JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

PCR-Plate Deep Well Microplate Cihazları Kullanılarak Daha Büyük Bakteriyel Biyofilm Biyokütlesinin Oluşturulması

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63069
, , , ,
1Department of Medical Microbiology and Infectious Diseases,University of Manitoba, 2National Microbiology Laboratory,Public Health Agency of Canada

Summary

Bu protokol, yüksek verimli 96 kuyulu sabitlenmiş kapak statik biyofilm taraması için kendinden montajlı derin kuyu PCR plakalı cihazları kullanarak biyofilm büyümesi ve biyokütle ölçümleri yapmak için metodoloji sunar.

Abstract

Bakteriyel biyofilmlerin geleneksel antimikrobiyal müdahaleler kullanılarak yüzeylerden yok edilmesi zordur. Yüksek verimli 96 kuyucuklu mikroplaka yöntemleri, minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonu (MBEC) değerlerini hesaplamak için hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi için bakteriyel biyofilmlerin yetiştirilmesinde sıklıkla kullanılmaktadır. Standart biyofilm cihazları, 96 delikli mikro plakalara takılı polistiren mandallı kapaklardan oluşur ve biyofilm biyokütlesi ve MBEC değerlerini ölçmek için idealdir, ancak bu cihazlar biyokütle birikimi ve maliyeti için mevcut mandal yüzey alanı ile sınırlıdır. Burada, Escherichia coli BW25113 ve Pseudomonas aeruginosa PAO1 biyofilmlerini büyütmek için kendinden montajlı polipropilen 96 kuyu derinliğinde PCR plakalı mandallı kapak cihazını kullanmak için bir protokol taslağı sunuyoruz. Kristal menekşe biyokütle boyama ve MBEC tayin testleri kullanılarak her türün standart ve derin kuyu cihazlarında oluşturduğu 24 saatlik biyofilmlerin karşılaştırılması anlatılmıştır. Derin kuyu cihazlarının daha geniş yüzey alanının, her iki türün de genel biyofilm oluşumunu 2-4 kat arttırması bekleniyor. P. aeruginosa, standart cihaza kıyasla derin kuyu mandallarında önemli ölçüde daha fazla biyokütle / mm2 oluşturdu. E. coli, standart polistiren cihazlarda, derin kuyu cihazına kıyasla daha fazla biyokütle / mm2’ye sahipti. Sodyum hipoklorit (ağartıcı) veya benzalkonyum klorür (BZK) gibi dezenfektanlarla yapılan biyofilm eradikasyon testleri, her iki bileşiğin de E. coli ve P. aeruginosa biyofilmlerini her iki cihazdan da farklı MBEC değerlerinde elimine edebileceğini göstermiştir. BZK biyofilm eradikasyonu, cihazlar arasında değişken E. coli MBEC değerleriyle sonuçlandı, ancak ağartıcı hem türler hem de cihazlar için tekrarlanabilir MBEC değerleri gösterdi. Bu çalışma, daha yüksek miktarlarda statik biyofilm gerektiren aşağı akış çalışmaları için polipropilen cihazlarda daha büyük miktarlarda biyofilm yetiştirmek için yüksek verimli bir derin kuyu yöntemi sunmaktadır.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa ve Escherichia coli, biyofilmler olarak bilinen sapsız, yüzeye bağlı hücre toplulukları oluşturma yetenekleri nedeniyle yaygın olarak çalışılan Gram-negatif proteobakterilerdir1. Her iki tür de, biyofilm olarak büyürken, esas olarak farklı polisakkaritler ve proteinlerden oluşan hücre dışı polimerik maddelerin (EPS) bir matrisini salgılayabilir, bu da hücre dışı DNA ve / veya lipitleri de içerebilir, bu da ek hücresel koruma ve sert, besin sınırlı ortamlarda daha iyi sağkalım sağlar2,3. Her iki türün biyofilm fizyolojisi ve oluşumu, Kanada’da hastane hastası kan, idrar yolu ve akciğer enfeksiyonlarından en sık izole edilen ilk beş antimikrobiyal dirençli patojeni temsil ettikleri için klinik açıdan önemlidir4,5. Biyofilmlerin, bu bakteri türlerinin neden olduğu tüm kronik ve tekrarlayan enfeksiyonların yaklaşık %80’ini oluşturduğu tahmin edilmektedir6. Salgılanan EPS maddeleri ve daha yavaş metabolik aktivite7,8 nedeniyle, yerleşik biyofilmlerin implante edilmiş tıbbi cihazlar, skar dokuları ve kistik fibroz hastalarının akciğerleri gibi yüzeylerde oluştuklarında yok edilmesi daha zor hale gelir9,10 ve antimikrobiyal dirençlerine katkıda bulunur.

Bakteriyel biyofilmlerin inatçı büyüme özellikleri genellikle onları antimikrobiyal inhibisyona ve/veya eradikasyona karşı daha dirençli hale getirir2,9. Bu nedenle, bakteriyel biyofilm antimikrobiyal eradikasyonunu incelemek için in vitro yöntemlerin oluşturulması, tıbbi plastikler (örneğin, yerleşik kateterler) ve tıbbi implantlar üzerinde oluştuklarında enfeksiyonları ortadan kaldırmak için etkili bileşiklerin seçilmesi için çok önemlidir. En hızlı in vitro biyofilm antimikrobiyal eradikasyon kültürleme yöntemleri, biyofilm büyümesini, aynı büyüme ortamında kısa (24-96 saat) bir zaman diliminde biyofilm oluşumunun erken ila geç aşamalarında statik bakteri büyümesinin izlendiği “sürekli” kültürlerden ziyade “statik” bir biyofilm kültürü olarak inceler. Sürekli biyofilm yöntemleri, büyüme ortamının sürekli akışına ve daha az replikasyonla değiştirilmesine izin veren odalarda yetiştirilen daha uzun zaman dilimlerinde değerlendirilen biyofilm büyümesini gerektirdiğinden, hızlı analiz için hantaldır11. Sürekli biyofilmleri korumak ve oluşturmak için gereken zaman ve çaba nedeniyle, statik in vitro biyofilmler en popüler olanlardır, çünkü aynı anda test edilen kültür sayısını sınırlayan ayrıntılı akış odası sistemleri yerine, plastik 96 kuyucuklu mikrotiter plakalarda yüksek verimli antimikrobiyal duyarlılık testi testleri için kolayca uyarlanabilirler 12,13 . En basit statik “kuyu içi” biyofilm mikroplaka testleri, her bir kuyucuğun kenarlarında ve diplerinde biyofilm oluşumunu ölçmek için standart polistiren veya vinil (300 μL kapasiteli) mikrotitre plakaları kullanır ve genellikle havadaki halkalar ile sıvı yüzey arayüzü. Bakteriyel kuyu içi biyofilm oluşumu, büyüme ortamı sıvısı uzaklaştırıldıktan ve biyofilmler yıkandıktan sonra kuyucuklara yapışan biriken biyokütlenin boyanmasıyla ölçülür12,13. Bu analizler ekonomik olarak popülerdir, ancak biriken biyofilmler hücre geri kazanımı ve biyokütle boyama prosedürleri için durulama sırasında hasara veya kayba eğilimli olduklarından, doğal tasarımları nedeniyle genellikle tekrarlanabilirlik sorunları vardır11,14.

Biyofilm kayıplarını azaltmak için, standart ticari biyofilm cihazları, burada “standart biyofilm cihazı” olarak adlandırılan standart 96 kuyu içi plaka tasarımına yerleştirilebilir 96 kuyu içi sabitlenmiş polistiren kapak ekleyerek kuyu içi biyofilm mikroplaka tasarımlarında geliştirilmiştir. Sabitlenmiş bir kapağın eklenmesi, her bir mikroplaka kuyusundaki mevcut yüzey alanını genişleterek gelişmiş yüzey aderansı ve biyofilm biyokütle oluşumuna olanak tanır15,16. Standart biyofilm sabitlenmiş kapak cihazları, sabitlenmiş kapaklar ilaç veya büyüme durumu zorlukları içeren yeni mikrotitre plakalarına yerleştirildiğinde sonraki antimikrobiyal biyofilm duyarlılığı ve eradikasyon testi için daha fazla biyofilm geri kazanımı, çıkarılması ve durulanması sağlar. Kuyu içi biyofilm mikroplaka tekniklerine benzer şekilde, çıkarılmış ve yıkanmış sabitlenmiş kapak cihazlarından geri kazanılan malzemeler, tipik olarak kristal menekşe (CV) boya formülasyonlarını içeren hücre hayatta kalma testi ve biyofilm biyokütle boyama işlemine izin verir 17,18,19. Standart biyofilm cihazları, biyofilm antimikrobiyal duyarlılıklarının taranması için de idealdir. Bu analizler biyofilm büyüme inhibisyonunu iki şekilde izler: 1) Büyümenin başlangıcında hücrelere antimikrobiyaller eklendiğinde, minimum biyofilm inhibisyon konsantrasyonu (MBIC) değerini belirleyebilir. 2) 24 saat sonra mandallar üzerinde yerleşik biyofilmler oluştuğunda ve daha sonra antimikrobiyallere maruz bırakıldığında, minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonu (MBEC) değeri 17,20’yi belirleyebilir. Kuyudaki biyofilm mikroplaka cihazlarına benzer şekilde, standart biyofilm cihazları, cihaz başına yüksek maliyetleri, otoklavlanamaz olmaları ve kullanılan polistiren plaka malzemesi nedeniyle kimyasal çözücülere karşı daha az dayanıklı olmaları gibi bazı önemli sınırlamalara sahiptir. Standart biyofilm cihazları ayrıca her bir kuyucuktaki maksimum çalışma hacimlerini 200 μL ile sınırlayan düşük bir yüzey alanı / mandal oranına sahiptir. Bu faktörler, standart biyofilm cihazlarının, yüksek verimli bir formatta daha fazla miktarda biyofilm talep eden çalışmalar için kullanılmasını zorlaştırabilir.

Burada, standart plakadan daha derin kuyulara sahip 96 delikli mikrotitre plakalara takılan ticari olarak temin edilebilen polipropilen yarı etekli 0,5 mL 96 kuyucuklu PCR plakaları kullanılarak laboratuvarımızda geliştirilen statik bir biyofilm mandallı kapak 96 kuyucuklu yöntemi tarif ediyoruz (Malzeme Tablosu). Bu monte edilmiş cihazlar, biyofilm yetiştirmek için kullanıldığında maksimum 750 μL çalışma hacmine sahiptir (burada “derin kuyu biyofilm cihazı” olarak bilinir). Bu derin kuyu biyofilm cihazlarını kullanmanın avantajları, standart biyofilm cihazlarına kıyasla daha düşük maliyetleridir, otoklavlama ile sterilize edilebilirler ve daha büyük harici PCR plakası “tüp / mandallar” üzerinde biyofilm oluşumu için yüzey alanını arttırırlar. Bu yöntemle, bu cihazların Escherichia coli BW25113 ve P. aeruginosa PAO1 tarafından oluşturulan biyofilm biyokütlesinin yetiştirilmesi ve karakterize edilmesi için uygulamalarını gösteriyoruz. Biyofilm eradikasyon tahlilleri kullanılarak MBEC değerlerini belirleme yöntemleri, kuaterner amonyum bileşiği dezenfektan benzalkonyum klorür (BZK) ve sodyum hipoklorit (ağartıcı) antimikrobiyalleri kullanılarak tanımlanmıştır. Antiseptik / dezenfektan BZK, bu bileşik sıklıkla biyofilmleri kontamine yüzeylerden inhibe etmek için kullanıldığından seçilmiştir, ancak iyi kurulmuş biyofilmlerin yok edilmesinde daha az etkili olduğu bildirilmektedir21. Ağartıcı, yerleşik biyofilmlerin eradikasyonu için oldukça etkili bir kimyasaldır ve kimyasal dezenfeksiyonda bir dayanak noktasıdır 22. Her iki dezenfektan da her biyofilm cihazı için MBEC değerlerinin yararlı bir karşılaştırmasını sağlar21. Bu makalede, MBEC tayini için CV boyama ve biyofilm eradikasyon testleri kullanılarak bu biyofilm cihaz değerlendirmesi için bir protokol özetlenmiştir. Bu yöntemlerin iş akışına basitleştirilmiş bir genel bakış için bir protokol akış şeması eklenmiştir (Şekil 1).

Protocol

1. Biyofilm büyümesi için aseptik kültür hazırlığı (Gün 0-1) 0. Günde, kriyo-korunmuş bir stoktan (gliserol veya dimetilsülfoksit (DMSO)) test için istenen bakteri suşunu/suşlarını, suşun gerektirdiği şekilde antimikrobiyal seçimle doğrudan bir besin agar plakasına çizin. Agar plakalarını gerinim büyümesi için optimum sıcaklıkta (37 ° C) ve zamanda (18-22 saat) inkübe edin. Ertesi gün (1. Gün), optimum büyüme koşullarında 5 mL büyüme ortamında agar plakasından bir koloni aşılayın. Bu kültürler, biyofilm cihazları için 2. Gün başlangıç aşıları olarak kullanılacaktır (bkz. adım 2.2; Şekil 1).NOT: Bu çalışma için, E. coli K-12 BW21153 ve P. aeruginosa PAO1, Luria-Bertani (LB) ortamında 37 ° C’de 18 saat boyunca dakikada 160 devirde (rpm) sallanarak yetiştirildi. Sabitlenmiş kapak cihazlarında biyofilm biyokütle oluşumunun istatistiksel değişkenliği nedeniyle biyofilm ölçümü için biyolojik replikasyonlar üretmek üzere en az 3 bağımsız kültürlü suş hazırlayın. 2. Plakaların hazırlanması ve aşılanması (2. Gün) Otoklavlanmış 96 kuyulu, 1,1 mL/kuyu polipropilen plakanın dış kuyularını 750 μL/kuyu steril suyla doldurun (Şekil 2A). Negatif kontrol kuyularını (aşılanmamış ortam kuyuları; B sütunu) 750 μL büyüme ortamı ve kalan kuyucukları 675 μL büyüme ortamı ile doldurun.NOT: Yukarıdaki Adım 2.1 ve aşağıdaki adımlar, derin kuyu biyofilm cihazı için uygun hacimleri listeler. Standart biyofilm cihazı kullanılıyorsa, hacimler aşağıdaki gibi değiştirilmelidir: 75 μL inokülum kültürü 20 μL’ye; 180 μL’ye kadar 675 μL büyüme ortamı; 200 μL’ye kadar 750 μL steril su/büyüme ortamı; 800 μL CV boya/asetik asit/durulama çözeltileri 210 μL. Ek olarak, aşağıdaki adım 3.6 için, standart biyofilm cihazı mikroplakası kullanılırken karıştırıldıktan sonra 500nm’deki (A550 nm) Absorbans doğrudan polistiren mikroplakasında okunabilir. 1. Gün gece kültürlerini kullanarak, kültürleri 600 nm (OD600nm) = 1.0’da optik yoğunluğa veya 0.5-1 birimlik bir McFarland standardına standartlaştırın. Test tüplerinde standartlaştırılmış her kültürün 10 kat seri seyreltilmesini veya 10-3 seyreltmeye ulaşılana kadar 96 kuyu derinliğinde bir mikrotitre plakası oluşturun. Şekil 2B’de gösterildiği gibi kuyucuk içeren ortamı, 1 x 10-3 seyreltilmiş kültürün 75 μL’si ile aşılayın, böylece 10-4’lük son bir kuyu içi bakteri seyreltmesi için. Otoklavlanmış bir PCR plakasını (sabitlenmiş kapak) aşılanmış derin kuyucuk plakasına dikkatlice yerleştirin. Plakaları optimum gerinim koşullarında (37 °C) 24 saat boyunca% 50-60 neme sahip bir inkübatörde sallama (maksimum 160 rpm) ile inkübe edin. 3. CV boyama kullanan cihazlardan biyofilm biyokütle tayini (3. Gün) Biyofilm sabitlenmiş kapağı her cihazdan aseptik olarak çıkarın ve planktonik hücreleri çıkarmak için 800 μL steril fosfat tamponlu salin (PBS) / kuyucuk ile hazırlanmış otoklavlanmış derin bir kuyucuk plakasına yerleştirerek durulayın. Biyokütle CV boyama için, sabitlenmiş PCR plaka kapağını dH2O’da 800 μL/kuyucuk %0,1 (w/v) CV ile hazırlanmış yeni bir plakaya aktarın ve 5 dakika boyunca boyayın. Sabitlenmiş kapağı 800 μL/kuyucuklu PBS ile hazırlanmış derin bir kuyucuk plakasında durulayarak fazla lekeyi temizleyin. Plakaların, mandalları yukarı bakacak şekilde bir biyogüvenlik dolabında 10 dakika kurumasını bekleyin. Kurutulmuş PCR plaka kapağını 800 μL/kuyucuk (v/v) asetik asit içeren bir plakaya aktarın ve kapağın 5 dakika boyunca lekesini sökmesini sağlayın. Destained PCR mandal kapağını çıkarın ve pipetleme ile çözeltiyi iyice karıştırın. Derin kuyucuk plakalarından standart 96 kuyucuklu mikro plakaya 200 μL aktarın ve bir ultraviyole (UV) / görünür (Vis) aralıklı mikroplaka okuyucuda 550 nm (A550nm) dalga boyunda leke giderme çözeltisinin emilimini ölçün. Ölçülen A550nm değerlerini kullanarak, her bir biyofilm numune değerinden ortalama boş (negatif kontrol) A550nm değerini çıkarın. Ortalama her boş çıkarılmış A550nm biyofilm numune değeri, numune biyolojik kopyalarını temsil eder. 4. 24 saat antimikrobiyal MBEC değerlerini hesaplamak için antimikrobiyallere sahip biyofilmlere meydan okumak (3. Gün) Suda, test edilmek üzere istenen en yüksek antimikrobiyal konsantrasyonun iki katı (2x) olan bir antimikrobiyal stok çözeltisi hazırlayın. 8 antimikrobiyal konsantrasyon olması için 2x konsantre büyüme ortamında antimikrobiyal stok çözeltisinin iki katlı seyreltme serisini oluşturun. Şekil 2B’de gösterildiği gibi, otoklavlanmış derin kuyu plakasının dış kuyularını 750 μL/kuyucuk steril su ile doldurun. Plakanın B (negatif kontrol; bakteri yok) ve C (pozitif kontrol; antimikrobiyal maruziyet yok) sütunlarını 750 μL/kuyu büyüme ortamı ile doldurun. Kalan kuyucukları, Şekil 2B’de gösterildiği gibi antimikrobiyal seyreltme serisinin 750 μL/kuyucuğu ile doldurun. Sabitlenmiş kapağı adım 3.1’de açıklandığı gibi çıkarın ve durulayın ve bunları antimikrobiyal meydan okuma plakasına aktarın. Plakaları uygun gerinim koşullarında ve istenen pozlama zaman dilimi için sallantılı (maksimum 160 rpm) inkübe edin. 5. Sabitlenmiş kapaklardan biyofilm biyokütlesinin geri kazanımı (Gün 4) Antimikrobiyal açıkta kalan sabitlenmiş kapakları çıkarın ve adım 3.1’de açıklandığı gibi durulayın. Sabitlenmiş kapağı, iç kuyularda 750 μL/kuyu geri kazanım ortamı ve dış kuyularda 750 μL/kuyu steril dH2O bulunan derin bir kuyu plakasına aktarın. 70 mL geri kazanım ortamı hazırlamak için, 35 mL 2x konsantre LB, 0,7 mL% 100 ara-20, 3,5 mL 20x üniversal nötralize edici çözelti ve 30,8 mL steril dH2O’yu steril bir şişede birleştirin. 20x konsantre üniversal nötralize edici çözelti hazırlamak için, 20 mL’lik son bir dH2O hacmine 1.0 g L-histidin, 1.0 g L-sistein ve 2.0 g indirgenmiş glutatyon ekleyin. Cihazı adım 5.1’den sonikasyon su banyosunun içine yerleştirilmiş ikincil bir kutuya koyun. Biyofilmi mandallardan kurtarma ortamına çıkarmak için cihazları 30 dakika boyunca sonikleştirin. Sonikasyondan sonra, sabitlenmiş kapağı çıkarın ve derin kuyu kurtarma medya plakasına steril bir düz plaka kapağı yerleştirin. Sabitlenmiş kapak atılabilir. Plakaları 5.3. adımdan itibaren geri kazanım medyası ile gece boyunca (16-18 saat) optimum gerinim büyüme koşullarında inkübe edin. 6. Cihaz MBEC değerlerinin belirlenmesi (Gün 5) Ertesi gün, inkübe edilmiş derin kuyu plakasının her bir kuyucuğundan 5.4. adımdan yeni bir 96 kuyucuklu mikrotitre plakasına 200 μL aktarın. Bir UV / Vis serisi mikroplaka okuyucu kullanarak her bir kuyucuğun OD600nm’sini okuyun. Negatif kontrol (aşılanmamış boş) OD600nm değerlerini numune kuyusu içeren her biyofilmden çıkarın. MBEC değerinin, belirli bir antimikrobiyal işlenmiş tür/suş numunesi için en düşük OD600nm değeri (aşılanmamış kontrolden ayırt edilemez) ile sonuçlanan en düşük antimikrobiyal konsantrasyon olduğu OD600nm değerlerini kullanarak her numune için MBEC değerini hesaplayın.

Representative Results

Bu çalışmanın amacı, derin kuyu biyofilm cihazları kullanılarak daha büyük hacimli, yüksek verimli (96 kuyulu), statik biyofilm cihaz ölçümlerinin yapılması için bir yöntem sağlamaktır. Burada, derin kuyu cihazı olarak bilinen derin kuyu mikroplakasına yerleştirilmiş, kendinden montajlı yarı etekli bir PCR plakasını, statik biyofilmler oluşturma yeteneklerini incelemek için yaygın olarak kullanılan standart bir biyofilm sabitlenmiş kapak cihazıyla karşılaştırdık. Her iki cihaz tarafından biyofilm oluşumunu değerlendirmek için CV boyalı biyokütle ve biyofilm eradikasyon testleri (MBEC) kullanılmıştır. Her cihazdaki farklı türlere göre biyofilm oluşumunu karşılaştırmak için, biyofilm CV boyama protokolünü17 kullanarak E. coli BW25113 ve P. aeruginosa PAO1 tarafından oluşturulan biyofilm biyokütlelerini değerlendirdik. CV boyama genellikle A550nm değerleri olarak bildirilse de, her cihazın büyüme hacimlerindeki farklılıklar ve mevcut yüzey alanları nedeniyle CV boyası A550nm değerlerini çözelti içindeki molar CV konsantrasyonlarına dönüştürdük. Molar CV konsantrasyonları, her bir cihazın hacim farklılıklarını hesaba kattı ve her cihazdan geri kazanılan biyokütleleri temsil eden CV konsantrasyonlarının karşılaştırılmasına izin verdi. Sonuçlar, her iki türün de derin kuyu biyofilm cihazlarında (2.1 kat E. coli; 4.1 kat P. aeruginosa) standart biyofilm cihazına kıyasla önemli ölçüde daha fazla biyokütle ürettiğini göstermiştir (Şekil 3A-B). Bu sonuç, standart cihaz mandalı yüzey alanına (108.9 mm2) kıyasla derin kuyu PCR mandalının (320.4 mm2) daha geniş yüzey alanı göz önüne alındığında bekleniyordu. Bu bulgu aynı zamanda, standart cihaz kuyularına (200 μL) kıyasla derin kuyu biyofilm cihazında kullanılan artan hacimlerin (750 μL) artmasıyla da tutarlıdır. Bu nedenle, derin kuyu cihazları, standart biyofilm cihazlarına sahip daha küçük mandallara kıyasla PCR tüp mandallarında biyofilm biyokütle birikimini arttırmıştır. Her iki biyofilm cihazı da E. coli ve P. aeruginosa tarafından oluşturulan biyolojik olarak çoğaltılmış biyofilmleri karşılaştırdığımızda tekrarlanabilir biyofilmler oluşturdu (Şekil 3A-B). Derin kuyu cihazında yetiştirilen her iki suş için teknik replikasyon CV lekeli M A550nm değerlerinde daha fazla değişkenlik gözlemlememize rağmen, her bir türün derin kuyudaki biyolojik replikasyonları veya standart cihazlar için medyan CV M değerlerini, çift yönlü iki yönlü varyans analizi (ANOVA) veya Öğrenci T-testleri (her ikisi de p > 0,05). Bu bulgu, derin kuyu ve standart cihazlarla biyofilm oluşumunun tekrarlanabilir biyofilmler oluşturduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, CV boyama sonuçları, her bir cihazdaki mandal yüzey alanı farklılıklarını hesaba kattığımızda, E. coli ve P. aeruginosa tarafından biyofilm biyokütle oluşumunun biyokütle birikiminde istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gösterdiğini göstermiştir (Tablo 1). E. coli için mm2 (CV M/mm2) cinsinden mandal yüzey alanı başına ortalama CV boyalı biyokütlenin (M) hesaplanması, standart biyofilm cihazına kıyasla polipropilen derin kuyu cihazlarında biyofilm oluşumunun 1,5 kat daha düşük olduğunu göstermiştir (Tablo 1). Bununla birlikte, standart biyofilm cihazlarına kıyasla polipropilen derin kuyu cihazlarında 1.4 kat daha yüksek CV M / mm2 gösteren P. aeruginosa için tam tersi bir sonuç elde edilmiştir (Tablo 1). Her cihazla biyofilm biyokütle birikiminde gözlemlenen türe özgü farklılıklara rağmen, derin kuyu cihazı hala her bir tür tarafından daha fazla genel (2-4 kat artış) biyofilm biyokütle oluşumu göstermiştir (Şekil 3). Derin kuyu biyofilm cihazının antimikrobiyal duyarlılık testi uygulamalarını belirlemek için, biyofilm yok etme potansiyelleri için yaygın olarak kullanılan iki dezenfektanı, BZK ve ağartıcıyı karşılaştırdık. Her iki kimyasal da klinik ve endüstriyel uygulamalarda bakteriyel biyofilmleri önlemek (BZK) ve/veya eradike etmek (ağartıcı) için yaygın olarak kullanılmaktadır21,22,23. Her bileşik, standart ve derin kuyu biyofilm cihazlarında E. coli ve P. aeruginosa tarafından oluşturulan biyofilmlere 2 kat konsantrasyonların arttırılmasıyla eklenmiştir22,23 (Şekil 1, 2B). Negatif kontrol kuyularından ayırt edilemeyen OD600nm değerleriyle sonuçlanan en düşük BZK veya ağartıcı konsantrasyonu MBEC değeri olarak tanımlanmıştır. Standart biyofilm cihazlarında oluşan biyofilmlerin ağartıcı ile muamele edilmesi, E. coli ve P. aeruginosa için %0.625’lik aynı ağartıcı MBEC değerleriyle sonuçlanmıştır (Tablo 1, Şekil 4A-B). Derin kuyu cihazlarında oluşan E. coli ve P. aeruginosa biyofilmi için belirlenen ağartıcı MBEC değerleri her iki tür tarafından da 2-4 kat daha düşük MBEC değerleri göstermiştir (E. coli; %0.156; P. aeruginosa standart cihazlarla karşılaştırıldığında %0.313 (Tablo 1). P. aeruginosa’nın E. coli’ye kıyasla biyofilmleri yok etmek için 2 kat daha yüksek bir ağartıcı konsantrasyonuna ihtiyaç duyduğu derin kuyu cihazı için türler arasındaki ağartıcı MBEC değerlerinde 2 kat daha fazla fark kaydedildi (Şekil 4A-B, Tablo 1). Derin kuyu cihazında P. aeruginosa ve E. coli arasındaki 2 katlı ağartıcı MBEC farkı, E. coli’ye kıyasla P. aeruginosa tarafından 1.5 kat artmış CV boyalı biyokütle oluşumu ile ters orantılı görünmektedir (Şekil 3A-B). P. aeruginosa’nın derin kuyu cihazı mandalları üzerinde oluşturduğu daha büyük miktarda biyokütle, derin kuyucuklardaki E. coli ile karşılaştırıldığında P. aeruginosa biyofilmlerini yok etmek için neden daha yüksek bir ağartıcı konsantrasyonunun gerekli olduğunu da açıklayabilir (Şekil 3A-B, Tablo 1). Bu nedenle, derin kuyu cihazı biyofilm eradikasyon testleri, her iki türün de ağartıcıya duyarlı olduğunu, ancak standart cihazlara kıyasla daha düşük (2-4 kat) ağartıcı konsantrasyonlarında olduğunu göstermektedir. Bu, 3 kat daha büyük mandal yüzey alanı ve derin kuyu cihazı PCR plaka mandallarının hacimleri ile ters orantılıdır. Bu, ağartıcı maruziyeti için, daha büyük biyokütle yüzey alanının, biyofilm eradikasyonu için gerekli ağartıcı konsantrasyonlarını azaltabileceğini düşündürmektedir. BZK biyofilm eradikasyon testi, ağartıcı sonuçlarına kıyasla her bir türün geri kazanılmış büyümesinde (OD600nm değerleri) ve MBEC değerlerinde daha fazla değişkenlik göstermiştir (Şekil 4C-D). Bu değişkenlik, BZK’nın biyofilm oluşumunu önlemede köklü biyofilmleri yok etmekten daha etkili olduğunu gösteren önceki çalışmalara dayanarak beklenmedik bir durum değildir24,25,26. Standart biyofilm cihazını kullanarak, sadece BZK ile muamele edilen P. aeruginosa biyofilmleri, derin kuyu cihazında bu suş için elde edilen MBEC değerinden (20480 μg / mL) 8 kat daha düşük olan tutarlı bir MBEC değeri (2560 μg / mL) göstermiştir (Tablo 1, Şekil 4C). Bu sonuçlar, standart cihaz mandallarına kıyasla derin iyi sabitlenmiş yüzeylerde ve plastik bileşimlerde oluşan P. aeruginosa biyokütlesi miktarlarındaki farklılıkları yansıtabilir. Hem derin kuyu hem de standart cihazlarda E. coli tarafından oluşturulan biyofilmlerin BZK eradikasyonu eşit derecede zayıftı, bu da derin kuyu cihazı için 2560-40960 μg / mL ve standart cihazda 320-10240 μg / mL’den geniş bir BZK MBEC değerleri yelpazesine neden oldu (Şekil 4D). E. coli için bu değişkenlik, 1-2 replika kuyusunun geri kazanım ortamlarında düşük ancak istatistiksel olarak anlamlı bir büyüme gösterdiği, hatanın arttığı ve her iki cihazla da BZK MBEC belirleme doğruluğunu azalttığı ara sıra örnekle açıklandı (Şekil 4D, Tablo 1). Bu değişkenlik, daha önce çalışmalarda belirtildiği gibi E. coli biyofilmlerinin yok edilmesinde BZK kullanımının etkisizliğini vurgulamaktadır24,25,26. Buna karşılık, P. aeruginosa biyofilmleri, BZK tarafından her iki cihazla da tanımlanmış bir konsantrasyonda, ancak 8 kat BZK konsantrasyon farkı ile güvenilir bir şekilde elimine edilebilir (Şekil 4C). Özetle, P. aeruginosa tarafından oluşturulan biyofilmlerin BZK eradikasyon MBEC değerleri, her cihazla farklı MBEC değerleri göstermektedir, ancak her iki cihaz da E. coli hassas BZK eradikasyon fenotiplerini ayırt etmede eşit derecede zayıftır. Bu nedenle, burada açıklanan derin kuyu biyofilm cihazı yöntemi, standart bir biyofilm cihazına kıyasla tekrarlanabilir biyofilmler oluşturmak için benzer şekilde etkilidir. Şekil 1. Deneye şematik genel bakış. 0. Gün Tek kolonilerin kriyokorunmuş stoktan izolasyonu; 1. Gün Büyüme ortamının tek kolonilerle aşılanması; 2. Gün biyofilm plakasının aşılanması; 3. Gün CV boyama veya antimikrobiyal meydan okuma; 4. Gün kurtarma ortamına biyofilm sonikasyonu; ve 5. Gün, MBEC değerlerini belirlemek için OD600nm kurtarma plakasını okur. Servier Medical Art (smart.servier.com) tarafından sağlanan figürdeki bazı görüntüler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2. Protokolün çeşitli adımları için gösterilen örnek plaka düzenleri. A) Her biri üç biyolojik kopyaya sahip iki bakteri suşundan (E. coli ve P. aeruginosa) 1. Gün bakteri kültürleri kullanılarak ilk 24 saatlik biyofilm büyümesi için son plaka kurulumu. Negatif kontrol kuyuları (gri) sterilite kontrolleri olarak kullanılır (bakteri eklenmez). B) Biyofilmlerin antimikrobiyal mücadelesi için plaka kurulumu. Koyulaşan renkler antimikrobiyal konsantrasyonun arttığını gösterir. Negatif kontrol, bakteri eklenmemiş kuyulardır (Gri) ve pozitif kontroller, antimikrobiyal maruziyeti olmayan biyofilmlerdir (turuncu). A panelinden alınan biyofilm mandal kapakları, antimikrobiyal maruziyet için bu derin kuyu plakasına aktarılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3. CV boyalı E. coli BW25113’ün molar konsantrasyonu (M). (A) ve P. aeruginosa PAO1 (B) biyofilm biyokütlesi standart (daireler) ve derin kuyu (üçgenler) cihazlarından elde edilmiştir. CV boyama, CV’nin 550 nm’de (A550nm) absorbansı okunarak ölçüldü ve derin kuyu A550nm okumaları, cihazlar arasındaki hacim farklılıklarını hesaba katmak için 3.809 (800 μL / 210 μL) faktörü ile ayarlandı. CV molar konsantrasyonu (M), Beer-Lambert yasası ile belirlendi (CV Konsantrasyonu = A550nm / εl); 96 kuyu düz tabanlı mikrotitre plakasındaki 210 μL’lik yol uzunluğunun (l) 0.56 cm ve CV’nin sönme katsayısının (ε) A550nm’de 251500 cm-1M-139 olduğu belirlenmiştir. Sonuçlar, biyofilm olarak yetiştirilen her suşun üç biyolojik replikasyonundan 9 teknik replikamı temsil eder ve her biyolojik replikatın medyan değeri her grafikte yatay bir çubuk olarak gösterilir. Cihazlar arasındaki biyokütlede istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar, iki kuyruklu eşleştirilmiş t-testi kullanılarak biyolojik replika medyan değerleri arasında belirlendi (E. coli p= 0.008-0.018 (*); P. aeruginosa p= 0.002-0.009 (**)) yıldız işaretli çubuklar olarak gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.  Şekil 4. Antimikrobiyal MBEC konsantrasyonunun belirlenmesi. Standart (beyaz çubuklar) ve derin kuyu (gri çubuklar) biyofilm sabitlenmiş cihazlarda yetiştirildiğinde P. aeruginosa PAO1 (A, C) ve E. coli BW25113 (B,D) için ağartıcı (A,B) ve BZK (C,D) için antimikrobiyal MBEC konsantrasyonunun belirlenmesi. Sonuçlar, sonikasyondan sonra geri kazanım ortamına ve gece boyunca inkübasyona geri kazanılan OD600nm biyofilmin okunmasıyla belirlendi. Derin kuyu OD600nm, cihazlar arasındaki hacim farklılıklarını hesaba katmak için 3.75 (750 μL / 210 μL) faktörü ile ayarlandı. Sonuçlar üç biyolojik replikamı temsil eder ve hata çubukları her antimikrobiyal konsantrasyonda replikalar arasındaki standart sapmayı gösterir39. Her çubuk grafiğin üzerindeki yıldız işaretleri (*) OD600nm değerlerinde, iki kuyruklu Öğrenci T testi hesaplamaları kullanılarak p değerleri 0,05′< olan boş kontrollerden istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları gösterir. Her çubuk grafiğin üzerindeki daire sembolleri (o), yalnızca 1 veya 2 kopyanın boş kontrollerden istatistiksel olarak anlamlı OD600nm değerlerine sahip olduğu ölçümleri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. BZK MBEC (μg/mL) Ağartıcı MBEC (% v/v) Gerinim testi yapılmıştır Derin kuyu Cihazı Standart Cihaz Derin kuyu Cihazı Standart Cihaz E. coli BW25113 2560-40960 320-10240 0.156 0.625 P. aeruginosa PAO1 20480 2560 0.313 0.625 Derin kuyu Cihazı Standart Cihaz p-değeri** Katlama değişimi (Derin kuyu / Standart) Gerinim testi yapılmıştır Ortalama CV M*/ mm2 ± SD Ortalama CV M*/ mm2 ± SD E. coli BW25113 1,99 x 10-8 ± 3,25 x 10-9 3,03 x 10-8 ± 3,31 x 10-9 0.0176 -1.52 P. aeruginosa PAO1 8,01 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 5,72 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 0.034 1.4 Tablo 1. E. coli BW25113 ve P. aeruginosa PAO1’in bir özeti, çeşitli cihazlarda BZK ve ağartıcı için CV boyalı biyokütle M / mm2 değerleri ve biyofilm eradikasyon MBEC değerleri anlamına gelir.*Ortalama CV M/mm2 değerleri medyan biyolojik replikasyon CV M değerleri kullanılarak hesaplanmıştır (Şekil 3).**p-değerleri İki kuyruklu Öğrencinin T-testi kullanılarak belirlenir.

Discussion

Bu çalışmada, biyofilm oluşumu için yarı etekli bir PCR plaka kapağı ile donatılmış bir polipropilen derin kuyu mikroplakası içeren daha büyük hacimli 96 kuyucuklu yüksek verimli statik biyofilm büyüme cihazının kullanılması yöntemleri açıklanmaktadır (derin kuyu biyofilm cihazı; Malzeme Tablosu). Bu cihazla üretilen biyofilmleri, ticari olarak temin edilebilen polistiren standart bir biyofilm cihazıyla karşılaştırdık (Malzeme Tablosu). Derin kuyu cihazı yöntemi, derin kuyu cihazları için modifiye edilmiş ayarlanmış hacimlerde standart cihazla17 aynı metodolojik adımları ve çözümleri kullanır ve bu da bu cihazı büyük ölçekli biyofilm oluşumu ve deneysel analiz için ideal kılar. Biyofilm oluşturduğu bilinen iki Gram-negatif tür olan E. coli BW25113 ve P. aeruginosa PAO1’in büyümesi, her iki cihazda da biyokütle oluşumu ve dezenfektan (BZK / ağartıcı) MBEC değerleri açısından incelenmiştir. Her cihazdan mandallar üzerinde oluşan CV boyalı biyokütlenin karşılaştırılması, standart cihaza kıyasla hem E. coli hem de P. aeruginosa’nın derin kuyu biyofilm cihazında daha yüksek biyokütleye sahip biyofilmler oluşturduğunu göstermiştir (Şekil 3A-B). Artan biyofilm biyokütlesi, standart cihaz mandal yüzey alanına kıyasla derin kuyu mandallarının daha geniş yüzey alanını yansıtıyordu. Her iki cihazla mandal yüzey alanlarındaki (mm2) farklılıkları açıkladığımızda, biyokütle oluşumundaki farklılıklar kaydedildi, burada E. coli, polistiren standart cihaz mandallarında mm2 başına derin kuyu cihazının PCR tüp mandallarından önemli ölçüde daha fazla CV biyokütlesi oluşturdu (Tablo 1). P. aeruginosa, standart cihazlara kıyasla daha fazla CV boyalı biyokütle / peg mm2 oluşturmuştur (Tablo 1). Bu bulgular, farklı cihazlarda biyofilm biyokütle oluşumunda türe özgü farklılıkları vurgulayabilir.

E. coli ve P. aeruginosa biyofilmlerinin derin kuyu cihazlarında ağartıcı eradikasyonunun, standart cihazdan 2-4 kat daha düşük konsantrasyonlarda gerçekleştiği belirtilmelidir (Şekil 4A-B, Tablo 1). Her cihazdan tanımlanan ağartıcı MBEC değerlerindeki farklılıklar muhtemelen cihaz mandal şekillerindeki farklılıklardan (derin kuyu “mandalları” konik tüplerdir ve standart mandallar silindiriktir), plastik bileşim farklılıklarından (polipropilene karşı polistiren) ve hacim farklılıklarından (750 μL’ye karşı 200 μL) etkilenir. Örneğin, P. aeruginosa, standart cihazlara kıyasla derin kuyu cihaz mandallarında daha fazla CV M biyokütlesi / mm2’ye sahipti, ancak E. coli’nin derin kuyu mandallarında daha az biyokütlesi vardı (Şekil 3). Bu, biyofilm eradikasyonu için gerekli dezenfektan konsantrasyonlarının, her bir türün oluşturduğu biyokütleden ve mevcut yüzey alanından etkilenebileceğini düşündürmektedir. Ek olarak, cihaz mandal şeklindeki farklılıklar, belirli türler için çeşitli büyüme koşullarını etkileyebilir. Çalışmamızda, P. aeruginosa, daha büyük yüzey alanları ve havalandırmaları nedeniyle derin kuyu mandalları üzerinde daha fazla biyokütle oluşturabilir, çünkü bu tür, fakültatif bir anaerob olan E. coli’nin aksine zorunlu bir aerobdur. Bugüne kadar, hem polipropilenin27,28,29 hem de polistiren30,31 materyalleri üzerinde E. coli ve P. aeruginosa biyofilm oluşumunu doğrudan karşılaştıran yayınlanmış herhangi bir çalışma tespit etmedik. Bununla birlikte, sağlam E. coli ve P. aeruginosa biyofilm oluşumu raporları, polipropilen veya polistiren materyalleri inceleyen bağımsız çalışmalarda kaydedilmiştir. Pseudomonad’larla ilgili olarak, birçok Pseudomonas spp. potansiyel karbon kaynağı olarak polipropilen gibi plastikleri kullanabilir32. Bu nedenle, bu polipropilen derin kuyu biyofilm cihazının mevcudiyeti, statik biyofilm çalışmalarında yararlı bir ilerlemedir. Polipropilen, polistirenden kimyasal olarak daha dayanıklıdır ve fıtık veya pelvik ameliyatlar için tıbbi implantlarda, dikişlerde ve ağlarda sıklıkla kullanıldığı için klinik olarak ilgili bir malzemedir33,34.

Biyofilm biyokütlesi her iki cihaz tarafından da oluşturulmuş olmasına rağmen, derin kuyu cihazı, CV boyama yöntemine ve ağartıcı ve BZK için OD600nm biyofilm eradikasyonu MBEC değerlerine dayanarak biyokütlede biraz daha yüksek değişkenliğe sahipti. Bu, 3 ana faktörle açıklanabilir: 1) Derin kuyu cihazları, standart cihaz mandallarına kıyasla açılı olan standart cihazlardan daha büyük mandal yüzey alanına sahiptir. 2) Test edilen her iki tür, her bir cihazın polipropilen ve polistiren malzemelerine yapışmak için farklı yeteneklere sahip olabilir. 3) Her cihazda kullanılan büyüme ortamının hacimleri (750 μL derin kuyu, 200 μL standart) ve yerleştirilen mandal ile kuyu yan duvarları arasındaki boşluk farklıdır. Tüm biyofilm deneyleri için yalnızca bir tür cihaz kullanılıyorsa bu sorunlar sorun değildir, ancak her iki cihaz da seçilirse, farklılıkları belirlemek için burada yaptığımız karşılaştırmalar yapılmalıdır36,37. Her cihazda kullanılan plastik malzeme farklılıklarından dolayı, CV boyalı biyofilm biyokütlesi ve MBEC değerleri farklı cihazlar arasında doğrudan karşılaştırılmamalıdır. Bununla birlikte, yöntemler ve deneyler aynı cihazda (derin kuyu veya standart) gerçekleştirilirse, test edilen türler ve antimikrobiyaller için elde edilen sonuçlar karşılaştırılabilir.

Bu protokol, kendinden montajlı derin kuyu PCR plakalı cihazların, biyofilm oluşumunu ve eradikasyonunu ölçmek için daha büyük hacimli biyofilm cihazı olduğunu ve bunun da uygun maliyetli olduğunu göstermektedir. Maliyet açısından bakıldığında, 96 iyi sabitlenmiş kapaklı standart biyofilm cihazları, cihaz başına 29-36 ABD Doları (USD) perakende satış aralığındadır (Malzeme Tablosu). Polistiren standart biyofilm cihazları otoklavlanabilir değildir ve plastik kimyasal özellikleri nedeniyle çözücülere/asitlere karşı daha az toleranslıdır. Burada tarif edilen, ayrı bir yarı etekli 96 kuyu PCR plakası (Malzeme Tablosu) ile donatılmış, kendinden montajlı polipropilen derin kuyu plakaları, standart biyofilm cihaz maliyetinin yarısı olan monte edilmiş cihaz başına toplam 14 ABD Doları’na mal olmaktadır. Fiyatların bölgeye, distribütöre ve müsaitlik durumuna bağlı olarak değişebileceği ve kurumsal indirimlerden sonraki maliyetlerimizin 9 ABD Doları / derin kuyu cihazına ulaştığı unutulmamalıdır. Bu kendinden montajlı derin kuyu polipropilen PCR plakalı cihazlar, sterilizasyon için otoklavlanabilir olma avantajına sahiptir ve standart cihazlardan 2-4 kat daha fazla biyofilm biyokütlesi sunar.

Sonuç olarak, bu protokol ve derin kuyu ve standart biyofilm cihazlarının biyofilm büyüme karşılaştırmalarından elde edilen temsili bulgular, her iki cihazın da bakteriyel biyofilm yetiştirebildiğini, ancak derin kuyu cihazlarının 2-4 kat daha fazla biyofilm oluşturduğunu göstermektedir. Derin kuyu biyofilm cihazı, ilaç duyarlılığı tarama çalışmaları gibi daha büyük hacimli yüksek verimli biyofilm oluşum deneyleri için uygun ve uygun fiyatlı bir alternatif sunar. Bu teknik, analizler için daha büyük miktarlarda biyofilm materyali gerektirebilecek aşağı akış ‘-omik’ ekstraksiyonları (proteomik, metabolomik, transkriptomik) veya deneysel testler (enzimatik, floresan) için yararlı biyofilmler üretebilir. Derin kuyu biyofilm cihazı, klinik olarak alakalı daha düşük maliyetli, daha büyük hacimli, kimyasal olarak dayanıklı plastik malzemeler kullanarak biyofilmleri yüksek verimli 96 kuyulu bir tahlilde incelemek isteyen laboratuvarlar için önerilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmanın finansmanı, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Keşif Hibesi’nden (RGPIN- 2016-05891) DCB’ye ve Kanada Hükümeti Genomik Araştırma ve Geliştirme Girişimi Hibe (GRDI) programından (GRDI7 2254557) MRM ve GRG’ye işletme hibeleri ile sağlanmıştır.

Materials

10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) Fisher Scientific 13-678-11F disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS Fisher Scientific 13-678-11C disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack Fisher Scientific 14-222-766 sterile pipettor tips for media aliquoting
Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C Fisher Scientific P-DW-11-C microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips Fisher Scientific TF-350-L-R-S sterile pipettor tips for media aliquoting
Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 Avantor/ VWR 89094-676 sterile basins/ reservoirs for microplate preparation
BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g Fisher Scientific DF0145-17-0 materials for LB agar preparation
Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader Biotek NEO2MB microplate UV/Vis region plate reader
Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V Avantor/ VWR CPX-952-316R sonicating water bath
crystal violet (CV), ACS grade, 100 g Fisher Scientific C581-100 biofilm biomass stain
Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH Avantor/ VWR CABDH1115-1LP media components for cryopreservation
Easypet 3, pipet controller Avantor/ VWR CA11027-980 serological pipettor for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL Avantor/ VWR CA89125-338 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL Avantor/ VWR CA89125-340 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade Fisher Scientific A38-212 CV destain
Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX Fisher Scientific 14957H/ 9820-18 materials for cell culturing
Glycerol, 4 L glass bottle ACS Fisher Scientific BP229-4 media components for cryopreservation
L-Cysteine, 98%, 250 g Avantor/ VWR 97061-204 universal neutralizing solution
L-glutathione reduced, 98%, 25 g Fisher Scientific AAJ6216614 universal neutralizing solution
L-Hisitidine, 98%, 100 g Avantor/ VWR CA97062-598 universal neutralizing solution
MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS Innovotech 19112 material for 96 well MBEC device biofilm cultivation
McFarland Standard, 0.5 EA Fisher Scientific R20410 cell culture standardization
McFarland Standard, 1.0 EA Fisher Scientific R20411 cell culture standardization
NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS Fisher Scientific 167008 microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements
PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK Sarstedt 72.1981.202 pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 Fisher Scientific FB0875712 materials for LB agar preparation
Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g Fisher Scientific P288-500 PBS component/ buffer
Sodium chloride, ACS grade, 3 kg Fisher Scientific S2713 media components for LB broth and PBS
sodium phosphate monobasic, 1 kg Fisher Scientific S369-1 PBS component/ buffer
Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 Avantor/ VWR 28145-505 non-autoclavable solution sterilization
Tin foil, heavy duty, 50 feet Grocery store — materials for deepwell device sterilization
Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA Fisher Scientific B11922 media components for LB broth
Tween-20, 100 mL Fisher Scientific BP337-100 recovery media solution
Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS Avantor/ VWR 37001-520 materials for biofilm dilution preparation
Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g Fisher Scientific BP1422-500 media components for LB broth
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verderosa, A. D., Totsika, M., Fairfull-Smith, K. E. Bacterial Biofilm Eradication Agents: A Current Review. Frontiers in Chemistry. 7, 1-17 (2019).
  2. Sharma, D., Misba, L., Khan, A. U. Antibiotics versus biofilm: An emerging battleground in microbial communities. Antimicrobial Resistance and Infection Control. 8 (1), 1-10 (2019).
  3. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  4. Lagacé-Wiens, P. R. S., et al. Trends in antimicrobial resistance over 10 years among key bacterial pathogens from Canadian hospitals: results of the CANWARD study 2007-16. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74, 22-31 (2019).
  5. Karlowsky, J. A., et al. In vitro susceptibility of urinary Escherichia coli isolates to first- and second-line empirically prescribed oral antimicrobials: CANWARD surveillance study results for Canadian outpatients, 2007-2016. International Journal of Antimicrobial Agents. 54 (1), 62-68 (2019).
  6. Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiology. 7 (9), 1061-1072 (2012).
  7. Amato, S. M., et al. The role of metabolism in bacterial persistence. Frontiers in Microbiology. 5, 1-9 (2014).
  8. Flemming, H. -. C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS matrix: The "house of biofilm cells.&#34. Journal of Bacteriology. 189 (22), 7945-7947 (2007).
  9. Dela Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., Hancock, R. E. W. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: Antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 580-589 (2013).
  10. Høiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. International Journal of Oral Science. 3 (2), 55-65 (2011).
  11. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. 01, (2005).
  12. Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Methods in Molecular Biology. 1149, 631-641 (2014).
  13. O’Toole, G. A. Microtiter dish Biofilm formation assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2437 (2010).
  14. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  15. Harrison, J. J., Turner, R. J., Ceri, H. High-throughput metal susceptibility testing of microbial biofilms. BMC Microbiology. 5 (53), (2005).
  16. Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: Multiple Equivalent Bioffims for Antibiotic and Biocide Susceptibility Testing. Methods in Enzymology. 337, 377-385 (2001).
  17. Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nature Protocols. 5 (7), 1236-1254 (2010).
  18. vanden Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. Journal of Microbiological Methods. 98, (2014).
  19. Sabaeifard, P., Abdi-Ali, A., Gamazo, C., Irache, J. M., Soudi, M. R. Improved effect of amikacin-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles against planktonic and biofilm cells of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Medical Microbiology. 66 (2), 137-148 (2017).
  20. Thieme, L., et al. MBEC Versus MBIC: the Lack of Differentiation between Biofilm Reducing and Inhibitory Effects as a Current Problem in Biofilm Methodology. Biological Procedures Online. 21 (1), 18 (2019).
  21. Jennings, M. C., Ator, L. E., Paniak, T. J., Minbiole, K. P. C., Wuest, W. M. Biofilm-eradicating properties of quaternary ammonium amphiphiles: Simple mimics of antimicrobial peptides. Chembiochem. 15 (15), 2211-2215 (2014).
  22. Lineback, C. B., et al. Hydrogen peroxide and sodium hypochlorite disinfectants are more effective against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms than quaternary ammonium compounds. Antimicrobial Resistance & Infection Control. 7 (1), 154 (2018).
  23. Minbiole, K. P. C., et al. From antimicrobial activity to mechanism of resistance: The multifaceted role of simple quaternary ammonium compounds in bacterial eradication. Tetrahedron. 72 (25), 3559-3566 (2016).
  24. Mangalappalli-Illathu, A. K., Korber, D. R. Adaptive resistance and differential protein expression of Salmonella enterica serovar enteritidis biofilms exposed to benzalkonium chloride. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3588-3596 (2006).
  25. El-Banna, T., Abd El-Aziz, A., Sonbol, F., El-Ekhnawy, E. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates to benzalkonium chloride retards its growth and enhances biofilm production. Molecular Biology Reports. 46, 3437-3443 (2019).
  26. Ebrahimi, A., et al. Effects of benzalkonium Chloride on planktonic growth and biofilm formation by animal bacterial pathogens. Jundishapur Journal of Microbiology. 8 (2), 59764 (2015).
  27. Reśliński, A., et al. Evaluation of Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilm formation on the surface of polypropylene mesh. Medycyna doświadczalna i mikrobiologia. 63 (1), 21-27 (2011).
  28. Verhorstert, K. W. J., et al. In vitro bacterial adhesion and biofilm formation on fully absorbable poly-4-hydroxybutyrate and nonabsorbable polypropylene pelvic floor implants. Cite This: ACS Applied Materials & Interfaces. 12, 53646-53653 (2020).
  29. Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration & Biodegradation. 64 (6), (2010).
  30. Jones, J. F., et al. Oriented adhesion of Escherichia coli to polystyrene particles. Applied and Environmental Microbiology. 69 (11), 6515-6519 (2003).
  31. Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
  32. Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration and Biodegradation. 64 (6), 530-536 (2010).
  33. Dieterich, M., et al. Implant-Based Breast Reconstruction Using a Titanium-Coated Polypropylene Mesh (TiLOOP Bra). Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 8-19 (2013).
  34. Clavé, A., et al. Polypropylene as a reinforcement in pelvic surgery is not inert: comparative analysis of 100 explants. International Urogynecology Journal. 21 (3), 261-270 (2010).
  35. Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
  36. Chen, R., Liu, X., Han, L., Zhang, Z., Li, Y. Morphology, thermal behavior, rheological, and mechanical properties of polypropylene/polystyrene blends based on elongation flow. Polymers for Advanced Technologies. 31 (11), 2722-2732 (2020).
  37. Vial Loading Trays Polystyrene vs. polypropylene: Which tubes are best for your research. ChemTech International Available from: https://chemtech-us.com/polystyrene-vs-polypropylene-which-tubes-are-best-for-your-research/ (2020)
  38. Bock, L. J., Hind, C. K., Sutton, J. M., Wand, M. E. Growth media and assay plate material can impact on the effectiveness of cationic biocides and antibiotics against different bacterial species. Letters in Applied Microbiology. 66 (5), 368-377 (2018).
  39. . Crystal violet Available from: https://omic.org/spectra/PhotochemCAD/html/048.html (2017)

Tags

Bacterial BiofilmBiofilm BiomassPCR-plate Deep Well MicroplatePeg Lid Biofilm DeviceCrystal Violet StainingAntimicrobial Susceptibility TestingMinimum Biofilm Eradication Concentration (MBEC)

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Doucet, A. N., Slipski, C. J., Golding, G. R., Mulvey, M. R., Bay, D. C. Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices. J. Vis. Exp. (182), e63069, doi:10.3791/63069 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image