מיצוי בסיוע קולי של חומצה קנבידיולית מביומסת קנאביס
Summary
מיצוי בסיוע קולי (UAE) מגביר את יעילות המיצוי של ממסים וכאשר מיישמים אותו על ביומסה של קנאביס spp. הוא מקצר את הזמן הדרוש למיצוי. זה מקטין את העלות ואת אובדן הקנבינואידים הפוטנציאלי עקב השפלה. בנוסף, איחוד האמירויות הערביות נחשבת לשיטה ירוקה בשל שימוש נמוך בממסים.
Abstract
קנבוס תעשייתי (קנאביס spp.) יש תרכובות רבות של עניין עם יתרונות רפואיים פוטנציאליים. מבין התרכובות הללו, קנבינואידים הגיעו למרכז תשומת הלב, במיוחד קנבינואידים חומציים. המיקוד פונה לכיוון קנבינואידים חומציים בשל חוסר הפעילות הפסיכוטרופית שלהם. צמחי קנאביס מייצרים קנבינואידים חומציים עם צמחי קנבוס המייצרים רמות נמוכות של קנבינואידים פסיכוטרופיים. לפיכך, שימוש בקנבוס למיצוי קנבינואידים חומצי יבטל את הצורך בדקרבוקסילציה לפני המיצוי כמקור לקנבינואידים. השימוש במיצוי מבוסס ממסים הוא אידיאלי להשגת קנבינואידים חומציים שכן המסיסות שלהם בממסים כגון CO2 סופר-קריטי מוגבלת בשל הלחץ והטמפרטורה הגבוהים הנדרשים כדי להגיע לקבועי המסיסות שלהם. שיטה חלופית שנועדה להגביר את המסיסות היא מיצוי בסיוע קולי. בפרוטוקול זה נבדקה ההשפעה של קוטביות הממסים (אצטוניטריל 0.46, אתנול 0.65, מתנול 0.76 ומים 1.00) וריכוז (20%, 50%, 70%, 90%, ו-100%) על יעילות המיצוי בסיוע קולי. התוצאות מראות כי מים היו הכי פחות יעילים ואצטוניטריל היה הממס היעיל ביותר שנבדק. אתנול נבדק עוד יותר מכיוון שיש לו את הרעילות הנמוכה ביותר והוא נחשב בדרך כלל כבטוח (GRAS). באופן מפתיע, 50% אתנול במים הוא ריכוז האתנול היעיל ביותר למיצוי הכמות הגבוהה ביותר של קנבינואידים מהמפ. העלייה בריכוז החומצה הקנאבידיולית הייתה 28% בהשוואה ל-100% אתנול, ו-23% בהשוואה ל-100% אצטוניטריל. בעוד שנקבע כי 50% אתנול הוא הריכוז היעיל ביותר עבור היישום שלנו, השיטה הוכחה גם כיעילה עם ממסים חלופיים. כתוצאה מכך, השיטה המוצעת נחשבת ליעילה ומהירה למיצוי קנבינואידים חומציים.
Introduction
קנבוס תעשייתי (Cannabis spp.) מייצר קנבינואידים חומציים ברקמות צמחיות שונות (פרחים, עלים וגבעולים), כאשר הריכוז הגבוה ביותר נמצא בפרח1. תעשיית הקנאביס משתמשת במספר שיטות למיצוי תרכובות אלה. שיטה אחת כזו היא מיצוי ממס המשתמש בממס שאינו קוטבי ו/או קוטבי, שאתנול הוא הנפוץ ביותר בו. עם זאת, מיצוי הממס לבדו מוגבל ביכולתו; לכן, טכניקות מיצוי אוגמנטטיביות, כגון מיצוי בסיוע מיקרוגל (MAE) ומיצוי בסיוע קולי (UAE), נועדו להגדיל את התפוקה. בנוסף, ניתן להפיק קנאבידיול בריכוז גבוה (CBD) באמצעות טכנולוגיות נוזל סופר קריטי2.
מיצוי הוא תהליך דינמי, ומספר גורמים משפיעים על יעילותו, כלומר תכולת הלחות, גודל החלקיקים והממס3. באופן ספציפי, עבור טכניקת איחוד האמירויות הערביות, היעילות נשלטת על ידי טמפרטורה, לחץ, תדירות וזמן4.
מיצוי בסיוע על-קולי הוא התהליך שבו גלים על-קוליים מועברים דרך נוזל כדי להתסיס חלקיקים. במהלך תהליך התסיסה, חומרים צמחיים חווים קוויטציה אקוסטית, מחזורי דחיסה והתפשטות היוצרים בועות המתמוטטות בתמיסה וכתוצאה מכך נוצרות טמפרטורה ולחץ קיצוניים5. שינויי הלחץ והטמפרטורה משנים את התכונות הפיזיקליות של הממסים, מה שעלול לגרום ליעילות מוגברת של מיצוי6. בנוסף, קוויטציה יכולה לשבש אינטראקציות מולקולריות ולהוביל לכך שתרכובות אורגניות ואנאורגניות יזרקו ממטריצת הצמח7. התהליך כולל שני סוגים עיקריים של תופעות פיזיקליות: (1) דיפוזיה לרוחב דופן התא, ו-(2) שטיפה של תכולת התאים לאחר שבירת הדופן8. עם זאת, השימוש באיחוד האמירויות אינו חף ממלכודותיה; ישנם מספר דיווחים על כך שאיחוד האמירויות הערביות יכולה להשפילמתחמים 9,10. בנוסף, הטמפרטורות הנוצרות באתרי הקוויטציה הן מעל אלה הדרושות לדקרבוקסילציה של קנבינואידים. עם זאת, Mudge et al.11 השתמשו באיחוד האמירויות הערביות ולא הבחינו בדקרבוקסילציה גדולה של CBD או טטרהידרוקנבינול (THC), ובכך הוכיחו כי איחוד האמירויות הערביות היא שיטה יעילה וירוקה להפקת קנבינואידים מכיוון שניתן להפיק אותם במהירות באמצעות אנרגיה נמוכה.
De Vita et al.12 בחנו את השימוש בשיטות MAE ו-UAE באופן ספציפי ומצאו כי בעת יישום התנאים האופטימליים עבור כל שיטה, איחוד האמירויות הערביות הוציאה יותר מה-CBD וה-THC החומציים והנייטרליים הקיימים בחומר הצמחי. באופן דומה, Rožanc et al.13 השוו שיטות מיצוי מרובות (איחוד האמירויות הערביות, סוקשלאט, מקרציה ונוזל סופר-קריטי) ובחנו את הפעילות הביולוגית של התמציות. רוז’נץ הראה כי כל השיטות יעילות במיצוי קנבינואידים; עם זאת, נוזל סופר-קריטי ואיחוד האמירויות הערביות היו היעילים ביותר במיצוי חומצה קנאבידיולית (CBDA). בנוסף, המיצוי של איחוד האמירויות הערביות היה בעל הפעילות הביולוגית הגבוהה ביותר כאשר הוא נמדד על ידי בדיקת 2,2-דיפניל-1-פיקריל-הידרזיל (DPPH). המחקר של רוז’אנק הראה גם כי בעוד שתהליכי המיצוי יעילים בייצור תמציות גולמיות, עדיין יש חלק מתרכובות שאינן קנבינואידיות המשפיעות על הפעילות הביולוגית של התמציות. בנוסף, תרכובות אלה יכולות לסבך את הבידוד והטיהור של תרכובות קנבינואידיות בודדות מהתמציות הגולמיות13.
טכניקות מיצוי נוזלים סופר-קריטיות (SFE) שימשו למיצוי קנבינואידים ניטרליים. מספר מחקרים הראו כי SFE בתוספת ממס אורגני, כגון אתנול, הביאו ליעילות מיצוי גבוהה יותר של קנבינואידים ניטרליים 2,3. כאשר הלחץ עלה לרמות המסוגלות לחלץ את הקנבינואידים החומציים, גם התכולה הלא-קנבינואידית עלתה. ככאלה, לחצים גבוהים אלה אינם מעשיים לעיבוד תעשייתי מכיוון שהסלקטיביות של SFE עבור קנבינואידים פחתה ונדרש עיבוד נוסף לאחר עיבוד. כתוצאה מכך, דה-קרבוקסילציה חייבת להיעשות לפני SFE, מה שעלול לגרום להפסדי קנבינואידים של עד 18%2. כדי להגביר את היעילות ב- SFE, הוא שולב עם טכניקות כגון מיצוי בשלב מוצק כדי להגביר את הטוהר של התמצית הסופית14. עם זאת, למרות שיש לו טוהר גבוה כמוצר הסופי, רק קנבינואידים ניטרליים מתקבלים.
באופן מסורתי, במעבדה האנליטית, קנבינואידים הופקו בתערובת מתנול:כלורופורם ביחס של 9:1. עם זאת, Mudge et al.11 הראו כי ניתן לבצע מיצוי יעיל עם ממסים בודדים בעת שימוש באיחוד האמירויות הערביות. המחקר הראה כי 80% מתנול היה יעיל כמו מיצוי המסורתי של מתנול:כלורופורם ביחס של 9:1, ובכך הצביע על כך שממסים ירוקים יותר יכולים להיות יעילים באותה מידה. ככזו, איחוד האמירויות הערביות נבחנה לשימוש הפוטנציאלי שלה בשל מספר יתרונות, כולל עלות הון נמוכה, זמן מיצוי מופחת, ושימוש נמוך יותר באנרגיה ונפחי ממסים נמוכים יותר. עם זאת, במקרה של איחוד האמירויות הערביות, כאשר נעשה שימוש בממסים קוטביים, ניתן לחלץ כלורופיל ושאר לא קנבינואידים שאינם קנבינואידים, מה שעלול לגרום לבעיה בצבע7. כתוצאה מכך, כדי לבחון את הפוטנציאל להשגת קנבינואידים חומציים בקנה מידה מסחרי, איחוד האמירויות הערביות הועסקה בשימוש בזן הקנבוס התעשייתי Cherry Wine. יין דובדבנים הוא הכלאה של C. sativa ו – C. indica, הכלאה בין הזנים של האישה והדובדבנים של שרלוט. זן יין הדובדבן הוא זן CBDA גבוה המייצר (15% עד 25% CBD) עם רמות נמוכות של חומצה טטרהידרוקנבינולית (THCA). הזן הוא זן C. indica-dominate שיש לו 7 עד 9 שבועות של פריחה.
על מנת לבסס את פרוטוקול החילוץ האופטימלי של איחוד האמירויות הערביות, ננקטו שתי גישות: האופטימיזציה המסורתית של גורם אחד בכל פעם (OFT) וגישת תכנון ניסוי (DoE) באמצעות תכנון מרוכב מרכזי (CCD)15. עבור DoE, מיצוי CBDA/CBD עבר אופטימיזציה על בסיס יחס המדגם/ממס, זמן המיצוי וריכוז הממס כגורמים, והנתונים שהתקבלו נותחו על ידי מתודולוגיית משטח התגובה (RSM). לסיכום, הפרוטוקול המתואר מתאר את השיטה האופטימלית לחילוץ הכמות הגבוהה ביותר של CBDA / CBD.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקוטביות של ממס ממלאת תפקיד קריטי במיצוי יעיל של תרכובות. מאחר שקנבינואידים חומציים הם מעט קוטביים באופיים, בעיקר בשל החומצה הקרבוקסילית moiety, ההנחה הייתה שממס קוטבי כמו מתנול או אתנול יהיה היעיל ביותר. גארט והאנט19, במחקרם באמצעות THC, הראו כי מסיסות באתנול מימי התבססה על אחוז א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי המכון לחקר הקנאביס באוניברסיטת המדינה של קולורדו-פואבלו, מענק קרן החדשנות של קוריאה שמומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT) (2021-DD-UP-0379), והעיר צ’ונצ’און (מו”פ ותיעוש קנבוס, 2020-2021).
Materials
| Acetonitrile | J.K.Baker | 9017-88 | solvent |
| Cannabichromene | Cerilliant | C-143 | Cannabinoids standard |
| Cannabidiol | Cerilliant | C-045 | Cannabinoids standard |
| Cannabidiolic acid | Cerilliant | C-144 | Cannabinoids standard |
| Cannabidivarin | Cerilliant | C-140 | Cannabinoids standard |
| Cannabigerol | Cerilliant | C-141 | Cannabinoids standard |
| Cannabinol | Cerilliant | C-046 | Cannabinoids standard |
| Centrifuge | Hanil Scientific Inc | Supra 22K | Centrifuge |
| Cherry Wine hemp | CFH, Ltd. | – | Flower extraction material |
| Distilled water | TEDIA | WS2211-001 | solvent |
| Ethanol | TEDIA | ES1431-001 | solvent |
| Filter paper | Whatman | #2 | Filtering |
| Grinder | Daesung Artlon | DA280-S | Milling |
| HPLC | Shimadzu | LC-10 system | Analysis of Cannabinoid |
| Methanol | TEDIA | MS1922-001 | solvent |
| Minitab 16.2.0 | Minitab Inc. | ||
| Syringe filters | Whatman | 6779-1304 | Filtering |
| Tetrahydrocannabivarin | Cerilliant | T-094 | Cannabinoids standard |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-aldrich | 302031-1L | HPLC flow solvent |
| Untrasonic bath | Jinwoo | 4020P | Ultrasonic extraction |
| Zorbax Eclipse plus C18 HPLC column | Agilent | 9599990-902 | HPLC column |
| Δ8 – Tetrahydrocannabinol | Cerilliant | T-032 | Cannabinoids standard |
| Δ9 – Tetrahydrocannabinol | Cerilliant | T-005 | Cannabinoids standard |
| Δ9 – Tetrahydrocannabinolic acid | Cerilliant | T-093 | Cannabinoids standard |
References
- Hemphill, J. K., Turner, J. C., Mahlberg, P. G. Cannabinoid content of individual plant organs from different geographical strains of Cannabis sativa L. Journal of Natural Products. 43 (1), 112-122 (1980).
- Baldino, L., Scognamiglio, M., Reverchon, E. Supercritical fluid technologies applied to the extraction of compounds of industrial interest from Cannabis sativa L. and to their pharmaceutical formulations: A review. Journal of Supercritical Fluids. 165, 104960 (2020).
- Daniel, R. G., et al. Supercritical extraction strategies using CO2 and ethanol to obtain cannabinoid compounds from cannabis hybrid flowers. Journal of CO2 Utilization. 30, 241-248 (2019).
- Azmir, J., et al. Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials: A review. Journal of Food Engineering. 117 (4), 426-436 (2013).
- Ohl, C. D., Kurz, T., Geisler, R., Lindau, O., Lauterborn, W. Bubble dynamics, shock waves and sonoluminescence. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 357 (1751), 269-294 (1999).
- Castro-Puyana, M., Marina, M. L., Plaza, M. Water as green extraction solvent: Principles and reasons for its use. Current Opinion in Green and Sustainable Chemistry. 5, 31-36 (2017).
- Herrera, M. C., De Castro, M. L. Ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from strawberries prior to liquid chromatographic separation and photodiode array ultraviolet detection. Journal of Chromatography A. 1100 (1), 1-7 (2005).
- Mason, T. J., Paniwnyk, L., Lorimer, J. P. The uses of ultrasound in food technology. Ultrasonics Sonochemistry. 3 (3), 253-260 (1996).
- Soares, V. P., et al. Ultrasound assisted maceration for improving the aromatization of extra-virgin olive oil with rosemary and basil. Food Research International. 135, 109305 (2020).
- Kshitiz, K., et al. Ultrasound assisted extraction (UAE) of bioactive compounds from fruit and vegetable processing by-products: A review. Ultrasinics Sonochemistry. 70, 105325 (2017).
- Mudge, E. M., Murch, S. J., Brown, P. N. Leaner and greener analysis of cannabinoids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (12), 3153-3163 (2017).
- De Vita, D., et al. Comparison of different methods for the extraction of cannabinoids from cannabis. Natural Product Research. 34 (20), 2952-2958 (2020).
- Rožanc, J., et al. Different Cannabis sativa extraction methods result in different biological activities against a colon cancer cell line and healthy colon cells. Plants. 10 (3), 566 (2021).
- Karğili, U., Aytaç, E. Supercritical fluid extraction of cannabinoids (THC and CBD) from four different strains of cannabis grown in different regions. The Journal of Supercritical Fluids. 179, 105410 (2022).
- Sushma, C., et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction (UAE) process for the recovery of bioactive compounds from bitter gourd using response surface methodology (RSM). Food and Bioproducts Processing. 120, 120-122 (2022).
- David, J. P., et al. Potency of Δ9-THC and Other Cannabinoids in Cannabis in England in 2005: Implications for Psychoactivity and Pharmacology. Journal of Forensic Sciences. 11, 129 (2008).
- Agarwal, C., Máthé, K., Hofmann, T., Csóka, L. Ultrasound-assisted extraction of cannabinoids from Cannabis Sativa L. optimized by response surface methodology. Journal of Food Science. 83 (3), 700-710 (2018).
- Oroian, M., Ursachi, F., Dranca, F. Influence of ultrasonic amplitude, temperature, time and solvent concentration on bioactive compounds extraction from propolis. Ultrasonics Sonochemistry. 64 (2020), 105021 (2020).
- Garrett, E. R., Hunt, A. Physiochemical properties, solubility, and protein binding of Δ9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmaceutical Sciences. 63 (7), 1056-1064 (1974).
- Metcalf, D. G. Chemical Abstracts. United States patent. , (2020).
- Lazarjani, M. P., Young, O., Kebede, L., et al. Processing and extraction methods of medicinal cannabis: a narrative review. Journal of Cannabis Research. 3 (1), 1-15 (2021).
- Lewis-Bakker, M. M., Yang, Y., Vyawahare, R., Kotra, L. P. Extractions of medical cannabis cultivars and the role of decarboxylation in optimal receptor responses. Cannabis and Cannabinoid Research. 4 (3), 183-194 (2019).
- Brighenti, V., Pellati, F., Steinbach, M., Maran, D., Benvenuti, S. Development of a new extraction technique and HPLC method for the analysis of non-psychoactive cannabinoids in fibre-type Cannabis sativa L.(hemp). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 143, 228-236 (2017).
- . FDA Available from: https://www.cfsanappsexternal.fda.gov/scripts/fdcc/?set=SCOGS (2021)
- Rae, J., et al. Estimation of ultrasound induced cavitation bubble temperatures in aqueous solutions. Ultrasonics Sonochemistry. 12, 325-329 (2005).
- Moreno, T., Montanes, F., Tallon, S. J., Fenton, T., King, J. W. Extraction of cannabinoids from hemp (Cannabis sativa L.) using high pressure solvents: An overview of different processing options. Journal of Supercritical Fluids. 161, 104850 (2020).
- Zhang, Q. W., Lin, L. G., Ye, W. C. Techniques for extraction and isolation of natural products: a comprehensive review. Chinese Medicine. 13 (20), 1-26 (2018).
- Fathordoobady, F., Singh, A., Kitts, D. D., Singh, A. P. Hemp (Cannabis sativa L.) extract: Anti-microbial properties, methods of extraction, and potential oral delivery. Food Reviews International. 35 (7), 664-684 (2019).
