل 2 ، الشكل 3 بمساعدة أداة توضيح علمية على شبكة الإنترنت ، BioRender.com.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
References
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- . Web URL Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021)
- . Web URL Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021)
- . Web URL Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021)
- . Web URL Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021)
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
