Bant Yöntemi ve El Tipi Mikrodizileyici Kullanılarak Doku Mikrodizisinin Manuel Yapımı

TMA yapım sürecinin en kritik bileşenlerinden biri, TMA çekirdeklerinin elde edileceği FFPE donör bloklarının patoloji incelemesidir⁴. İnceleme sırasında, kurul sertifikalı bir patolog, her bir donör bloğundan temsili bir H & E lekeli doku bölümünü inceler. H&E’nin taze kesilmiş bir doku kesiti kullanılarak üretilmesi zorunludur, böylece karşılık gelen donör bloğunun en iyi temsili olur. FFPE dokularının, doku profili blok derinliği ve geniş kesitleme ile önemli ölçüde değişebilen 3 boyutlu yapılar olduğu göz önüne alındığında, eski H&E’lerin kullanılması önerilmez; Bu, H&E’nin üretilmesinden bu yana gerçekleşmiş olabilir ve potansiyel olarak FFPE bloğunun temsilini yanlış hale getirebilir. Gözden geçirme süreci, uygun vakaların seçimi ve çekirdeklerin elde edilmesi gereken doku alanlarının belirlenmesi ve ayrıca çekirdekleri toplarken kaçınılması gereken alanların belirlenmesi için gereklidir. Patolojik incelemenin yokluğunda, uygun olmayan dokuları dahil etme olasılığı önemli ölçüde artar. Bu tür dokuların dahil edilmesi, inşa edilen TMA’yı etkisiz ve amaçlanan amacı için uygun hale getirme potansiyeline sahiptir. Daha da önemlisi, bu tür etkisiz TMA’ları bilmeden kullanmak, yanlış ve yanıltıcı verilerle sonuçlanmak için muazzam bir potansiyele sahiptir. Bu, FFPE dokularının profilinin ve dolayısıyla türev çekirdeklerinin artan derinlikle önemli ölçüde değişebileceği bilgisi ile birleştiğinde, inşa edilmiş bir TMA bloğunun ömrü boyunca devam eden patoloji incelemesinin önemini vurgulamaktadır. İdeal olarak, çekirdeklerin doku profillerindeki değişikliklerin yakalanmasını ve kaydedilmesini sağlamak için H&E’ler her 15^{. veya} 20. bölüm kullanılarak oluşturulmalıdır^. En azından, bu potansiyel değişiklikleri izlemek için bir projenin başında ve sonunda H&Es oluşturulmalı ve gözden geçirilmelidir. Bu noktalar ve TMA’nın bir araştırma aracı olarak önemi ışığında, patolojik derlemenin TMA yapım sürecine ve TMA bloğunun ömrü boyunca sıkı sıkıya gömülmesi zorunludur.

FFPE blokları, araştırma amacıyla serbest bırakılmadan önce rutin tanısal işlem sırasında genellikle kapsamlı bir şekilde bölümlere ayrılır. Sonuç olarak, donör blok derinliği ve dolayısıyla donör blok çekirdek uzunlukları genellikle 4 mm’lik alıcı yöntemden daha azdır. Burada, temel avantajı ideal olmayan FFPE doku bloklarından gelen çekirdeklerle uyumluluğu olan bant yöntemi yapım protokolünü kullanarak TMA’ların nasıl oluşturulacağını gösterdik. Bant yöntemi büyük bir araştırma değerine sahip olmasına ve TMA bloklarını oluşturmak için ucuz, kullanışlı ve erişilebilir bir yöntem sunmasına rağmen, zorlukları ve sınırlamaları olmadan değildir. Tek bir TMA bloğunda 100-1.000’lerce çekirdeği barındırabilen hem otomatik hem de manuel alıcı yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bant yöntemi⁹ kullanılarak oluşturulan TMA’lar için maksimum 40 çekirdek önerilir. Diğer bir sınırlama ise inşaat kolaylığı ile ilgilidir. Alıcı yönteminde, delikli çekirdekler sadece her bir çekirdeği kendi bireysel kuyusuna yerleştirerek çekirdek stabilitesi sağlayan prekast bir kalıba yerleştirilir, böylece çekirdek göçünü önler ve aynı zamanda oldukça düzenli çekirdek yerleşimini ve ayrımını teşvik eder²². Ayrıca, alıcı yöntemi tamamen manuel, yarı manuel ve tam otomatik olmanın isteğe bağlı rahatlığını sunar. Buna karşılık, manuel bant yöntemi, her bir çekirdeğin bir iğne çekme kullanılarak elle dikkatli ve nazik bir şekilde yerleştirilmesini gerektirir. Bant yönteminde prekast kalıbın bulunmaması, alıcı yöntemle yaşanan son derece düzenli yerleştirme ve ayırmayı engellese de, damalı bir ızgaranın dahil edilmesiyle bu eksikliğin üstesinden gelinir. Damalı ızgaranın, blok kenarı yerleşimini önlemek için metal tepsinin ortasına yapıştırılması önemlidir, bu da çekirdeği yerinde tutan yetersiz parafin varsa çekirdek kaybı riskini artırır. Ayrıca, alıcı yöntemiyle mümkün olan küçük çekirdek ayırmalarının, manuel çekirdek yerleştirme ve iğne seçiminin bitişik çekirdekler arasına sığması ihtiyacı nedeniyle bant yöntemiyle elde edilemeyeceği de belirtilmelidir. Çekirdekler, DSST kaplı ızgaraya temas eden en küçük yüzey alanı veya çekirdeğin ayak izi ile bağımsız dik bir şekilde yerleştirilir. Bu kurulum, alıcı yönteminden önemli ölçüde daha az çekirdek kararlılığı sağlar ve erimiş parafin dökülürken çekirdek devrilmesi ve veya göçü için gelişmiş bir risk verir. Gerçekten de, protokoldeki en kritik adımlardan biri erimiş parafini dökmektir. Parafinin tamamen sıvı olmasını sağlamak için fırından çıkarıldıktan sonra bunun hızlı bir şekilde yapılması ve dökülmenin minimum türbülansla nazikçe yapılması esastır. İlginç bir şekilde, Chen ve ark., alıcı bloğu oluştururken ve donör blok çekirdeklerini yerleştirirken iğneleri yönlendirmek için boş bir parafin bloğunun üzerine yerleştirilen 7 x 11 eşit olarak dağıtılmış 2 mm çaplı deliklere sahip bir şablona benzeyen oldukça yeni bir yardımcı cihaz geliştirdi²³. Alıcı blok yapımına yardımcı olmak için tasarlanmış olmasına rağmen, böyle bir cihaz, yerleştirmeyi yönlendirmek, ayırmayı düzenlemek ve inşaat işlemi sırasında çekirdek stabilitesini artırmak için bant yöntemine kolayca uyarlanabilir.

Çekirdek kararlılığının en önemli efektörlerinden biri, bir bant yöntemi TMA’ya dahil edilen çekirdek sayısıdır. Bunun nedeni, çekirdek sayısı arttıkça, artan çekirdek sayısına uyum sağlamak için çekirdeğin çapının azalması gerektiğidir ve bu da DSST’ye bağlı çekirdek ayak izini azaltır. Bant yöntemi TMA yapımı için minimum 1 mm’lik bir çekirdek çapı önerilir, çünkü daha küçük çaplı çekirdeklerin özellikle dengesiz olduğunu ve çok yumuşak parafin dökülmesiyle bile devrilmeye eğilimli olduğunu bulduk. 16 G iğne (1.1 mm çekirdek çapı) ve 4 mm çapında bir zımba kullanan iki farklı şirket içi yöntemi araştıran yeni bir çalışma, 1.1 mm (% 26.5) ile önemli doku kayıpları yaşadı, ancak 4 mm çekirdekler²⁴ ile değil. Bu, küçük çekirdeklerin sadece inşaat sırasında değil, çalışmak için sorunlu olabileceğini gösteriyor gibi görünüyor. Dahası, daha küçük çaplar orijinal donör bloğunu ve daha büyük çekirdekleri temsil etmeyebilir, bu da patolojik yorumlamayı zorlaştırır ve yanlış donör doku temsili olasılığını arttırır.

Oryantasyon bloklarının dahil edilmesi ve yerleştirilmesi TMA yapımında büyük önem taşımaktadır. Bununla birlikte, bu, bant yöntemiyle oluşturulmuş TMA’lar için özellikle önemlidir. Bu, bant yönteminin inşaat sürecini tersine çevirmesinden ve böylece mekansal yönelim bozukluğu riskini arttırmasından kaynaklanmaktadır. Her bloğa en fazla üç yönlendirme çekirdeği eklemenizi ve bloğu en iyi şekilde yönlendirmek için örnek çekirdeklerden uzağa yerleştirilmelerini öneririz. Oryantasyon çekirdekleri, inşa edilmiş TMA temasından belirgin şekilde farklı dokular içeren doku bloklarından alınan çekirdekler veya dokusuz renkli oryantasyon araçları²¹ olabilir; burada ikincisi patolog olmayanlar için özellikle yararlıdır. Düzenli olmayan matris desenli çekirdek yerleşimi ile birleştiğinde, oryantasyon çekirdekleri oryantasyon bozukluğu riskini en aza indirir.

Bant ve alıcı yöntemleri kullanılarak inşa edilen TMA’lar arasındaki çekirdek uzunluğundaki belirgin fark, inşaat yöntemini seçerken karar verme sürecine donör blok derinliğinin dahil edilmesinden kaynaklanmaktadır. Burada özetlenen protokol, donör bloklar sırasıyla <4 mm ve 4 mm derinliklere sahip olduğunda TMA'ların bant ve alıcı yöntemleri kullanılarak oluşturulduğu bir eşik kullanır. Donör blok derinliğinin inşaat yöntemi seçimine dahil edilmesinin evrensel olmadığını belirtmek önemlidir. TMA'ların donör blok derinliğinden bağımsız olarak her iki yöntem kullanılarak da inşa edilmesi mümkün olsa da, daha uzun çekirdekler, bant yöntemini kullanarak TMA yapımı sırasında plastik kasetin yerleştirilmesine müdahale edebilir ve veya devrilebilir veya eğilebilir. Karar verme sürecine kriterleri dahil etme veya çıkarma seçimi, laboratuvarın kullanabileceği olanaklara, maliyete ve istenen nihai ürüne bağlıdır. Bu protokolün parametreleri altında, TMA'dan oluşturulan bir bant yönteminden elde edilebilecek slayta monte TMA bölümlerinin sayısı, alıcı yöntemle oluşturulmuş bir TMA'dan elde edilenden önemli ölçüde daha azdır. Donör blok derinliğini arttırmak ve alıcı yöntemle uyumlu hale getirmek için FFPE dokularını yeniden bloke etmek mümkün olsa da, re-blok içinde aynı doku oryantasyonunu elde etme olasılığı düşüktür. Buna karşılık, bu, muhtemelen önemli doku kaybını içerecek olan tam yüz bölümü elde etmek için geniş bir blok yüzü gerektirebilir. Blok cepheden sonra, TMA ile oluşturulmuş bir bant yöntemi, tüm çekirdeklerin mevcut olduğu yaklaşık 50 kaydırağa monte TMA bölümü verir. Bununla birlikte, kesin sayı bloktan bloğa değişecektir ve TMA'yı oluşturmak için kullanılan çekirdeklerin uzunluğuna ve kesilen bölümlerin kalınlığına bağlıdır (5 μm'ye karşı 4 μm). Ayrıca, farklı çekirdek uzunlukları nedeniyle, TMA'nın aşamalı olarak bölümlendirilmesi nedeniyle çekirdeklerin farklı zamanlarda tükeneceği de belirtilmelidir; devam eden patolojik incelemeye duyulan ihtiyacı yeniden vurgulayan bir özellik.

Alıcı yöntemi, daha az sıkıcı ve daha hızlı bir inşaat süreci de dahil olmak üzere bant yöntemine göre önemli faydalar ve avantajlar sunsa da, bant yöntemi deneyimli yüksek verimli laboratuvarlara yönelik değildir. Ortalama bir laboratuvara, özellikle de kaynak sınırlı ortamlardakilere, değişken derinliklerdeki donör bloklarına erişimi olan, ancak TMA inşaat hizmetlerine erişimi olmayan laboratuvarlara yöneliktir. Bununla birlikte, gelecekteki uygulamalar, yüksek verimli laboratuvarlarda uygun numune havuzunu geliştirmek ve donör blokların yeniden bloke edilmesi ihtiyacını ortadan kaldırmak için bu yöntemin otomasyonunu görebilir. Sonuç olarak, açıklanan TMA bant yöntemi yapım protokolü, pahalı ekipmanlara ihtiyaç duymadan uzman olmayan laboratuvarlarda kolayca kurulabilir. Bununla birlikte, yeni kullanıcıların, değerli dokular kullanarak TMA yapımına geçmeden önce bant yöntemi tekniğini tanımak için ilk başta FFPE doku blokları, dokusuz renkli oryantasyon araçları²¹ veya hatta dokusuz renkli parafin blokları kullanmaları önerilir. Yapımları, hem TMA bloklarını inşa edenlerin hem de kullananların farkında olması gereken potansiyel tuzaklar olmadan olmasa da, bu görünüşte cilalanmamış “ev yapımı” TMA inşaat yöntemi, araştırma için yüksek kaliteli, biyolojik olarak ilgili TMA’lar sağlayabilir. Gerçekten de, bant yöntemiyle oluşturulmuş TMA’lardan kaynaklanan TMA bölümleri, ACSR biyodeposunda en çok talep edilen doku örneklerinden biridir.