テープ法を用いた組織マイクロアレイの手動構築とハンドヘルドマイクロアレーラ

TMA構築プロセスの最も重要な構成要素の1つは、TMAコアが得られるFFPEドナーブロックの病理学的レビューである⁴。レビュー中、理事会認定の病理学者が、各ドナーブロックからの代表的なH&E染色組織切片を検査する。H&Eは、対応するドナーブロックの最良の表現であるように、新しく切断された組織切片を使用して生成されることが不可欠です。FFPE組織がブロック深さと広範な切片化によって組織プロファイルが大きく変化する可能性がある3次元構造であることを考えると、古いH&Esの使用は推奨されません。これは、H&Eが生成されてから発生した可能性があり、FFPEブロックの表現が不正確になる可能性があります。レビュープロセスは、適切な症例の選択、コアを取得するべき組織領域の同定、ならびにコアを収集する際に避けるべき領域の特定に不可欠である。病理学的レビューがない場合、不適切な組織を含む確率は有意に増加する。このような組織を含めることは、構築されたTMAをその意図された目的に無効かつ不適当にする可能性がある。重要なことに、このような効果のないTMAを無意識のうちに使用すると、虚偽で誤解を招くデータにつながる可能性が非常に高くなります。これは、FFPE組織のプロファイル、したがってそれらの誘導体コアが深さの増加とともに著しく変化する可能性があるという知識と相まって、構築されたTMAブロックの生涯を通じて病理学レビューを継続することの重要性を強調する。理想的には、H&Esは15^番目 または20^番目の セクションごとに生成して、コアの組織プロファイルの変化を確実にキャプチャして記録する必要があります。少なくとも、H&Eはプロジェクトの開始時と終了時に生成およびレビューされ、これらの潜在的な変更を監視する必要があります。これらの点と研究ツールとしてのTMAの重要性に照らして、病理学的レビューがTMA構築プロセスおよびTMAブロックの寿命を通してしっかりと組み込まれていることが不可欠です。

FFPEブロックは、研究目的でリリースされる前に、日常的な診断処理中に広範囲に分割されることがよくあります。その結果、ドナーブロック深さ、したがってドナーブロックコア長は、しばしば4mmの理想的なレシピエント法よりも小さい。ここでは、テープ法構築プロトコルを使用してTMAを構築する方法を示しましたが、その主な利点は、理想的でないFFPE組織ブロックのコアとの互換性です。テープ法は大きな研究価値があり、TMAブロックを構築するための安価で便利でアクセス可能な方法を提供しますが、その課題と限界がないわけではありません。1 つの TMA ブロックに 100 ~ 1,000 個のコアを収容できる自動受信方式と手動受信方式の両方と比較して、テープ方式⁹ を使用して構築された TMA には最大 40 コアを推奨します。別の制限は、建設の容易さに関するものである。レシピエント方式では、パンチングされたコアはプレキャスト型に挿入されるだけで、各コアを個々のウェルに包み込むことでコアの安定性が得られ、コアのマイグレーションを防止し、規則性の高いコアの配置と分離²²を促進する。さらに、受信者メソッドは、完全に手動、半手動、および完全に自動化されるというオプションの利便性を提供します。対照的に、手動テープ法は、ニードルピックを使用して手で各コアを慎重かつ穏やかに配置する必要があります。テープ法にプレキャスト金型がないため、レシピエント法で経験される非常に規則的な配置と分離が妨げられますが、この欠陥は市松模様のグリッドを含めることによって克服されます。ブロックエッジの配置を避けるために、市松模様のグリッドを金属トレイの中央に貼り付けることが重要ですが、コアを所定の位置に保持するパラフィンが不足している場合、コア損失のリスクが高まります。また、レシピエント方式で可能な小さなコア分離は、手動コア配置とニードルピックが隣接するコア間に収まる必要があるため、テープ方式では達成できないことにも注意する必要があります。コアは、DSSTで覆われたグリッドに接触するコアの表面積またはフットプリントが最小で、自立した直立した方法で配置されます。このセットアップは、レシピエント法よりもコアの安定性が大幅に低く、溶融パラフィンを注ぐときにコアの転倒や移行のリスクが高まります。実際、プロトコルの最も重要なステップの1つは、溶融パラフィンを注ぐことです。パラフィンが完全に液体であることを確認し、注ぎが最小限の乱流で穏やかに行われることを保証するために、オーブンから取り出したときにこれを迅速に行うことが不可欠です。興味深いことに、Chenらは、レシピエントブロックを作成するときおよびドナーブロックコア²³を挿入するときに針を導くためにブランクパラフィンブロックの上に置かれた、直径2mmの穴が均等に分布した7 x 11のステンシルに似た、非常に斬新な補助装置を開発しました。このような装置は、レシピエントブロックの構築を支援するように設計されているが、テープ方式に容易に適合させて、配置をガイドし、分離を調整し、建設プロセス中のコアの安定性を高めることができる。

コア安定性の最も重要な効果の1つは、テープ方式TMAに含まれるコアの数である。これは、コアの数が増えるにつれて、増加するコア数に対応するためにコアの直径を小さくする必要があり、その結果、DSSTに付着するコアフットプリントが減少するためです。テープ法TMA構造では、直径の小さいコアは特に不安定で、非常に穏やかなパラフィンを注いでも転倒しやすいことが分かっているので、最小コア直径1mmが推奨されます。16 G針(コア直径1.1 mm)と直径4 mmのパンチを使用した2つの異なる社内方法を調査した最近の研究では、1.1 mm(26.5%)でかなりの組織損失が発生しましたが、4 mmコアでは発生しませんでした²⁴。これは、小さなコアが建設中だけでなく、作業に問題があることを示しているようです。さらに、直径が小さいほど元のドナーブロックや大きなコアを表さない可能性があり、病理学的解釈が困難になり、ドナー組織表現が不正確になる可能性が高くなります。

オリエンテーションブロックの包含と配置は、TMA構造において非常に重要です。しかし、これはテープ方式で構築されたTMAにとって特に重要です。これは、テープ方式が建設プロセスを反転させ、それによって空間的見当識障害のリスクが高まるという事実に由来します。各ブロックに最大3つの向きのコアを含め、ブロックの向きを最適にするためにサンプルコアから離れて配置することをお勧めします。配向コアは、構築されたTMAまたは組織フリーカラー配向ツール²¹のテーマから明確に異なる組織を含む組織ブロックから採取されたコアとすることができ、ここで、後者は、非病理学者にとって特に有用である。非規則的なマトリックスパターンのコア配置と組み合わせることで、オリエンテーションコアは見当識障害のリスクを最小限に抑えます。

テープ法とレシピエント法を用いて構築されたTMA間のコア長の顕著な違いは、構築方法を選択する際の意思決定プロセスにドナーブロック深さを含めることに起因する。ここで概説するプロトコルは、ドナーブロックの深さがそれぞれ<4mmおよび4mmの場合に、TMAがテープ法およびレシピエント法を使用して構築される閾値を採用している。建設方法の選択にドナーブロック深さを含めることは普遍的ではないことに注意することが重要です。TMAはドナーブロックの深さに関係なくどちらの方法を使用しても構築することが可能であるが、より高いコアは、テープ法を用いたTMA構築中にプラスチックカセットの配置を妨げたり、転倒または傾斜させたりする可能性がある。意思決定プロセスに基準を含めるか省略するかは、ラボで利用可能なアメニティ、コスト、および所望の最終製品によって異なります。このプロトコルのパラメータの下では、テープ法構築TMAから得ることができるスライドマウントTMAセクションの数は、レシピエント法構築TMAから得られるものよりも有意に少ない。FFPE組織を再ブロックしてドナーブロックの深さを増加させ、レシピエント法と適合させることは可能であるが、リブロック内で同じ組織配向を達成する可能性は低い。次に、これは、フルフェース切片を得るために、広範囲のブロック対向を必要とする場合があり、これはおそらく有意な組織喪失を含むであろう。ブロックを向いた後、テープ法で構築されたTMAは、すべてのコアが存在する約50のスライドマウントTMAセクションを生成します。ただし、正確な数はブロックごとに異なり、TMAの構築に使用されるコアの長さと切断されるセクションの厚さ(5μm対4μm)によって異なります。さらに、コアの長さが異なるため、TMAが徐々に切断されるため、コアは異なる時間に消耗することにも注意する必要があります。継続的な病理学的レビューの必要性を再強調する属性。

受信者方式は、より退屈で迅速な建設プロセスを含む、テープ方式に比べて大きな利点と利点を提供しますが、テープ方式は経験豊富な高スループットラボを対象としていません。これは、平均的な実験室、特に資源が限られている環境にある研究室を対象としており、可変深さのドナーブロックにアクセスできますが、TMA建設サービスにはアクセスできません。しかし、将来のアプリケーションでは、ハイスループットラボで適格なサンプルのプールを強化し、ドナーブロックの再ブロッキングの必要性を排除するために、この方法の自動化が見られる可能性があります。結論として、記載されたTMAテープ法構築プロトコルは、高価な機器を必要とせずに、専門外の研究所で容易に確立することができる。しかしながら、新規使用者は、貴重な組織を用いたTMA構築に進む前に、テープ法技術に慣れるために、価値のない^FFPE 組織ブロック、組織フリー着色配向ツール21、または組織のない着色パラフィンブロックを最初に使用すべきであることが推奨される。TMAブロックの構築と使用の両方者が知っておくべき潜在的な落とし穴がないわけではありませんが、この一見洗練されていない「自家製」TMA建設方法は、高品質で生物学的に関連するTMAを研究にもたらすことができます。実際、テープ法で構築されたTMAに由来するTMA切片は、ACSRバイオリポジトリで最も要求の厳しい組織サンプルの1つです。