Poliglutamin aracılı nörotoksisiteye karşı biyoaktif bileşiklerin keşfedilmesi için bir model sistem olarak Caenorhabditis elegans

NOT: Bu protokolde kullanılan çözümlerin tarifleri için Tablo 1’e bakın. 1. Caenorhabditis elegans testi için materyallerin hazırlanması C. elegans suşlarının bakımı C. elegans (AM141 ve HA759) ve Escherichia coli (OP50 ve NA22) suşlarını elde edin (Malzeme Tablosuna bakınız). E. coli OP50 ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı (NGM) plakasındaki nematodları, AM141 21 için 20 °C’de veya HA75923 için 15 °C’de tutun. E. coli OP50 bakteri kültürünün hazırlanması Bir Luria-Bertani (LB) çizgi plakasından tek bir E. coli OP50 kolonisi seçin ve 50 mL sıvı LB kültürüne aşılayın. OP50 bakterilerini 37 ° C ve 200 rpm’de bir çalkalayıcıda, 570 nm’de (OD 570) ~0,5 optik yoğunluğa kadar inkübe edin. OP50 bakteri kültürünü 4 °C’de saklayın ve iki hafta içinde kullanın. OP50 bakterileri ile NGM plakalarının hazırlanması 1 L otoklavlanabilir bir şişeye 20 g agar, 2.5 g pepton, 3.0 g NaCl ve 975 mL deiyonize su ekleyin. 30 dakika boyunca 121 °C’de otoklav. Sıvı NGM agar şişesini ~60 ° C’ye soğuması için tezgahın üzerine yerleştirin ve ardından aşağıdaki steril stok çözeltilerini ekleyin: 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 5 mg / mL kolesterol ve 25 mL 1 M potasyum fosfat (pH 6.0). Steril 90 mm’lik Petri kabına 20 mL NGM dökün ve soğuması ve katılaşması için tabakları tezgahın üzerinde bırakın. Plakaları baş aşağı tutun ve tezgahta oda sıcaklığında 2 gün kurumasını bekleyin. Her bir NGM plakasına 200 μL OP50 bakteri kültürü dağıtın ve steril bir cam kaplama çubuğu ile eşit şekilde yayın. Kapakları kapatın ve plakaları gece boyunca 37 ° C’de inkübe edin. OP50 ile tohumlanmış NGM plakalarını oda sıcaklığında kapaklı plastik bir kutuda saklayın ve iki hafta içinde kullanın. Yaş senkronize C. elegans popülasyonunun hazırlanması Yerçekimi yetişkin nematodlarını steril bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne toplayın ve 1 dakika boyunca 1000 × g’da santrifüj yapın. Üç kez yıkayın ve nematodları M9 tamponunda yeniden askıya alın. Eşit miktarda ağartıcı çözeltisi ekleyin ve 3-5 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Ağartmayı her 15 saniyede bir diseksiyon mikroskobu altında izleyin.NOT: Ağartıcı çözeltisi, NaOCl ve 1 M NaOH (Tablo 1)20’ye eşit hacimlerde karıştırılarak kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır. Nematodların çoğu kırıldıktan sonra, M9 tamponu ile seyrelterek sindirimi durdurun. Süpernatantı çıkarmak için hızlı bir şekilde santrifüj yapın ve yıkamayı üç kez tekrarlamak için peleti M9 tamponunda yeniden askıya alın. Peleti S ortamında yeniden askıya alın. Yumurtalar süpernatanda kalırken nematod kalıntılarının 2-3 dakika boyunca yerçekimi ile yerleşmesine izin verin. Süpernatantı yeni bir steril mikrosantrifüj tüpüne aspire edin. Yumurtaları 1 dakika boyunca 1000 × g’de santrifüjleme ile toplayın. Süpernatantın ~% 80’ini atın ve yumurtaları 20 mL S ortamı içeren steril bir şişeye aktarın. Şişeyi bir çalkalayıcıya yerleştirin ve senkronize L1 nematodları elde etmek için yumurtaları gece boyunca yiyeceksiz olarak 120 rpm’de kuluçkaya yatırın. 2. PolyQ toplama testi PoliQ agregasyon testi için nematodların hazırlanması AM141’in 300-500 senkronize L1 larvasını, OP50 (OD570 / 0.7-0.8) ve 5 mg / mL astragalan, tipik olarak bir zaman noktası için tedavi başına bir kuyucuk içeren 500 μL S ortamı içeren 48 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. Plakayı parafilm ile kapatın ve 24, 48, 72 ve 96 saat boyunca 20 ° C ve 120 rpm’de inkübe edin. Nematodları steril bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve kalan OP50’yi çıkarmak için santrifüjleme ile M9 tampon >3 kez (1 dakika boyunca 1000 × g) ile yıkayın. AM141 nematodlarını M9 arabelleğinde yeniden askıya alın ve görüntü yakalamaya hazır tutun. Floresan görüntülerin elde edilmesi ve veri analiziNOT: Veriler bu yüksek içerikli görüntüleme sistemi ile otomatik olarak analiz edilir. Otomatik bir görüntüleme cihazı mevcut değilse, görüntü elde etmek için bir agaroz pedi hazırlamak için geleneksel bir yöntem, ortak bir floresan mikroskobu 7,15,17 kullanılarak benzer bir performans elde etmek için kullanılabilir (bkz. adım 3.2 ve 3.3). 384 kuyucuklu bir plakada her bir kuyucuğa 10-15 nematod aktarın (kuyu başına son hacim 80 μL). Her tedavi için 10 replikasyon kuyusu ayarlayın. Nematodları felç etmek ve dibe (5-10 dakika) yerleşmelerini sağlamak için her bir kuyucuğa 10 μL 200 mM sodyum azid ekleyin. Floresan görüntüler elde etmek için plakayı yüksek içerikli bir görüntüleme sistemine yerleştirin (cihaz ve yazılım bilgileri için Malzeme Tablosu’na bakın). Görüntü alma yazılımını açın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın. Plaka Alma Kurulumu penceresini açın ve yeni bir deneme kümesi ve adı oluşturun. Büyütmeyi 2x, Kamera gruplamayı 1 ve Plaka türünü 384 delikli plaka olarak seçin. Ziyaret edilecek kuyuları ve siteleri (tek site) ayarlayın. Floresein izotiyosiyanat (FITC) filtresini seçin ve görüntü tabanlı odaklama seçeneklerini etkinleştirin. Pozlama’yı 300 ms olarak ayarlayın.NOT: Yukarıdaki ayarlar, görüntüleme parametrelerini optimize etmek için test edilebilir ve ayarlanabilir. Görüntü alma ayarlarını kaydedin ve çalıştırmak için Plaka Al düğmesine tıklayın. Görüntü analiz yazılımını kullanarak görüntü verilerini analiz edin. Plaka Verilerini Gözden Geçir penceresini açın ve görüntü analizi için Test plakasını seçin. Görüntüsünü görüntülemek için bir test kutusuna çift tıklayın. Analiz yöntemi olarak Çekirdekleri Say’ı seçin ve aşağıdaki ayarlar için bir pencere açmak üzere Ayarları Yapılandır düğmesine tıklayın. Kaynak görüntüyü FITC kanalından tanımlayın ve Standart Algoritma’yı seçin. Görüntü analizi parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: yaklaşık minimum genişlik = 10 μm (= 2 piksel); yaklaşık maksimum genişlik = 50 μm (= 12 piksel); Yerel arka planın üzerindeki yoğunluk = 1.000-2.000 gri seviye. Analiz yöntemini optimize etmek için geçerli ayarları test edin. Ayarları kaydedin ve analizi tüm kuyucuklarda çalıştırın.NOT: Bir 384 kuyucuklu plaka için analizi bitirmek ~ 20 dakika sürer. Toplam Çekirdekleri, her bir kuyucuktaki toplam Q40::YFP agregası sayısı olarak dışa aktarın. Her kuyucuktaki nematodların sayısını sayın. Her gruptaki nematod başına ortalama Q40::YFP agregaları sayısını hesaplayın ve her zaman noktasındaki verilere doğrusal olmayan bir eğri uyumu uygulayın. Aşağıdaki eq (1)’i kullanarak inhibisyon indeksini hesaplayın:İnhibisyon indeksi = (1)Burada Nkontrolü ve Nörneği , sırasıyla kontrol ve tedavi gruplarındaki ortalama Q40::YFP agregaları sayısıdır. 3. PoliQ aracılı nörotoksisite testleri C. elegans’ın test numuneleri ile tedavisi PoliQ nörotoksisite testine nematodlar hazırlamak için, HA759’un 300-500 senkronize L1 larvasını, OP50 (OD 570 / 0.0.8) ve 5 mg / mL astragalan, tipik olarak her tedavi için üç replikasyonkuyusu içeren 500 μL S ortamı içeren 48 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. Plakayı parafilm ile kapatın ve 3 gün23 boyunca 15 ° C ve 120 rpm’de inkübe edin. Nematodları santrifüjleme ile toplayın ve M9 tamponu ile 3-5 kez yıkayın. Nöronal sağkalım ve kaçınma testlerinde kullanılmak üzere M9 tamponundaki nematodları yeniden askıya alın. Agaroz pedinin hazırlanması 100 mL M9 tamponuna (% 2, w / v) 2 g agaroz ekleyin ve agaroz çözeltisini bir mikrodalgada kaynamaya yakın bir şekilde ısıtın. 2 mm kalınlığında iki cam plaka parçası arasına yerleştirilmiş 1 mm kalınlığında mikroskopi cam slaytının ortasına 0,5 mL eritilmiş agaroz dağıtın. Dikey olarak başka bir slaytla örtün. Agaroz soğuduktan ve katılaştıktan sonra, üst kaydırağı yavaşça çıkarın. ASH nöronal sağkalım testi Agaroz pedine bir damla 20 mM sodyum azid ekleyin. 15-20 HA759 nematodları hareketsiz hale getirmek için damlaya aktarın. Nematodların üzerine yavaşça bir örtü yerleştirin. Slaytı dijital kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobun altında tutun. Nematodların baş bölgesindeki GFP-pozitif ASH nöronlarını tespit etmek için 40x objektif lens ve FITC filtresi seçin. Baş bölgesi7’de GFP etiketli bilateral ASH nöronları olan nematodların sayısını saymak için her grupta rastgele 50’den fazla nematod seçin. Aşağıdaki eq (2) kullanarak ASH nöronlarının hayatta kalma oranını hesaplayın.Nöronal sağkalım (%) = (2)Burada Nsağkalım ve Ntoplamı , sırasıyla GFP-pozitif ASH nöronları olan nematodların sayısı ve her grupta test edilen nematodların toplam sayısıdır. Ozmotik kaçınma testi Gıda içermeyen bir NGM plakasını (9 cm) normal (N) içine bölün ve ortadaki 8 M gliserol (~ 30 μL) çizgisi ile (T) bölgeleri yakalayın. Gliserol bariyerinden T Bölgesi’ne geçen nematodları felç etmek için gliserol hattından ~1 cm uzakta 200 mM’lik bir sodyum azid (~20 μL) hattı yayın. Her biri için üç replika plakasının N Bölgesi’ne ~200 nematod aktarın. Nematodları çekmek için Bölge T’ye (plaka kenarından 1 cm) % 1 bütandion (~ 2 μL) damla ekleyin. Petri kabının kapağını hemen örtün ve 90 dakika boyunca 23 ° C’de kuluçkaya yatırın. Mikroskop altında N ve T bölgelerindeki nematodların sayısını puanlayın. eq (3)20 kullanarak kaçınma endeksini hesaplayın.Kaçınma indeksi = (3)Burada N ve T, sırasıyla N ve T bölgelerindeki nematodların sayısıdır. Veriler, ±3 bağımsız deneyi temsil eden üç kopyanın standart sapmasını (SD) > araçlar olarak sunulmaktadır. Astragalan ve kontrol gruplarından gelen verileri karşılaştırmak için eşleşmemiş, iki kuyruklu bir t-testi gerçekleştirin. 4. Radar grafiği oluşturma Grafik yazılımını açın ve farklı tahlillerdeki verileri yeni bir sayfaya aktarın. Radyal eksenlerin başlıkları olarak A(X) sütununu, kontrol grubundaki veriler olarak A(Y) sütununu ve tedavi grubundaki veriler olarak B(Y) sütununu girin. Gerekli verileri seçin ve Plot | Uzmanlaşmış: Bir radar grafiği oluşturmak için araç çubuğu menüsündeki radar düğmesi. Radyal eksene çift tıklayın ve her eksenin Ölçek, Onay ve İşaretle etiketlerini gerektiği gibi ayarlayın. Menüde Dosya’ya tıklayın ve görüntüyü *.tiff olarak kaydetmek için Grafikleri Dışa Aktar’ı seçin.NOT: Malzeme Tablosundaki yazılım web siteleri, radar çizelgeleri oluşturma konusunda ayrıntılı yardım belgeleri ve video eğitimleri sağlar.